NLRP3炎癥小體在神經血管疾病中的作用①

董曉慶 丁艷平 張晉平 邵寶平 (西北師范大學生命科學學院，蘭州 730070)

神經血管疾病(neurovascular diseases)是腦或脊髓血管異常所致的疾病，包括腦卒中、脊髓血管畸形、神經系統腫瘤等一系列廣泛疾病[1]。神經血管疾病的炎癥反應是一個復雜的過程，包括神經膠質細胞固有免疫系統的激活及循環中白細胞的浸潤等[2]。炎癥小體在神經血管疾病中的炎癥反應中起關鍵作用，近幾年來炎癥小體逐漸成為神經血管疾病研究中的研究熱點。炎癥小體通過模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)識別病原微生物以及內源性危險信號，即病原相關分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMP)和危險相關分子模式(damage associated molecular pattern，DAMP)而被激活[3]。NLRP3炎癥小體是核苷酸結合和寡聚化結構域樣受體(nucleotide binding and oligomerization domain like receptors，NLRs)家族中的一種蛋白復合體，在小膠質細胞、星形膠質細胞、神經元、內皮細胞等細胞中多樣性表達，其在缺血性腦卒中、AD、TBI、腦瘤等多種疾病的發病機制中起重要作用[4]。

1 NLRP3炎癥小體的分子結構

目前，NLRP3炎癥小體是在神經血管疾病領域研究最多的炎癥小體，而其參與的神經血管疾病過程通常與IL-1β的成熟與分泌有關。NLRP3(也稱為cryopyrin和NALP3)是最具特征性的炎癥小體，其主要由NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis associated speckle-like protein containing CARD，ASC)及pro-caspase1組成(圖1)。NLRP3 主要包含3 部分： C 端的亮氨酸重復序列(leucine-rich-repeat domain，LRR)，其作用是識別微生物及內源性危險信號；中段是特征性的核苷酸寡聚化結構域(nucleoside triphosphatase domain，NACTH)，介導脫氧核苷三磷酸酶(deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase,dNTPase)的活化以及NLR寡聚化并形成炎癥小體的核心結構；N 端的效應結構域，主要包括熱蛋白結構域(pyrin domain，PYD)、胱天蛋白酶募集結構域(caspase recruitment domain，CARD)及桿狀病毒凋亡抑制重復結構域(baculovirus inhibitor of apoptosis repeat domain，BIR)等，參與信號傳導過程[5]。

2 NLRP3炎癥小體的激活

目前普遍接受的NLRP3炎癥小體激活模型分為兩步(圖2)：第一步啟動和第二步激活。

2.1第一步啟動 在靜息狀態下，除了ASC、IL-18以外，NLRP3和IL-1β在細胞中表達量處于極低水平，不能用于組裝或活化NLRP3炎癥小體，需要激活的 NF-κB 轉錄出 NLRP3 mRNA[6],再進行翻譯及翻譯后修飾等,此過程為 NLRP3 priming。此外，NLRP3的基礎水平可以保持在不活躍但有應答的泛素化狀態，并通過泛素連接酶相關蛋白(suppressor of G2 allele of skpl，SGT1)和熱休克蛋白90(heat shork protein 90 kD，HSP90)隔離。因此，在NLRP3能夠與其他炎癥小體成分結合并進行低聚之前，啟動的第一步是增加NLRP3和pro-IL-1b蛋白水平，或者是對現有NLRP3水平進行轉錄后修飾，調控NF-κB 活性的分子可以間接影響NLRP3 priming[7]。

圖1 NLRP3炎癥小體結構示意圖Fig.1 Schematic diagram of NLRP3 inflammasome

圖2 NLRP3炎癥小體的激活模型Fig.2 Models of NLRP3 inflammasome activation

2.2第二步激活 由于不同的NLRP3炎癥小體激活劑的性質不同，所以炎癥小體激活所涉及的不同方面或特定途徑很難達成一致意見，但是目前對于不同的信號事件和相關的亞細胞細胞器作為直接參與炎癥小體激活的途徑普遍認為主要包括以下幾個方面：內質網應激[8]、溶酶體破裂和自噬、鉀離子外排(K+)、線粒體、氧化應激。

