E-cadherin參與IL-24抑制肺癌細胞增殖和侵襲遷移的實驗研究

宋秀婧 楊鐵波 王明暉 劉仁龍 顧少巖 張 堯

(齊齊哈爾市第一醫院呼吸內一科，齊齊哈爾 161000)

肺癌屬于呼吸系統惡性腫瘤，其發生機制十分復雜，不僅與環境等外界因素有關，還與細胞內基因的表達調控有關[1]。IL-24是IL-10細胞因子家族成員之一，人體黑素細胞、脾細胞、胸腺細胞等都可以表達IL-24[2]。最近的研究報告顯示，IL-24參與腫瘤的進展，過量的IL-24可以抑制腫瘤的生長，并且對于正常細胞生長沒有影響[3]。在肺癌中的研究報道顯示，IL-24轉染后的肺癌細胞凋亡增多，細胞生長受到抑制，而對于正常的支氣管上皮細胞沒有影響，說明IL-24發揮誘導肺癌細胞凋亡和抑制肺癌細胞生長的作用[4]。還有研究報道表明，IL-24還可以抑制卵巢癌、宮頸癌等腫瘤細胞的侵襲和遷移，并且可以上調腫瘤細胞中E-cadherin表達水平，IL-24抗腫瘤轉移的作用可能與E-cadherin有關[5,6]。目前對于IL-24對肺癌細胞侵襲和遷移的影響和機制尚不明確。本實驗以明確IL-24對肺癌細胞侵襲和遷移的影響和機制為目的，以肺癌細胞A549作為體外實驗對象，以期為闡明IL-24抗肺癌作用機制提供參考。

1 材料與方法

1.1材料 肺癌細胞A549購自武漢普諾賽生命科技有限公司；pcDNA3.1-IL-24、pcDNA3.1購自北京合生基因科技有限公司；IL-24抗體、MMP-9抗體購自美國Abcam；cDNA合成試劑盒購自美國BIOMIGA；E-cadherin shRNA和shRNA陰性對照購自上海吉瑪制藥技術有限公司；MMP-2、E-cadherin、Ki-67抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen。

1.2方法

1.2.1pcDNA3.1-IL-24轉染和過表達效果檢測 肺癌細胞中分別轉染對照載體pcDNA3.1和IL-24過表達載體pcDNA3.1-IL-24，記為pcDNA3.1、pcDNA3.1-IL-24，設置不轉染載體的肺癌細胞為對照組。轉染試劑為Lipofectamine 2000，步驟同轉染試劑說明。細胞轉染后2 d，用Real time PCR和Western blot方法測定過表達效果。

1.2.1.1Real time PCR 每組取106個細胞，分別添加800 μl的TRIZOL試劑提取RNA，最后添加DEPC水將RNA溶解，以紫外分光光度計測定A260nm和A280nm比值在1.8～2.0之間。常規方法合成cDNA，步驟同cDNA合成試劑盒，逆轉錄條件為：42℃孵育30 min，85℃孵育10 min。取cDNA，進行PCR反應，PCR包括：0.08 μl的上下游引物(20 μmol/L)、2 μl的cDNA模板、0.4 μl的TaqDNA聚合酶、10 μl的2×定量PCR Master Mix，最后添加ddH2O，共20 μl，PCR反應條件為：95℃孵育3 min ；95℃孵育12 s，62℃孵育40 s，40個循環。以2-ΔΔCt方法計算IL-24表達水平。β-actin引物：F-5′-GGGACCTGACTGACTACCTC-3′，R-5′-TCATAC-TCCTGCTTGCTGAT-3′。IL-24引物：F-5′-AATAGG-GCTAGCGCCACCATGAATTTTCAACAGAGGCT-3′，R-5′-GAATTCGGTCTCCTCGAGGAGCTTGTAGAATTTCT-GCA-3′。

