類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血單核細(xì)胞miR-24、miR-132表達(dá)及臨床意義①

蘇顯都 林明利 符步遠(yuǎn) 黎 明 (儋州市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，儋州 571799)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性全身性自身免疫性疾病，大多數(shù)患者出現(xiàn)不同程度的功能受損和關(guān)節(jié)畸形，嚴(yán)重影響RA患者的生活質(zhì)量[1]。有研究證實(shí)，微小核糖核酸(microRNA，miRNA)在免疫細(xì)胞成熟的各個(gè)階段及免疫穩(wěn)態(tài)維持方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，與自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2，3]。近期的研究發(fā)現(xiàn)，miR-24、miR-132在自身免疫疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要的作用[4，5]。本研究通過檢測(cè)miR-24、miR-132在RA患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(periph-eral blood mononuclear cell,PBMC)中的表達(dá)水平，分析miR-24、miR-132對(duì)RA的診斷價(jià)值，旨在為RA的診斷及靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1臨床資料 收集2015年1月～2017年10月儋州市人民醫(yī)院及中南大學(xué)湘雅醫(yī)院收治的RA患者160例，其中男性38例，女性122例，年齡18～75歲，平均(47.63±11.35)歲。RA診斷符合2009年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR)和歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟(EULAR)提出的RA分類標(biāo)準(zhǔn)。選擇65例骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)作為OA組，其中男性16例，女性49例，年齡19～74歲，平均(47.42±11.16)歲。另選取同期體檢65名健康者作為對(duì)照組，其中男性17例，女性48例，年齡20～72歲，平均(46.85±10.62)歲。選取的研究對(duì)象均排除合并其他自身免疫性疾病、感染、惡性腫瘤和重要器官系統(tǒng)疾病。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并與患者簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1分組方法 按照28個(gè)關(guān)節(jié)疾病活動(dòng)性評(píng)分(28 disease activity scores,DAS28)來(lái)監(jiān)測(cè)RA患者的疾病活動(dòng)度，采用DAS28-ESR，其中2.6

1.2.2PBMC分離及總RNA提取 抽取外周血4 ml 于肝素鈉抗凝管中，3 000 r/min離心5 min，去除上層血漿，加入等體積 PBS稀釋血液，在離心管中加入淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)沿傾斜的管壁緩緩加入稀釋的外周血，1 500 r/min離心30 min，用吸管吸取白色層(PBMC)細(xì)胞置于新的1.5 ml EP管中，12 000 r/min離心5 min，棄上清，加入1 ml提取劑(Trizol)，于-70℃保存。從-70℃冰箱取出上述保存在EP管的細(xì)胞，按照總RNA快速提取試劑盒說明書從中提取總RNA。

1.2.3引物設(shè)計(jì)與合成 miR-24正向引物：5′AAGTCGTATGACTTATCGACGTC3′,反向引物：5′AATCTTGCTACTACACGATCTT3′；miR-132正向引物：5′ACGTCGTGTAGCTTATAAGACTG3′,反向引物：5′ACTGCTTGTTCTACACACTCTG3′。

1.2.4RT-PCR檢測(cè) 在ABI 7500型熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time quantitative polymerase chain react，RT-PCR)，以U6為內(nèi)參照，反應(yīng)條件為：95℃ 30 s預(yù)變性，95℃ 5 s變性，58℃ 30 s退火，72℃ 30 s 延伸，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)標(biāo)本重復(fù)做3個(gè)孔位。反應(yīng)完成后進(jìn)行溶解曲線分析(15 s 95℃，1 min 60℃，15 s 95℃，15 s 60℃)，每個(gè)反應(yīng)體系中熒光信號(hào)達(dá)到所設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即為Ct值，以U6為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算PBMC中miRNA的相對(duì)表達(dá)水平，其中ΔCt=Ct目的基因-CtU6，ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本-ΔCt對(duì)照組標(biāo)本。

2 結(jié)果

2.1各組PBMC中miR-24、miR-132比較 RA組PBMC中miR-24、miR-132表達(dá)水平均明顯高于OA組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而OA組與對(duì)照組PBMC中miR-24、miR-132表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組PBMC中miR-24、miR-132比較
Tab.1 Comparison of miR-24 and miR-132 in PBMC of each group

GroupsnmiR-24miR-132Controlgroup650.86±0.130.96±0.11OAgroup650.91±0.181.07±0.14RAgroup1603.62±0.751)2)2.48±0.231)2)F 10.154 7.510P <0.001 <0.001

Note：Compared with control group,1)P<0.05;compared with OA group,2)P<0.05.