2.2.1內質網應激 內質網應激的發生是由于內質網中未折疊蛋白積累增加或內質網中Ca2+穩定性紊亂造成的。內質網應激可能導致對未折疊蛋白質反應(unfolded protein response，UPR)[9]的刺激，這可能導致適當的修復/生存反應，或者如果達到極端細胞應激水平或極端的UPR，則會對細胞產生不利影響。最初，發現多個內質網應激物誘導NLRP3炎癥小體活化，獨立于典型的UPR啟動子(PERK，IRE1α和ATF6)蛋白[9]。然而，最近的兩項研究表明TXNIP是ER應激誘導的NLRP3炎癥小體激活的關鍵介質[10]。

2.2.2溶酶體破裂和自噬 尿酸晶體、明礬、石棉等炎癥小體激活劑可誘導吞噬作用。因此，NLRP3炎癥小體激活可以通過其誘導的吞噬體或溶酶體的不穩定化和其內容物的釋放而發生。關于溶酶體破裂和其內容物釋放到胞質溶膠中如何觸發NLRP3炎癥小體激活的確切信號細節仍不完全清楚。一些報道表明用二氧化硅或明礬處理后釋放的溶酶體蛋白酶組織蛋白酶B阻止NLRP3炎癥小體激活。盡管如此，也有人表示其對組織蛋白酶B缺陷小鼠炎癥小體激活沒有影響[8,11]。因此，組織蛋白酶B是否可以作用于主要炎癥小體激活事件(如氧化應激)的上游，仍有待解釋。

2.2.3K+外排 胞外的ATP 或成孔毒素(如尼日利亞菌素)可通過P2X7嘌呤受體(P2X purinergic receptor 7，P2X7)誘導K+流出，導致NLRP3炎癥小體激活。此外，ATP刺激也會導致細胞內Ca2+水平的增加。ATP刺激可以激活磷酸脂肪酶C(PLC)/肌醇三磷酸途徑，使內質網快速釋放Ca2+達到最大的胞內Ca2+存儲量，而升高的Ca2+水平也可以通過刺激內質網應激和釋放線粒體活性氧(mROS)或線粒體DNA(mDNA)來促進NLRP3炎癥小體激活[12]。

2.2.4線粒體 線粒體被認為是NLRP3炎癥小體激活的中心參與者。最近的研究發現,瞬時感受器M2型通道(transient receptor potential cation channel subfamily M member 2，TRPM2)介導Ca2+內流，誘導mROS的產生從而激活NLRP3[13]。此外，NLRP3炎癥小體激活包括將NLRP3和ASC銜接蛋白從內質網和胞質空間重新分布到核周間隙、內質網和線粒體中[14]。該過程中NLRP3炎癥小體的激活與線粒體抗病毒信號蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein，MAVS)有直接關聯，并且mROS的增加取決于線粒體外膜中電壓依賴性陰離子通道(voltage-dependent anion channel，VDAC)同種型1和3的狀態[15]。此外，NLRP3與線粒體融合素蛋白-2(mitofusin2，Mfn2)的相互作用是NLRP3炎癥小體在RNA病毒感染過程中激活所必需的[16]。NLRP3和線粒體內膜特異性的脂質之間存在直接關聯，在NLRP3炎癥小體激活中觀察到心磷脂抑制炎癥小體激活和NLRP3定位至線粒體。然而，這是否涉及心磷脂或NLRP3從內部線粒體膜向外部線粒體膜的移位(反之亦然)尚不清楚[17,18]。

