病毒性肝炎患者外周血T細(xì)胞亞群與病毒載量、胃蛋白酶原水平及胃黏膜病變程度的相關(guān)研究①

朱 翔 韓凌飛 楊 燕 魏 澄 賀 松 劉建民 (安徽省馬鞍山市臨床檢驗中心，馬鞍山 243000)

乙型病毒性肝炎(簡稱乙肝)是由乙肝病毒(hepatitis B Virus,HBV)感染引起的一種感染性肝臟疾病，該疾病在全球廣泛分布，我國是乙肝大國，HBsAg流行率約為6.1%，約有3 000萬慢性乙型肝炎患者[1]。肝臟為人體重要免疫器官，機(jī)體的免疫狀態(tài)對HBV的清除及機(jī)體的病變程度起決定性作用：HBV通過免疫反應(yīng)間接損傷肝細(xì)胞，隨著病情進(jìn)展，可發(fā)展成肝硬化，造成嚴(yán)重肝功能損害和門脈高壓，甚至癌變。T淋巴細(xì)胞亞群是反映機(jī)體免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)，根據(jù)分化抗原的表達(dá)，臨床一般以CD3+CD4+輔助/誘導(dǎo)性T 細(xì)胞和CD3+CD8+抑制性/細(xì)胞毒T細(xì)胞的比例來衡量機(jī)體的免疫平衡狀態(tài)。肝臟還是消化道外最大的消化腺體，臨床研究表明[2]：HBV的感染除了影響肝臟功能外，還會影響機(jī)體消化功能、胃的分泌功能，導(dǎo)致胃黏膜病變。胃蛋白酶原(pepsinogen,PG)是胃蛋白酶的前體，包括PGⅠ和PGⅡ兩個亞群，有1%的PG會經(jīng)過毛細(xì)血管進(jìn)入外周血，外周血PG的水平及比值能反映胃黏膜病變程度[3]。本研究試圖探討乙肝、乙肝性肝硬化患者的T細(xì)胞亞群分布與HBV載量、PG水平和胃黏膜病變程度之間的關(guān)系，旨在為乙肝患者及胃部病變的臨床研究提供理論參考價值。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1基本資料 以市人民醫(yī)院和傳染病院于2016年12月至2018年12月期間收治的136例慢性乙型肝炎患者為乙肝組，納入84例乙型肝炎型肝硬化患者為肝硬化組，并納入50例無HBV感染的健康志愿者為對照組。其中乙肝組男性89例，女性47例；年齡30～70歲，平均(45.15±10.76)歲。肝硬化組男性62例，女性22例；年齡35～74歲，平均年齡(48.12±7.61)歲。對照組男性36例，女性14例；年齡32～75歲，平均年齡(46.28±9.36)歲。三組患者的性別(χ2=1.920,P=0.382)、年齡(F=2.440,P=0.089)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①乙肝組和肝硬化組患者符合《慢性乙型肝炎防治指南》[4]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，確診為乙肝/肝硬化；②乙肝組患者血清HBV DNA 超過2×104U/ml，血清ALT值超過正常人群上限的兩倍(正常范圍：0～40 U/L)；③乙肝組和肝硬化組HBsAg陽性超過6個月；④肝硬化組患者病因為HBV感染；⑤所有患者檢測前未進(jìn)行過抗病毒治療；⑥患者及家屬均簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①排除酒精性肝病、藥物性肝病引起的肝損傷患者；②排除患者自身免疫性肝炎患者；③排除合并患者惡性腫瘤患者；④排除有吸毒史或毒品接觸患者；⑤排除合并伴有免疫缺陷類疾病的患者；⑥排除合并感染其他類型肝炎病毒患者；⑦排除既往有胃潰瘍等胃部疾病史的患者。

1.1.2材料與儀器 PCR檢測采用安普利9800型RT-PCR檢測系統(tǒng)，所用試劑由廈門安普利生物工程有限公司提供；血清PG檢測試劑盒由蘇蘭必歐瀚提供；流式細(xì)胞儀為FACSCalibur；相關(guān)試劑由BD公司提供；胃鏡為OLYMPUS電子纖維胃鏡。

1.2方法

1.2.1血清HBV-DNA 載量 患者治療前清晨空腹抽取外周靜脈血5 ml，平均分為兩份，其中一份3 000 r/min離心取上清，測定患者血清HBV-DNA載量。所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。最終將血清HBV-DNA 載量進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行比較。