表2 中高活動(dòng)組和低活動(dòng)組PBMC中miR-24及miR-132表達(dá)水平比較
Tab.2 Comparison of expression levels of miR-24 and miR-132 in PBMC between moderate and high activity group and low activity group

GroupsnmiR-24miR-132Lowactivitygroup641.20±0.411.14±0.19Moderate-highactivitygroup965.86±1.153.25±0.42t16.51712.604P<0.001<0.001

表3 骨侵蝕組和非骨侵蝕組PBMC中PBMC中miR-24及miR-132表達(dá)水平比較
Tab.3 Comparison of expression levels of miR-24 and miR-132 in PBMC between bone erosion group and non-bone erosion group

GroupsnmiR-24miR-132Non-boneerosiongroup731.14±0.391.06±0.17Boneerosiongroup876.12±1.243.48±0.46t18.16313.117P<0.001<0.001

表4 miR-24、miR-132及兩項(xiàng)聯(lián)合對(duì)RA的診斷價(jià)值
Tab.4 Diagnostic value of miR-24,miR-132 and two combinations in RA

ItemCriticalvalueAUC(95%CI)PSensitivity(%)Specificity(%)Positivepredictivevalue(%)Negativepredictivevalue(%)PositivelikelihoodratioNegativelikelihoodratiomiR-241.930.782(0.726-0.841)0.00872.476.080.268.53.0170.363miR-1321.650.865(0.804-0.917)<0.00181.485.288.378.65.5000.218Twocombinations0.925(0.863-0.972)<0.00190.285.888.487.56.3520.114

圖1 miR-24及miR-132與Sharp評(píng)分、DAS28評(píng)分的相關(guān)性Fig.1 Correlation of miR-24 and miR-132 with Sharp score and DAS28 score

2.2中高活動(dòng)組和低活動(dòng)組PBMC中miR-24、miR-132表達(dá)水平比較 中高活動(dòng)組PBMC中miR-24、miR-132表達(dá)水平明顯高于低活動(dòng)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

2.3骨侵蝕組和非骨侵蝕組PBMC中miR-24、miR-132表達(dá)水平比較 骨侵蝕組PBMC中miR-24、miR-132表達(dá)水平均明顯高于非骨侵蝕組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表3。

2.4miR-24、miR-132及兩項(xiàng)聯(lián)合對(duì)RA的診斷價(jià)值 miR-24、miR-132診斷RA的臨界值分別為1.93、1.65。兩項(xiàng)聯(lián)合診斷RA的AUC(95%CI)為0.925(0.863～0.972)高于單項(xiàng)miR-24[0.782(0.726～0.841)]及miR-132[0.865(0.804～0.917)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=7.352，4.218，P<0.05)，其敏感度和特異度分別為90.2%和85.8%。見表4。

2.5miR-24、miR-132與Sharp評(píng)分、DAS28評(píng)分的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析顯示，RA患者miR-24與Sharp評(píng)分、DAS28評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.294、0.286，P<0.05)，miR-132與Sharp評(píng)分、DAS28評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.418、0.401，P<0.05)。見圖1。

3 討論

RA是一種多基因疾病，以自身免疫和全身炎癥為特征，可造成關(guān)節(jié)功能逐漸受損，最終導(dǎo)致殘疾和死亡[6]。目前RA的病因和發(fā)病機(jī)制尚未明確，早期診斷并積極治療對(duì)控制RA病情進(jìn)展和改善預(yù)后具有重要的作用。OA是一種由于關(guān)節(jié)退行性變，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨被破壞而引起的慢性關(guān)節(jié)病，該病早期癥狀與RA有相似之處，RA需與OA進(jìn)行鑒別診斷。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA參與炎性疾病和自身免疫性疾病的發(fā)病過程，可能在RA的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[7]。Zhu等[8]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA通過靶向信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α(SIRPα)調(diào)控巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)、吞噬作用及促炎細(xì)胞因子的分泌，參與RA的發(fā)生發(fā)展。miR-24是一類22～28 bp的單鏈非編碼小分子RNA，在研究果蠅發(fā)育的時(shí)序性調(diào)控過程中被發(fā)現(xiàn)，廣泛存在于哺乳動(dòng)物多種組織，發(fā)揮其生物學(xué)功能[9]。miR-132是長(zhǎng)度為22 bp的小分子RNA，miR-132及其相關(guān)多態(tài)性在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎易感性中具有重要的作用，這種作用有望用于治療RA[10]。

