2018年海南省北部沿海地區野鳥AIV與NDV監測

付 恬 林 江 孫 靜 呂欣孺 李 祥 楊曉宇馬沛然 李 儀 初 冬 耿海東 孫賀廷 謝林紅彭 鵬 秦思源 馮爾輝 楊思遠 孫 穎* 王玉龍* 柴洪亮*

(1.東北林業大學野生動物與自然保護地學院，哈爾濱，150040；2.海南東寨港國家級自然保護區管理局，海口，571129；3.國家林業和草原局森林和草原病蟲害防治總站，沈陽，110034；4.黑龍江民族職業學院，哈爾濱，150066)

禽流感(avian influenza，AI)是由正粘病毒科(Orthomyxoviridae)流感病毒屬的A型流感病毒引起的禽類的一種烈性的高度接觸性傳染病[1]。禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)不僅僅感染禽類，還可以跨越物種屏障感染哺乳動物，甚至人類。高致病性禽流感被世界動物衛生組織列為A類動物疫病，我國將其列為I類動物疫病。新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起禽的一種急性、熱性、敗血性和高度接觸性傳染病。以高熱、呼吸困難、下痢、神經紊亂、黏膜和漿膜出血為特征[2-3]。ND具有很高的發病率和病死率，是危害養禽業的一種主要傳染病，OIE將其列入OIE疾病名錄，我國將其列為I類動物傳染病。

野鳥尤其是野生水禽是AIV和NDV的天然宿主，大多數學者認為野鳥在AIV和NDV傳播過程中起著重要作用[4-5]。同域活動的帶毒候鳥、留鳥與家禽之間，存在著交叉感染的可能性，這為病毒基因重組創造了機會。海南省位于全球8大候鳥遷徙路線中的東亞-澳大利西亞以及中亞-印度線上，是候鳥遷徙必須經過的停歇地以及越冬地。此外，海南更是以文昌雞、嘉稷鴨聞名的我國重要的家禽養殖區域。

本研究選取海南省北部的海口與文昌地區的塔市村、道學、三江、竹山、旗調、貝坡、榜頭等7個監測點于2018年2月中旬采集野鳥糞便樣本，對海南北部地區野鳥攜帶AIV和NDV狀況進行監測，進而掌握海南北部地區野鳥感染禽流感和新城疫病毒的基本情況。

1 實驗方法

1.1 樣品采集

于2018年2月中旬選取海南省海口到文昌兩地的北部沿海地區為采樣區域，包括塔市村、道學、三江、竹山、旗調、貝坡、榜頭等7個沿海海邊地點，總共采集了288份新鮮濕潤的野鳥糞便樣品(表1)，及時保存在含有樣品保存液(成分：甘油、硫酸鏈霉素、青霉素鈉、PBS)的離心管中，冷鏈運輸至實驗室。

1.2 樣品處理

將采集到的糞便樣品編號，振蕩混勻，靜置半分鐘，取上清液200 mL置于新的離心管中，再加入抗生素，混合備用。

1.3 病毒分離

取處理好的樣品，采用雞胚尿囊腔接種法[6]，接種于9—11日齡SPF雞胚尿囊腔中，每個樣品接種2枚雞胚，接種量為0.2 mL/枚，于37℃全自動孵化器中孵化72 h，每隔24 h照胚1次。棄去24 h內死亡的雞胚，盲傳兩代，無菌條件下收獲24—72 h內的死胚及活胚的尿囊液，備用。

1.4 血凝試驗

血凝試驗采用濃度為1%的SPF雞紅細胞懸液。對收取的尿囊液進行血凝試驗[6]，測定血凝效價并記錄。

1.5 RT-PCR試驗

采用Trizol試劑法提取血凝陽性樣品RNA，然后將RNA反轉錄為cDNA，用本實驗室設計保存的AIV(M、NS、HA)和NDV(F、NDV1/2)特異性引物分別進行禽流感和新城疫病毒RT-PCR鑒定。以 cDNA為模板，按照如下體系擴增：10 μL 2×TaqPCR StarMix預混液，2 μL引物(上、下游引物各1 μL)，1.5 μLcDNA，用去離子水將體系補充至25 μL。RT-PCR反應程序設定30個循環，具體反應溫度見表2。

表1 采樣地點主要野鳥品種及采樣情況

Tab.1 Main wild bird species and sampling conditions at sampling sites

表2 RT-PCR反應程序

Tab.2 RT-PCR amplification procedure

2 結果

2.1 血凝試驗結果

樣品接種SPF雞胚，傳胚兩代，收取每一代尿囊液進行血凝實驗。228份樣品中只有2份樣品為血凝陽性(2份樣品分別采自道學站和竹山，當地常見野鳥品種為鸻鷸類和鷺類)，其余樣品均顯示血凝陰性結果。血凝陽性樣品效價見表3。

