基于高通量測序技術對野生和圈養華北豹腸道真菌多樣性的分析

華 彥 郎鵬飛 王洪堂 王 姣 曹和琴 姜廣順*

(1.東北林業大學野生動物與自然保護地學院，哈爾濱，150040；2.廣東省林業科學研究院，廣州，510520)

華北豹(Pantherapardusjaponensis)是中國特有的豹亞種，曾廣布于中國的華北地區，由于棲息地喪失和過度捕獵等因素，近年來，華北豹的分布急劇退縮，現僅分布于中國的山西、河南、河北等省份[1]，在動物園飼養有少量野外救護個體。胃腸道慢性炎癥[2-4]等病癥與腸道微生態紊亂有關，尤其是對區域性的極小種群而言，動物的腸道疾病可能成為物種受脅的潛在重要因素。腸道微生物主要由細菌和少量真菌及其他微生物組成[5]，真菌雖然占腸道微生物比例低，但其群落結構與物種、食性、疾病等因素密切相關[6]。近年來，腸道微生物中真菌的研究越來越受關注，Albenberg等[7]曾報道了炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)腸道微生物群中真菌特征，發現患病樣本中特異性念珠菌分類群的豐富度有明顯的增加，腸道真菌紊亂是導致IBD發生、發展的重要因素[8]。抗生素是獸醫常用的藥物，研究表明長期使用抗生素會導致腸道菌群失衡，具有保護作用的細菌減少，真菌數量增加，從而導致腹瀉[9]。Li等[10]發現腹瀉牦牛(Bosgrunniens)腸道新麗鞭毛菌門(Neocallimastigomycota)顯著高于健康牦牛，新麗鞭毛菌門豐度過高可能是導致腹瀉的主要原因。

因腸道菌群失調造成其微生態失衡而引起一系列腸道疾病是人工圈養瀕危野生動物主要原因之一。彭智偉[11]對野生東北虎(Pantheratigrisaltaica)、東北豹(Pantherapardusorientalis)等大型貓科(Felidae)動物腸道微生物中的細菌群落進行了分析，但對腸道真菌的研究顯見報到。本研究通過高通量測序技術對圈養和野生華北豹糞便中真菌類型進行研究，以探究華北豹腸道真菌多樣性和優勢菌群，比較人工圈養與野生兩種條件下華北豹腸道真菌菌群的差異，為華北豹的遷地保護提供科學管理的依據。

1 材料與方法

1.1 材料

在山西鐵橋山省級自然保護區采集24份野生華北豹新鮮糞便樣品，在山西太原動物園和河南森林公園采集野外救助的人工圈養華北豹糞便樣品7份。每份樣品記錄了采集地坐標及日期等信息，裝于樣品袋中，-80 ℃保存。

1.2 華北豹腸道真菌DNA提取

真菌胞壁比原核生物要厚10倍左右，所以先將樣本在超低溫冰箱和37 ℃水浴鍋中反復凍融5次，以提高真菌DNA的提取效果。通過E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit的試劑盒進行糞便樣品總DNA的提取。

1.3 華北豹腸道真菌18S rRNA的PCR擴增

利用引物547F(5′-CCAGCASCYGCGGTAATTCC-3′)，引物V4R(5′-ACTTT-CGTTCTTGATYRA-3′)靶向18S SSU rRNA基因的V4區[12]。PCR混合物包含16 μL高壓滅菌蒸餾水，10 μL PCR Buffer(5x)，4 μL dNTPs(2.5 mM)，10 μL GC Buffer(5x)，5.5 μL DNA模板，0.5 μLTaqE，正向和反向引物(工作濃度：10 μM)各2 μL，每個反應總體積為50 μL。35個PCR循環包括在98 ℃下持續25 s，55 ℃持續30 s和72 ℃持續50 s，在此之前在98 ℃下持續5 min的預變性，并在35個PCR循環后以72 ℃持續7 min后結束整個反應。在Gold-View染色的2%瓊脂糖凝膠上電泳后分析PCR產物。

1.4 18S rRNA的文庫制備和Miseq測序

采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測序文庫，之后進行文庫質檢與定量，對合格的文庫，在MiSeq機器上利用Mi Seq Reagent Kit V3(600個循環)進行 2×300 bp 的雙端測序。通過對雙端序列數據的數據過濾和雙末端拼接操作，得到有效數據，再利用 FLASH 軟件將有效 reads 拼接組裝成一條序列。

為得到華北豹腸道中較好的真菌物種多樣性信息，對獲得的原始序列使用 QIIME 軟件對測序數據進行優化處理。去除接頭和無重復單序列，以便降低冗余計算量。以97%相似度，將所有樣品優化后的序列聚類成為 OTU(operational taxonomic units)。

1.5 華北豹腸道真菌多樣性的分析

基于OTU聚類結果，利用Mothur軟件計算華北豹腸道真菌的Alpha多樣性。Alpha多樣性指數可用來對各樣品的豐富度和多樣性進行比較分析，常用的Alpha多樣性指數包括Chao1指數、Shannon指數以及Simpson指數。Chao1指數表明樣品中群落的豐富度，Shannon 指數呈現群落的多樣性，而Simpson指數則是群落中優勢種集中程度的體現。