1.2.2血清PG測定 取1.2.1中血清，采用ELISA法檢測血清PGⅠ和PGⅡ并計算兩者的比值，正常參考范圍：PGⅠ：70～165 μg/L，PGⅡ：3～15 μg/L，PGⅠ/PGⅡ：7～20，所有操作按照說明書嚴(yán)格執(zhí)行。

1.2.3外周血T細(xì)胞亞群測定 另一份外周靜脈血加入EDTA抗凝管。采用溶血素法人工去除紅細(xì)胞，檢測CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞百分比，并計算CD4+/CD8+，所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.2.4胃黏膜檢測 所有患者上午空腹8 h進(jìn)行胃鏡檢查，檢測胃黏膜，對于胃壁黏膜發(fā)生嚴(yán)重潰爛者取胃黏膜活體標(biāo)本進(jìn)行進(jìn)一步組織學(xué)檢測。

2 結(jié)果

2.1HBV病毒載量比較 對照組未檢測到HBV DNA，肝硬化組HBV DNA載量顯著高于乙肝組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2血清PG水平比較 三組PGⅠ、PGⅡ和PGⅠ/PGⅡ差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；肝硬化組PGⅠ、PGⅠ/PGⅡ顯著低于乙肝組，乙肝組顯著低于對照組；肝硬化組PGⅡ顯著高于乙肝組，乙肝組顯著高于對照組。見表2。

2.3胃黏膜檢測結(jié)果 對照組、乙肝組和肝硬化組胃黏膜病變程度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，對照組正常和淺表性胃炎比例為76.0%，乙肝組正常和淺表性胃炎比例為41.17%，肝硬化組正常和淺表性胃炎比例為19.05%；萎縮性胃炎比例：肝硬化組>乙肝組>對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；詳見表3。

2.4外周血T細(xì)胞亞群 三組患者CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且對照組>乙肝組>肝硬化組，組間兩兩比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；詳見表4。

GroupsnHBVDNAload(log10U/ml)Controlgroup500Hepatitisgroup1365.24±1.31Cirrhosisgroup845.83±1.47t3.096P0.002

GroupsnPGⅠ(μg/L)PGⅡ(μg/L)PGⅠ/PGⅡControlgroup50136.29±20.571)2)8.19±2.351)2)15.27±3.061)2)Hepatitisgroup136119.63±35.413)11.18±4.113)10.32±2.843)Cirrhosisgroup8495.79±30.2613.25±6.247.91±2.25F29.053818.5366123.251P<0.001<0.001<0.001

Note：Comparison between control group and hepatitis B group,1)P<0.05;comparison between control group and cirrhosis group,2)P<0.05;comparison between hepatitis B group and cirrhosis group,3)P<0.05.

表3 胃黏膜病變程度比較
Tab.3 Comparison of gastric mucosal lesions degree

GroupsnNormalmucoseSuperficialgastritisAtrophicgastritisMildModerateSevereControlgroup506(12.00)32(64.00)7(14.00)3(6.00)2(4.00)Hepatitisgroup13615(11.02)41(30.15)54(39.71)18(13.24)8(5.88)Cirrhosisgroup840(0.00)16(19.05)30(35.71)23(27.38)15(17.86)χ256.961P<0.001

Note：Pairwise comparison by rank sum test between the two groups showed thatP<0.05.

表4 外周血T細(xì)胞亞群比較
Tab.4 Comparison of T lymphocyte subsets in peripheral blood

GroupsnCD3+(%)CD4+(%)CD8+(%)CD4+/CD8+Controlgroup5067.56±5.811)2)49.62±8.811)2)32.04±5.231)2)1.59±0.471)2)Hepatitisgroup13664.37±7.433)44.65±7.363)31.57±6.483)1.38±0.353)Cirrhosisgroup8461.46±8.0237.66±9.1128.98±7.761.29±0.33F7.96336.4404.83710.465P<0.001<0.0010.006<0.001

Note：Comparison between control group and hepatitis B group，1)P<0.05;comparison between control group and cirrhosis group，2)P<0.05;comparison between hepatitis B group and cirrhosis group，3)P<0.05.