1.2.1.2Western blot 在細胞中添加裂解溶液，置于冰上孵育40 min，轉移至離心管中，4℃，12 000 g離心10 min，吸取蛋白溶液(上清)，常規BCA方法測定各組蛋白濃度，再添加Loading Buffer煮沸5 min。SDS-PAGE凝膠電泳時每個孔內的蛋白樣品量為30 μg，50 V電壓條件下觀察藍色條帶已經進入到分離膠及濃縮膠的分界處時，將電壓調整到120 V，觀察藍色條帶已經跑出分離膠時，停止電泳。設置300 mA電流轉膜，把蛋白轉移到PVDF膜上，轉膜時間共100 min。取出PVDF膜，置于含5%牛血清白蛋白封閉液的平皿內反應2 h后，把PVDF膜再放置于抗體孵育袋中，添加IL-24一抗孵育液，封口后，置于4℃環境中過夜，按照同樣的方法與二抗在室溫中孵育2 h后，ECL發光，以Vision Workers LS分析條帶的光密度值，內參設置為β-actin。

1.2.2MTT測定IL-24對肺癌細胞增殖影響 按照Control、pcDNA3.1、pcDNA3.1-IL-24分組方法將肺癌細胞接種到96孔板中，繼續培養48 h。將培養板取出后，分別用移液槍在每個孔內添加10 μl的MTT，置于37℃中培養4 h。將培養板取出后，將孔內的液體吸棄，每孔加150 μl的DMSO，反應10 min后，置于酶標儀上測定490 nm的A值。

1.2.3Transwell小室測定IL-24對肺癌細胞侵襲和遷移影響 用含有1%胎牛血清的細胞培養液把Control、pcDNA3.1、pcDNA3.1-IL-24細胞均配制成每毫升含有105個的單細胞懸浮液，每組吸取200 μl 添加到Transwell小室的上室，同時吸取600 μl 含血清的細胞培養液至下室內，培養2 d 以后，將小室取出，取棉簽將聚碳酸酯膜表面的細胞清除掉，添加PBS將膜洗滌2次，晾干，添加甲醛固定，結晶紫染色，在400倍光學顯微鏡下計數細胞遷移數目。細胞侵襲實驗同上，侵襲實驗前用1∶6稀釋的基質膠把Transwell小室濕化。

1.2.4Western blot檢測IL-24對肺癌細胞中E-cadherin、MMP-2、MMP-9和Ki-67蛋白表達影響 取Control、pcDNA3.1、pcDNA3.1-IL-24細胞培養2 d 以后，按照Western blot方法檢測細胞中E-cadherin、MMP-2、MMP-9和Ki-67蛋白表達變化，步驟同1.2.1.2。

1.2.5E-cadherin shRNA和pcDNA3.1-IL-24共轉染對肺癌細胞增殖、侵襲遷移影響 在肺癌細胞中共轉染E-cadherin shRNA和pcDNA3.1-IL-24，同時共轉染shRNA陰性對照和pcDNA3.1-IL-24，分別設置為pcDNA3.1-IL-24+shRNA-E-cadherin和pcDNA 3.1-IL-24+shRNA-NC。按照上述MTT、Transwell小室和Western blot檢測細胞增殖、侵襲遷移和E-cadherin、MMP-2、MMP-9、Ki-67蛋白表達變化。

2 結果

2.1pcDNA3.1-IL-24提高肺癌細胞中IL-24表達水平 在肺癌細胞中轉染pcDNA3.1-IL-24，細胞中IL-24 mRNA和蛋白水平均升高。pcDNA3.1-IL-24提高肺癌細胞中IL-24的表達。見圖1和表1。

2.2過表達IL-24抑制肺癌細胞增殖、侵襲和遷移 在肺癌細胞中轉染pcDNA3.1-IL-24，細胞A490、侵襲數目、遷移數目及侵襲遷移蛋白MMP-9、MMP-2、增殖蛋白Ki-67表達水平均降低。過表達IL-24抑制肺癌細胞增殖、侵襲和遷移。見圖2和表2。

2.3過表達IL-24上調肺癌細胞中E-cadherin蛋白表達 在肺癌細胞中轉染pcDNA3.1-IL-24，細胞中E-cadherin蛋白表達水平升高。過表達IL-24上調肺癌細胞中E-cadherin蛋白表達水平。見圖3和表3。