利用 Mothur 軟件做豐富度稀釋性曲線及Shannon指數分析，作為測序數據量不同樣本中物種豐富度比較的依據，也可作為樣本測序量合理與否(是否足以覆蓋所有類群)的評價標準，得出樣本測序深度，同時反映華北豹腸道真菌多樣性指數，顯示華北豹腸道中絕大多數的真菌信息。

2 結果與分析

2.1 OTU數目與Alpha多樣性指數分析

31份華北豹糞便樣品原始序列共計1 352 804條，平均每份樣本43 638.84條；質控后的序列共計1 209 271條，平均每份樣本39 008.74條。樣品質控后的序列讀長主要位于300—390 bp，所有樣品優化聚類后，共得到1 797個 OTU(圖1)。

圖1 測序序列質量控制前后讀長分布Fig.1 The reading lengths of the sequences

本實驗中的Chao1指數為3—218，表明各樣品的豐富度不高。Shannon指數與Simpson指數的數值越大，則表示樣品中物種的多樣性越高，物種分布的均勻度越好。覆蓋率的大小則反映了樣品測序的深度，本實驗31份樣品的覆蓋率均在99.23%以上，說明該實驗測序結果能很好地反應樣品中真菌的情況。

從圖2與圖3分別是野生與圈養華北豹樣品中真菌的豐富度稀疏曲線和Shannon指數稀疏曲線，從圖中可以看出當測序量達到3 000時，各樣品的OTU數目增加基本趨向平緩，這說明更多的數據量只會產生少量OTU數目，這也表示該實驗的測序數據量合理。從圖中也可明顯看出，野外與圈養華北豹所有樣品Shannon曲線，均已經達到平緩的走勢，這也反映了樣品量較為合理。

表1 野生和圈養華北豹腸道真菌多樣性指數

Tab.1 The diversity of Alpha in wild leopard and captive leopard

2.2 物種組成及優勢菌群分析

2.2.1 門水平上腸道真菌菌群組成及豐富度

對24份野生華北豹糞便樣品、7份圈養華北豹糞便樣品在門水平和屬水平上進行物種注釋分析，可確定其腸道真菌菌群中的 6個菌門，無法鑒別菌群的序列這里統一歸并為其他(unidentified)。其中子囊菌門(Ascomycota)在華北豹腸道真菌菌群中含量都是最高的，各樣品的平均含量為61%、擔子菌門(Basidiomycota)的平均含量為19%、毛霉門(Mucoromycota)的平均含量為9%、壺菌門(Chytridiomycota)的平均含量為3%、芽枝霉門(Blastocladiomycota)的平均含量為0.05%，以及未確定(unidentified)的平均含量為6%，Zoopagomycota菌門只在野生華北豹個體樣品中檢測到平均含量為2%。

2.2.2 野生和圈養華北豹腸道真菌群落比較

圖5是野生和圈養華北豹這2組樣品共有和特有 OTU 數目的 Venn 圖。2組樣品共有631個OTU，重疊部分表示2組共有的 OTU 數目為 97個，野外華北豹組(YW)特有的OTU為 519個，圈養華北豹組(JY)特有的 OTU 個數為14個。野外特有的真菌有柄孢殼菌屬(Podospora)、念珠菌屬(Candida)、Cystofilobasidium、隱球菌屬(Cryptococcus)、Rhodosporidiobolus、隱囊菌屬(Aphanoascus)、Saitozyma、橫節霉菌屬(Chalara)、Helicodendron、子囊殼菌屬(Coniochaeta)；圈養特有的有復膜孢酵母菌屬(Saccharomycopsis)、Cyniclomyces、Lodderomyces、Gamsiella、Diutina、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、孢圓酵母(Torulaspora)。

圖2 豐富度稀疏曲線Fig.2 The richness rarefaction curve

圖3 香農指數稀疏曲線Fig.3 The Shannon index rarefaction curve

圖4 野生與圈養華北豹腸道真菌門水平下的組成結構Fig.4 The bar chart of fungal on phylum in wild leopard and captive leopard

圖5 野生與圈養華北豹樣本中獨有及共享操作分類單元(OTU)Venn圖及顯示各屬水平的比例餅形圖Fig.5 Venn diagram showing unique and shared operational taxonomic units(OTUs)between wild leopard and captive leopard samples.A pie chart of the respective proportions of genus is shown

2.2.3 屬水平上的物種豐度聚類熱圖

圖6所示野生華北豹與圈養華北豹腸道真菌屬水平上的豐度，選用豐度排名前50的屬繪制的聚類分析熱圖，圖中色塊越靠近紅色表示某份樣品對應的某一物種比例越高，反之，色塊越靠近綠色表示某份樣品對應的某一物種比例越低。總體來看，野生華北豹組較圈養華北豹組的物種豐度有變化，說明野生華北豹較圈養華北豹組間的物種多樣性存在差異。圖中可見，樣本19獨自為一組，其余各組腸道內真菌菌群的組成及相對豐度差異較大，特有相對豐度顯著高于各組平均值的真菌有Polarella、Phaeocystis、Pelagophyceae等。