表5 T細(xì)胞亞群與HBV DNA載量、血清PG和胃黏膜病變程度的相關(guān)性分析
Tab.5 Correlation analysis of T cell subsets with HBV DNA load,serum PG and gastric mucosal lesions

IndexHBVDNAloadrPPGⅠrPPGⅡrPPGⅠ/PGⅡrPGastricmucosallesionsrPCD3+(%)-0.0540.3770.0150.8130.0210.7310.0660.279-0.0110.857CD4+(%)-0.0960.1150.0220.7190.0160.7940.0540.377-0.0410.502CD8+(%)0.0750.219-0.0310.612-0.0250.683-0.0690.259-0.0480.432CD4+/CD8+-0.4750.0000.1180.052-0.1050.0850.2960.000-0.3150.000

2.5相關(guān)性分析 分別采用Pearson、Spearman相關(guān)性分析外周血T細(xì)胞亞群與HBV DNA載量、血清PGⅠ、PGⅡ、PGⅠ/PGⅡ以及胃黏膜病變程度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD3+、CD4+、CD8+與HBV DNA載量、血清PGⅠ、PGⅡ、PGⅠ/PGⅡ以及胃黏膜病變程度無顯著相關(guān)性(P<0.05)；而CD4+/CD8+與HBV DNA載量、胃黏膜病變程度呈負(fù)相關(guān)性(P<0.05)，與PGⅠ、PGⅡ無顯著相關(guān)性(P>0.05)，與PGⅠ/PGⅡ呈正相關(guān)性(P<0.05)；詳見表5。

3 討論

HBV是一種正嗜肝DNA病毒，能在人體的肝細(xì)胞內(nèi)繁殖，對肝細(xì)胞具有高度親和性。全世界HBV攜帶者超過3.5億人，我國的HBV攜帶者約1.2億，HBV感染導(dǎo)致的慢性乙型肝炎至今仍是侵害人類健康的主要疾病之一[5]。我國是乙肝高負(fù)擔(dān)國家，隨著HBV感染、病情的進(jìn)展和肝功能的損害，5年內(nèi)有10%～20%的乙肝患者可發(fā)展成肝硬化，其中又有6%～15%的患者可能進(jìn)一步發(fā)展成肝癌[6]。乙肝的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，但目前認(rèn)為病毒感染后患者的免疫功能紊亂是導(dǎo)致乙肝發(fā)生和病情進(jìn)展的重要原因。

乙肝的發(fā)病機(jī)制主要是免疫系統(tǒng)對HBV的清除作用引發(fā)的肝細(xì)胞病理改變，其中以細(xì)胞免疫為主導(dǎo)：HBV在感染人體后，未被單核巨噬細(xì)胞及時清除的殘余病毒會在肝臟中復(fù)制，引起肝細(xì)胞的細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)[7]。因而病毒載量、被感染的細(xì)胞數(shù)量以及體內(nèi)的病毒清除作用的平衡是決定患者肝臟損傷嚴(yán)重程度的主要原因。本研究發(fā)現(xiàn)肝硬化組HBV DNA載量顯著高于乙肝組，這與以往報道基本一致[8]。T細(xì)胞是主導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞亞群又是反映細(xì)胞免疫平衡的重要指標(biāo)。CD3+是所有成熟的T細(xì)胞總和，代表的是機(jī)體整體的免疫功能，CD3+T淋巴細(xì)胞根據(jù)其功能和表面標(biāo)志物可以分為細(xì)胞毒性T細(xì)胞(表面標(biāo)志物為CD8+)和輔助性T細(xì)胞(表現(xiàn)標(biāo)志物為CD4+)。其中CD4+參與抗原識別和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，其主要作用是促進(jìn)B淋巴細(xì)胞、CD8+毒性細(xì)胞和多種免疫細(xì)胞的增殖分化，對機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫均具有重要調(diào)節(jié)作用[9]。CD8+T細(xì)胞能殺滅產(chǎn)生特殊抗原的目標(biāo)細(xì)胞，通過分泌性膜溶解途徑或泛素凋亡途徑清除HBV，其含量是決定HBV清除的關(guān)鍵因素[10]，CD4+/CD8+則是反映機(jī)體的免疫平衡狀態(tài)的指標(biāo)，一般認(rèn)為二者比值下降表明機(jī)體免疫功能變?nèi)鮗11]。本研究發(fā)現(xiàn)隨著病情加重，外周血中的CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+均顯著下降，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)CD4+/CD8+與HBV DNA載量呈負(fù)相關(guān)性，認(rèn)為T淋巴細(xì)胞含量及CD4+/CD8+下降主要是由于輔助性T細(xì)胞功能受到抑制，CD4+和CD8+含量下降，導(dǎo)致HBV病毒無法及時清除，引發(fā)肝細(xì)胞損傷，胡亞南等[12]發(fā)現(xiàn)乙肝患者外周血Th17/Treg比例失衡，與本研究有相似之處，這進(jìn)一步證實了乙肝和肝硬化患者存在免疫平衡紊亂。