2.4E-cadherin shRNA逆轉過表達IL-24抗肺癌細胞增殖侵襲和遷移作用 在肺癌細胞中共轉染pcDNA3.1-IL-24和IL-24 shRNA，細胞侵襲遷移數目和A490均高于共轉染pcDNA3.1-IL-24和shRNA陰性對照的肺癌細胞。見表4。E-cadherin shRNA逆轉過表達IL-24抗肺癌細胞增殖侵襲和遷移作用。

圖1 Western blot檢測pcDNA3.1-IL-24轉染后肺癌細胞中IL-24蛋白表達水平Fig.1 Western blot detection of IL-24 protein expression level in lung cancer cells transfectad with pcDNA3.1-IL-24Note: 1.Control；2.pcDNA3.1；3.pcDNA3.1-IL-24.

GroupsIL-24mRNAIL-24proteinControl1.00±0.090.23±0.04pcDNA3.11.01±0.130.22±0.06pcDNA3.1-IL-242.35±0.241)0.43±0.05F65.70616.403P0.0000.004

Note：Compared with pcDNA3.1，1)P<0.05.

2.5E-cadherin shRNA逆轉過表達IL-24抗肺癌細胞中MMP-2、MMP-9和Ki-67蛋白表達作用 在肺癌細胞中共轉染pcDNA3.1-IL-24和IL-24 shRNA，細胞中MMP-2、MMP-9和Ki-67蛋白水平升高，E-cadherin蛋白水平降低，與共轉染pcDNA3.1-IL-24和shRNA陰性對照的肺癌細胞比較，差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖4和表5。E-cadherin shRNA逆轉過表達IL-24抗肺癌細胞中MMP-2、MMP-9和Ki-67蛋白表達作用。

圖2 Western blot檢測pcDNA3.1-IL-24轉染后肺癌細胞中MMP-9、MMP-2和Ki-67蛋白表達水平Fig.2 Western blot detection of MMP-9,MMP-2 and Ki-67 protein expression levels in lung cancer cells transfected with pcDNA3.1-IL-24Note: 1.Control；2.pcDNA3.1；3.pcDNA3.1-IL-24.

GroupsE-cadherinControl0.13±0.02pcDNA3.10.14±0.04pcDNA3.1-IL-240.25±0.031)F13.759P0.006

Note：Compared pcDNA3.1，1)P<0.05.

GroupsA490NumberofinvasionNumberofmigrationMMP-9MMP-2Ki-67Control0.45±0.0568.54±8.35135.64±12.080.67±0.080.64±0.060.53±0.05pcDNA3.10.44±0.0367.12±7.69133.80±10.650.70±0.060.65±0.040.54±0.03pcDNA3.1-IL-240.26±0.031)31.46±3.271)73.41±6.971)0.28±0.041)0.19±0.021)0.22±0.031)F23.93028.46936.64642.595110.94669.279P0.0010.0010.0000.0000.0000.000

Note：Compared with pcDNA3.1，1)P<0.05.

GroupsA490NumberofinvasionNumberofmigrationpcDNA3.1-IL-24+shRNA-NC0.27±0.0234.81±5.1670.98±8.12pcDNA3.1-IL-24+shRNA-E-cadherin0.38±0.031)54.16±4.781)98.63±7.551)t5.2844.7654.319P0.0060.0090.013

Note：Compared with pcDNA3.1-IL-24+shRNA-NC，1)P<0.05.

GroupsE-cadherinMMP-9MMP-2Ki-67pcDNA3.1-IL-24+shRNA-NC0.29±0.050.24±0.060.21±0.030.21±0.05pcDNA3.1-IL-24+shRNA-E-cadherin0.16±0.021)0.56±0.051)0.35±0.041)0.34±0.051)t4.1817.0974.8503.184P0.0140.0020.0080.033

Note：Compared with pcDNA3.1-IL-24+shRNA-NC，1)P<0.05.

圖3 Western blot檢測pcDNA3.1-IL-24轉染后肺癌細胞中E-cadherin蛋白表達水平Fig.3 Western blot detection of E-cadherin protein expression in lung cancer cells after transfection with pcDNA3.1-IL-24Note: 1.Control；2.pcDNA3.1；3.pcDNA3.1-IL-24.