圖6 野生華北豹與圈養華北豹屬水平上的物種豐度熱圖Fig.6 The abundance of fungal heatmap in wild leopard and captive leopard on genus

圖7 LDA 值分布柱狀圖Fig.7 Distribution histogram based on LDA value

圖8 進化分支圖LichtheimiaceaeFig.8 Evolutionary branch graph

2.2.4 基于LefSe(LDA Effect Size)分析野外與圈養華北豹2組間的物種差異

采用LefSe分析野外與圈養華北豹2組間具有顯著差異的物種(圖7，圖8)。LDA評分直方圖(圖7)顯示各組間具有統計學差異的生物學標志，柱形圖的長度表示LDA評分，紅色代表野外組樣品，綠色代表圈養樣品。該圖顯示了野外與圈養組之間具有顯著差異的微生物類群(LDA score>3.3)。在野外組中具有顯著豐度差異的有：Coniochaetaceae科、銀耳綱(Tremellomycetes)、小子囊菌目(Microascales)、子囊殼菌屬；在圈養組中具有顯著豐富度差異的有：毛霉門、酵母綱(Saccharomycetes)、畢赤酵母科(Pichiaceae)、酵母菌屬(Saccharomyces)、毛霉目(Mucorales)、酵母科(Saccharomycetaceae)、環孢菌科(Inocybaceae)、根毛霉科(Rhizomucor)、德巴利(氏)酵母屬(Debaryomyces)、酵母菌目(Saccharomycetales)、畢赤酵母屬(Pichia)、絲蓋傘屬(Inocybe)、復膜孢酵母屬、金絲酵母科(Debaryomycetaceae)、Lichtheimiaceae、復膜孢酵母科(Saccharomycopsidaceae)。進化分支圖(圖8)由內至外輻射的圓圈，顯示了野外與圈養組在門至屬(或種)水平的分類群相對豐度差異。每個不同分類的小圓圈表示一個分類單元，而每個圓圈的直徑的大小反映了相對分度的高低。紅色和綠色的圓圈分別代表了野生和圈養華北豹相對豐度差異，未標色的為無顯著差異的物種。從圖中結果顯示，LDA值分布柱狀圖與進化分支圖的結果是相符合的。

3 討論

3.1 華北豹腸道真菌與其他動物的比較

本研究發現子囊菌門、擔子菌門、毛霉門、壺菌門、芽枝霉門是華北豹腸道真菌的優勢菌群，艾生權[5]等用RLFE法測得亞成體大熊貓腸道真菌主要為子囊菌門、擔子菌門2個門，周本翔等[12]通過實驗證明草魚腸道中真菌同樣以子囊菌門數量最多，其次是擔子菌門。這些研究結果表明，至少在以上的幾種動物類群間，其腸道真菌構成大致是相似的。

3.2 野生華北豹與圈養華北豹腸道真菌多樣性的差異

真菌菌群占腸道總菌群的比例較小，但是對腸道的穩態平衡維持具有重要的作用[13]，腸道中的真菌與細菌關系密切，兩者存在著穩定的拮抗、互利共生關系[14-15]，它們為彼此的生長發育提供支持和保護作用[16]。本研究發現，圈養華北豹酵母綱較野生華北豹豐富。酵母綱作用動物腸道的機理十分復雜，現僅見白色念珠菌屬(Candidaalbicans)對腸道黏膜損傷之后致炎作用，但酵母菌屬中的布拉酵母菌(Saccharomycesboulardii)是目前確認人類腸道益真菌，還未見到其對于貓科食肉動物的相關研究報道[17]。假單胞菌的生長、發育等活動與白酵母菌密切相關[18]。Kohl等[19]曾研究報道指出飲食并不是圈養動物微生物多樣性減少的唯一原因，并指出圈養動物后代的腸道菌群與它們母親的腸道菌群結構更相近。酵母菌屬中的白色念珠菌是哺乳動物胃腸道中含量最多的一種真菌，有小鼠實驗提示白色念珠菌的致炎作用更可能發生在腸道黏膜損傷之后[20]。Sokol等[21]通過觀察235名IBD患者與38名健康者的糞便微生物群的細菌與真菌組成，發現IBD患者擔子菌門與子囊菌門的比例增加，其中促炎真菌如白色念珠菌占比增加，抗炎真菌如酵母菌占比減少。

通過本研究積累了相關數據及資料，發現野生和圈養華北豹腸道真菌組成結構中毛霉門存在明顯差異，這可能是由于野生與圈養條件下食物豐富度不同而導致的。因此飼養人員應當對圈養華北豹的食物構成加以改善，以免引起華北豹因食物單一而引發疾病。

本實驗首次就圈養與野外華北豹腸道真菌菌群進行研究，目前國內外對本實驗中檢測到的一些真菌研究甚少，它們與機體及腸道微生態的相關性也不甚明確，無法就相關菌群在宿主腸道微生態中扮演的具體作用進行詳細的分析，還要相關的后續實驗進一步研究。