HBV是一種泛嗜性病毒，除了肝臟外，同時也存在于許多肝外臟器組織中，研究報道HBV感染與非肝細(xì)胞癌有顯著的非特異性關(guān)聯(lián)[13]。胃黏膜病變是常見的肝外表現(xiàn)之一。HBV可能參與了乙肝患者的胃黏膜損傷，這主要是由HBV本身對胃黏膜的損傷作用和病毒清除過程中CD8+細(xì)胞對胃黏膜細(xì)胞的損傷作用引起的[14]。臨床已經(jīng)發(fā)現(xiàn)肝硬化患者多伴有門脈高壓性胃病，是一種特殊的胃黏膜病變[15]。陳軼等[16]報道慢性乙肝、肝硬化、肝癌的胃黏膜病變發(fā)生率均在90%以上，且發(fā)現(xiàn)HBV是影響乙肝患者胃黏膜炎癥嚴(yán)重程度的關(guān)鍵因素。 PGⅠ主要由胃底的主細(xì)胞和頸黏液細(xì)胞分泌，PGⅡ可由多種胃黏膜細(xì)胞分泌(包括主細(xì)胞、頸黏液細(xì)胞、幽門、賁門以及十二指腸等)，兩者的含量和比值常作為胃黏膜分泌功能的反映指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)乙肝組和肝硬化組PGⅠ、PGⅠ/PGⅡ顯著降低，但PGⅡ維持在一個較高水平。胃鏡下結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著病情加重，胃黏膜正常和淺表性胃炎比例下降，萎縮性胃炎的比例升高，且嚴(yán)重程度增加。周曉蕾等[17]發(fā)現(xiàn)肝硬化患者血清PGⅠ水平與Child-Paugh分級存在一定的關(guān)聯(lián)系。分析認(rèn)為，HBV在感染胃腸道后，胃竇、胃底是多發(fā)部位，在胃黏膜損傷早期，持續(xù)的炎癥反應(yīng)主要損傷胃底的主細(xì)胞，導(dǎo)致PGⅠ下降，隨著炎癥反應(yīng)加重，胃黏膜通透性增加，更多的PGⅡ進(jìn)入外周血循環(huán)，導(dǎo)致兩者比值下降，此時胃鏡下表現(xiàn)為黏膜呈花斑樣病變；當(dāng)胃黏膜持續(xù)損傷發(fā)展成為萎縮性胃炎時，胃黏膜上皮和腺體萎縮，數(shù)量明顯減少，PGⅠ含量進(jìn)一步下降，而PGⅡ可由多種腺體分泌仍然保持在一個較高水平，兩者比值進(jìn)一步下降，此時胃鏡下主要表現(xiàn)為充血、水腫和糜爛[18]。

機(jī)體的免疫平衡狀態(tài)是決定HBV病毒載量、乙肝進(jìn)程的關(guān)鍵因素，那么其是否與乙肝人群的胃黏膜病變相關(guān)？本研究進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+雖然與血清PG水平和胃黏膜病變無顯著相關(guān)性，但CD4+/CD8+與血清PGⅠ/PGⅡ呈正相關(guān)性，與胃黏膜病變炎癥程度呈負(fù)相關(guān)性。劉躍平等[19]在慢性萎縮性胃炎中發(fā)現(xiàn)隨著胃黏膜病變級別加重，CD4+/CD8+下降，認(rèn)為隨著機(jī)體的免疫功能降低，胃黏膜病變加重；與楊善峰等[20]發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌陰性的疣狀胃炎患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群的比例可以間接反映胃黏膜病變狀況。認(rèn)為當(dāng)乙肝患者的CD4+/CD8+比值下降時，代表機(jī)體的免疫平衡狀態(tài)趨向于免疫抑制狀態(tài)，這不利于HBV DNA清除，逃逸的HBV對胃黏膜產(chǎn)生損傷，導(dǎo)致血清PGⅠ/PGⅡ水平下降，提示免疫功能是決定乙肝患者病情以及胃黏膜損傷的關(guān)鍵因素。