本研究結(jié)果顯示，RA組PBMC中miR-24、miR-132表達(dá)水平均明顯高于OA組和對(duì)照組，中高活動(dòng)組PBMC中miR-24、miR-132表達(dá)水平均明顯高于低活動(dòng)組，骨侵蝕組PBMC中miR-24、miR-132表達(dá)水平均明顯高于非骨侵蝕組。提示miR-24、miR-132在RA患者PBMC中異常高表達(dá)，與疾病的活動(dòng)度、骨侵蝕和骨破壞程度相關(guān)，可能參與RA的發(fā)生發(fā)展。而OA組與對(duì)照組PBMC中miR-24、miR-132表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。可見miR-24、miR-132在OA患者和健康人群中并沒有顯著差異，但在RA患者中呈高表達(dá)，這對(duì)RA與OA的鑒別診斷具有重要的意義。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-24在RA患者中的表達(dá)水平均明顯高于OA患者，提示miR-24有望作為RA診斷的潛在標(biāo)志物[11]。Murata等[12]對(duì)RA患者的血漿及關(guān)節(jié)滑液中miR-132進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示關(guān)節(jié)滑液及滑膜成纖維細(xì)胞miR-132表達(dá)水平在RA患者中明顯上調(diào)，且與RA的疾病活動(dòng)相關(guān)，有可能作為RA診斷的生物學(xué)標(biāo)記物。應(yīng)用ROC曲線分析，結(jié)果顯示PBMC中miR-24、miR-132對(duì)診斷RA均具有一定的價(jià)值，且兩項(xiàng)聯(lián)合診斷RA的AUC優(yōu)于單項(xiàng)，其敏感度和特異度分別為90.2%和85.8%。說明miR-24、miR-132兩項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)有助于提高RA診斷的準(zhǔn)確性，并有望作為分析其發(fā)病機(jī)制的潛在標(biāo)志物。Churov等[13]研究表明，外周血miR-24在RA患者中明顯升高，miR-24被認(rèn)為是RA檢測(cè)最有前途的非侵入性的生物標(biāo)志物。另有研究顯示，RA患者PBMC中miR-132的表達(dá)水平明顯高于健康對(duì)照組，miR-132可作為監(jiān)測(cè)RA疾病活動(dòng)的潛在有效指標(biāo)，為RA臨床診斷提供更為可靠的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)依據(jù)[14]。Sharp評(píng)分及DAS28評(píng)分是臨床上反映RA患者活動(dòng)度和骨侵蝕嚴(yán)重程度的有效指標(biāo)[15]。本研究中miR-24、miR-132與Sharp評(píng)分、DAS28評(píng)分均呈正相關(guān)。這進(jìn)一步說明miR-24、miR-132表達(dá)上調(diào)與RA的病情活動(dòng)性相關(guān)，參與RA的發(fā)生發(fā)展，可作為RA診斷、病情判斷及疾病活動(dòng)的生物學(xué)標(biāo)志物。Filková等[16]研究認(rèn)為，miRNA的表達(dá)與RA的炎癥反應(yīng)和病情進(jìn)展相關(guān)，可作為RA診斷的生物標(biāo)志物和治療的靶點(diǎn)。

綜上所述，miR-24、miR-132在RA和OA患者PBMC中表達(dá)存在顯著差異，這兩種miRNA在OA患者PBMC中呈低表達(dá)，而在RA患者PBMC中呈高表達(dá)，miR-24、miR-132與RA疾病的活動(dòng)度和骨侵蝕程度相關(guān)，可能參與RA的發(fā)生發(fā)展。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，miR-24及miR-132兩項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)有助于提高RA診斷的敏感度和特異度，這為臨床上準(zhǔn)確診斷和治療RA提供新的思路和方法。