圖4 Western blot檢測 pcDNA3.1-IL-24和E-cadherin shRNA共轉染后肺癌細胞中E-cadherin、MMP-2、MMP-9和Ki-67蛋白表達水平Fig.4 Western blot detection of E-cadherin,MMP-2,MMP-9 and Ki-67 protein expression levels in lung cancer cells co-transfected with pcDNA3.1-IL-24 and E-cadherin shRNANote: 1.pcDNA3.1-IL-24+shRNA-NC;2.pcDNA3.1-IL-24+shRNA-E-cadherin.

3 討論

IL-24是新發現的腫瘤抑制基因，其是在黑色素瘤細胞中發現的，后續人們根據其染色體定位、細胞因子樣特性等方面綜合考慮將其歸于IL-10家族，其可以高效且具有選擇性地發揮抗腫瘤作用，具有調節免疫系統等功效[7-9]。很多研究報道顯示，在腫瘤細胞中轉染IL-24可以誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞生長侵襲和遷移，IL-24是一個具有潛力的腫瘤抑制因子[10]。目前在宮頸癌細胞中的研究報道表明，IL-24可以在體外抑制宮頸癌細胞的侵襲和遷移，在黑色素瘤細胞中也發現IL-24具有抗腫瘤侵襲的作用[11,12]。在肺癌細胞中已經驗證發現轉染IL-24可以抑制肺癌細胞的生長并誘導細胞凋亡發生，說明IL-24在肺癌中可能也發揮抑制作用[13]。本次實驗在肺癌細胞中轉染IL-24，發現過表達IL-24后的肺癌細胞增殖、侵襲和遷移能力均降低，這提示，IL-24具有抗肺癌細胞增殖侵襲和遷移的作用，說明IL-24是一個肺癌發生和轉移抑制因子，對于其在其他各株肺癌細胞和肺癌體內轉移中的作用尚不清楚，還需要在以后的實驗中進行驗證。

腫瘤細胞的增殖、侵襲及遷移等均受到細胞內多種基因的調控作用，目前已知Ki-67是細胞增殖活性的標志蛋白，其表達水平越高表明細胞增殖能力越強，反之其表達水平降低后標志著細胞增殖能力下降[14]。腫瘤細胞從原來的位置脫落經過血管或淋巴管進入到遠端組織惡性增殖形成轉移灶的過程需要細胞外基質降解酶的作用，腫瘤細胞合成細胞外基質降解酶是腫瘤細胞轉移和侵襲的基礎[15,16]。MMP-2和MMP-9是基質金屬蛋白酶家族，而基質金屬蛋白酶是細胞外基質降解的主要原因，MMP-2和MMP-9也是目前發現與腫瘤轉移關系最為密切的蛋白酶[17,18]。本次實驗發現過表達IL-24后的肺癌細胞中MMP-9、MMP-2和Ki-67蛋白水平均降低，說明IL-24具有抗肺癌細胞侵襲遷移和增殖的作用，這與檢測細胞增殖、侵襲和遷移結果一致。

目前對于IL-24抗腫瘤機制研究尚不明確，在肝細胞癌細胞中的研究發現，IL-24高表達后的肝癌細胞中E-cadherin蛋白表達水平升高，后續在宮頸癌等腫瘤中也證實IL-24可以提高E-cadherin蛋白表達水平，IL-24作用機制可能與E-cadherin有關[19，20]。本實驗證實，過表達IL-24后的肺癌細胞中E-cadherin蛋白表達水平升高，并且下調E-cadherin可以逆轉過表達IL-24對肺癌細胞增殖侵襲和遷移的作用，這提示IL-24通過上調E-cadherin的表達抑制肺癌細胞增殖、侵襲和遷移。

總而言之，IL-24具有體外抗肺癌細胞增殖、侵襲和遷移的作用，其作用機制與上調E-cadherin有關，這為研究IL-24的抗腫瘤機制提供了參考，在肺癌細胞中表達外源性的IL-24可能是治療肺癌的潛在途徑。