2.2.5氧化應激(oxidative stress，OS) OS是體內氧化與抗氧化作用失衡，導致中性粒細胞炎性浸潤、蛋白酶分泌增加、產生大量氧化中間產物[19]。有研究表明提高ROS生成是NLRP3炎癥小體激活所必需的信號組分，ROS的增加也可能導致硫氧還蛋白互作蛋白(thioredoxin-interacting protein，TXNIP)從硫氧還蛋白[(thioredox，TRX)一種常見的抗氧化蛋白防御系統]中解離出來，與NLRP3 相互作用,促進NLRP3 活化[12]。有多種亞細胞來源可增加活性氧的產生，包括NADPH氧化酶、mROS、黃嘌呤氧化酶、過氧化物酶氧化酶等。其中，NADPH氧化酶和mROS是NLRP3炎癥小體激活中研究最多的ROS來源[20]。

3 NLRP3炎癥小體在神經血管疾病中的作用

3.1缺血性卒中NLRP3炎癥小體的作用 腦卒中是一種復雜的全身性疾病，在世界范圍內造成高死亡率和高致殘率。近年來，越來越多的證據表明先天免疫系統的炎癥機制可能導致腦缺血期間神經元和膠質細胞的死亡[21]。NLRP3炎癥小體已被證實在檢測細胞損傷和介導組織損傷炎癥反應中發揮重要作用。因此，靶向NLRP3炎癥小體信號的上下游通路可能是治療中風的潛在靶點。最新研究表明在局灶大鼠缺血模型中，NLRP3炎癥小體在腦損傷發生后不久首先在小膠質細胞中被激活，隨后在神經元和微血管內皮細胞中表達，但主要在神經元中表達，通過藥物抑制NLRP3、IL-1β蛋白水平的降低，有效緩解腦損傷的程度[22]。在小鼠局灶性缺血性腦卒中模型中，靜脈注射免疫球蛋白(丙種球蛋白)，可以顯著降低NLRP3、IL-1β和IL-18的水平從而達到保護神經元的效果[23]。此外，也有針對炎癥小體元件NLRPs、ASC和caspase-1的研究。研究表明在局灶大鼠缺血模型中，雌激素和黃體酮可以在蛋白水平上調節ASC和NLRP3，并降低瞬時炎癥小體組分的表達[24]。近年來，針對TXNIP/NLRP3炎癥小體激活的研究也成為熱點，研究表明傘形菌素通過抑制TXNIP/NLRP3炎癥小體激活抑制炎癥細胞因子的產生[25]；姜黃素通過抑制內質網應激抑制TXNIP/NLRP3炎癥小體激活，從而保護神經細胞在缺血損傷后免受谷氨酸神經毒性的影響[26]。

3.2AD中NLRP3炎癥小體的作用 AD是一種慢性、進行性和不可逆的神經變性疾病[26]，其特征是認知功能的惡化、β-淀粉樣肽斑塊的形成、神經纖維纏結和膽堿能神經元的退化。雖然近年來的病理生理機制還不完全清楚，但最近的一些研究證實NLRP3炎癥小體在AD的發病機制中起著關鍵性的作用[27]。IL-1β是AD固有免疫應答的關鍵因子，IL-1β的表達在AD患者腦和血漿中均有增加[28]。實驗數據表明阻斷IL-1β信號通路可減輕AD小鼠模型的認知損害[29]。從小膠質細胞中釋放的IL-1β也可以增加負責淀粉樣前體蛋白處理酶的活性，最終導致淀粉樣蛋白進一步沉積[30]。早期的研究表明了β-淀粉樣蛋白沉積周圍，小膠質細胞中IL-1β的高表達[31]，而Halle等[31]的研究首次證明β-淀粉樣蛋白在體內和體外的小膠質細胞中激活NLRP3炎癥小體的形成。最新的研究表明，選擇性自噬與炎癥反應的調節有關，且可通過NLRP3降解調節IL-1β和IL-18的產生從而影響小膠質細胞活化[32]。總之，這些研究表明了NLRP3炎癥小體在AD發病機制中的可能作用。靶向炎癥小體信號通路的分子組分似乎是神經保護和AD治療干預的一個有吸引力的策略。