表3 血凝試驗結果

Tab.3 Result of the HA test

2.2 RT-PCR鑒定結果

將血凝陽性樣品進行RT-PCR試驗，然后進行瓊脂糖凝膠電泳試驗，通過凝膠成像系統觀察結果。AIV鑒定引物M、NS、HA擴增的目的片段長度分別為1 020 bp、838 bp、640 bp；NDV鑒定引物F、NDV1/2擴增的目的片段長度分別為486 bp、375 bp。結果如圖1—圖5，陽性對照樣品均出現相應的目的條帶，而兩份血凝陽性樣品的結果均為陰性。

圖3 HA640引物RT-PCR擴增結果Fig.3 RT-PCR amplification result of HA640 注：M.DNA標準DL2000；1.陰性對照；2—3.HA76、HA226；4.HA640陽性對照 Note：DL2000 DNA Maker.1.Negative control.2-3.Samples HA76，HA226.4.HA640 positive control

圖4 NDV1/2引物RT-PCR擴增結果Fig.4 RT-PCR amplification result of NDV 1/2 注：M.DNA標準DL2000；1.1/2陽性對照；2—3.HA76、HA226；4.陰性對照 Note：DL2000 DNA Maker.1.NDV 1/2 positive control.2-3.Samples HA76，HA226.4.Negative control

圖5 NDV F引物RT-PCR擴增結果Fig.5 RT-PCR amplification result of NDV F 注：M.DNA標準DL2000；1.陰性對照；2—3.HA76、HA226；4.F陽性對照 Note：DL2000 DNA Maker.1.Negative control.2-3.Samples HA76，HA226.4.NDV F positive control

3 討論

近年來，世界各地相繼暴發AI和ND疫情，AI和ND是家禽養殖業和野生動物種群健康的一大嚴重威脅，AI更是嚴重威脅人類健康的人畜共患病。在全球8條候鳥遷徙路線中，亞太地區的水鳥遷徙主要有3條通道，分別為西太平洋、東亞-澳大利西亞及中亞-印度，這3條通道都與中國鳥類遷徙有著密切關系[7]。海口與文昌兩市地處海南省北部沿海地區，是東亞-澳大利西亞以及中亞-印度遷徙路線上重要的地理區域，是部分候鳥重要的越冬地，也是許多候鳥繼續遷徙飛往東南亞國家途中的停歇地。海南地處熱帶，其溫暖的氣候與適宜的環境造成當地留鳥種類繁多。嘉積鴨和文昌雞是海南特有的“四大名菜”之二，其相關養殖產業是海南重要經濟來源，近年來文昌雞更是向其他地區供應[8-10]。這為AIV、NDV在當地候鳥、遷徙留鳥及本地家禽之間循環傳播及重組變異提供了便利條件，對AIV、NDV在當地的流行傳播有著重大影響。因此對海南地區野鳥AIV、NDV攜帶狀況進行流行病學監測具有重要意義。

海南省地處熱帶，氣候屬于熱帶海洋性季風氣候。采集樣品時正處于2018年2月中旬，屬于初春時期，候鳥剛度過越冬期大部分還未開始向北方遷徙。采樣時采樣點的主要鳥類如鸻鷸類、鷺類均為候鳥，而八哥(Acridotherescristatellus)、珠頸斑鳩(Streptopeliachinensis)為當地留鳥，說明留鳥與候鳥之間相互存在著交叉感染的可能性。

本研究于2018年2月在海南北部地區總共采集了288份野鳥糞便樣品，結果有2份樣品呈血凝陽性，進一步采用RT-PCR試驗鑒定結果顯示AIV、NDV均為陰性。本研究可為海南北部沿海地區野鳥攜帶禽流感與新城疫病毒情況提供本底數據。2份樣品呈血凝陽性，但AIV和NDV鑒定結果均為陰性，經分析可能原因如下：(1)本研究僅對AIV與NDV進行了檢測，其他病原微生物如幾種腸產毒素型大腸桿菌、雞毒支原體、腺病毒等也含有血凝素，均能夠引起雞的血紅細胞凝集現象，所以2份樣品呈現血凝陽性，可能存在其他病原微生物。(2)禽流感病毒主要通過禽類的呼吸道分泌物和糞便大量排出，病毒可在0—4 ℃水中至少存活1個月、4 ℃糞便中存活35 d、37 ℃糞便中生存6 d[11]。當地氣候溫暖，溫度較高，不適宜病毒生存，因此導致樣品中分離不到AIV和NDV。(3)采樣地點主要集中于北部偏東部海岸地區，采集樣本數量較少，這也是沒有檢測到病毒的一種可能。其他原因如樣品運輸距離較遠導致樣品不夠新鮮、采集時期不是疫情高發期等原因也有可能造成采集樣品經檢測均為AIV及NDV陰性的結果。

根據廖飛等[12]和解林紅等[13]的研究，并結合本研究結果顯示，近期野鳥不是海南北部沿海地區禽流感和新城疫的主要傳播源，當地在近期不存在疫情暴發的高危風險。但是在候鳥越冬遷徙期仍需要對海南地區進行監測，尤其在海南周邊鄰國及國內地區的遷徙路線上暴發疫情時需嚴密監測，以便及時預警做好防控措施。