3.3外傷性腦損傷(TBI)中NLRP3炎癥小體的作用 雖然外傷性腦損傷(TBI)后的繼發性腦損傷的確切機制復雜且知之甚少，但許多研究表明炎癥反應可能是TBI發病機制中的突出特征[33]。巨噬細胞和中性粒細胞侵入到損傷區，產生大量的炎癥因子和水腫與腦損傷有關。在TBI模型中IL-1β和IL-18表達明顯增加[34]。最近的一項研究表明，TBI可以誘導NLRP3炎癥小體的組裝、ASC的表達、caspase-1的活化以及IL-1β和IL-18的成熟與釋放，NLRP3炎癥小體可能是TBI患者有希望的治療靶點[35]。此外，最近的臨床研究發現，在嚴重或中度顱腦創傷患者腦脊液中炎癥蛋白ASC、caspase-1和NALP1水平升高，這也提示NLRP1炎癥蛋白可以作為評估TBI的潛在臨床生物標志物[35,36]。最近一項研究表明，NLRP3炎癥小體抑制劑MCC950(一種有效的具有選擇性的小分子)在TBI小鼠模型中對炎癥性腦損傷和神經系統具有一定的影響。MCC950對TBI的治療窗長達6 h，且MCC950的神經保護作用與小膠質細胞活化減少、白細胞募集減少、促炎細胞因子生成減少有關。MCC950減輕了TBI誘導的緊密連接蛋白的損失，并減少了細胞的死亡。這些結果表明，小膠質細胞中的NLRP3炎癥小體可能主要參與TBI的炎癥反應，使用MCC950特異性抑制NLRP3炎癥小體可能是治療TBI的一種有前途的方法[37]。以上研究表明NLRP1炎癥小體和NLRP3炎癥小體是TBI發生后中樞神經系統炎癥反應的重要組成部分，可能是減輕創傷后腦炎癥損傷的新的治療靶點。

3.4腦瘤中NLRP3炎癥小體的作用 惡性膠質瘤是中樞神經系統最常見的原發性腦腫瘤，越來越多的證據表明先天免疫和慢性炎癥在癌變和腫瘤進展中起關鍵作用[38]。近年來，NLRP3炎癥小體在癌變和腫瘤發生發展中的作用已被證實。許多內源性或外源性的刺激可作為腫瘤的啟動因子激活NLRP3炎癥小體，從而活化caspase-1，使得IL-1β和IL-18水平升高[39]。研究表明NLRP3炎癥小體在多型性神經膠母細胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)細胞中具有活性[40]。NLRP3炎癥小體可以被不同類型細胞中的不同信號所激活，NLRP3炎癥小體可以在大腦內皮細胞中被激活，這可能是血腦屏障在神經免疫和神經炎癥過程中一種尚未被探索的作用[41]。此外，在小鼠成膠質細胞瘤模型中證明抑制NLRP3可以減少腫瘤生長，延長小鼠輻射治療后的生存期，進一步說明NLRP3炎癥小體在腦老化與膠質瘤的發展中起重要作用[42]。然而，NLRP3炎癥小體在腦瘤進展過程中的潛在機制尚不完全清楚，需要更多的研究來了解炎癥小體的特性和其在腦癌的治療潛力。

4 總結與未來展望

綜上所述，大量研究證實了NLRP1和NLRP3炎癥小體在中樞神經細胞死亡和神經血管疾病包括中風、AD和TBI疾病行為缺陷中所起的核心作用。在對NLRP3炎癥小體的研究中，應將NLRP3炎癥小體分子機制的理解與NLRP3炎癥小體確切分子結構的信息相結合。進一步分析這些負調控因子和信號，最終有助于我們對NLRP3炎癥小體激活進行治療，并開發更好的治療方法來預防與NLRP3炎癥小體相關的炎性疾病，這對于NLRP3炎癥小體作為中樞神經系統疾病的一種新的治療策略非常重要。