致烏蘇里母貉腹瀉性疾病病原的檢測分析

張召興 劉少杰 賈青輝 張艷英 高貴生 史秋梅*

(1.河北旅游職業學院畜牧獸醫系，承德，067000；2.河北科技師范學院 河北省預防獸醫學重點實驗室，秦皇島，066604)

近幾年，許多研究表明了寄生蟲病和傳染病對赤狐(Vulpesvulpes)、貉(Nyctereutesprocyonoides)、北美水貂(mustelavison)、寵物犬危害較大，尤其是腸道寄生蟲病感染率和發病率較高，其腸道寄生蟲病中以線蟲病流行最為嚴重，主要臨床表現為嘔吐、貧血、嚴重腹瀉，嚴重可導致死亡。因此，腸道線蟲病成為危害毛皮動物主要的寄生蟲病之一[1-2]。十二指腸鉤口線蟲(Ancylostomaduodenale)病是由鉤口科(Ancylostomatidae)鉤口屬中的鉤口線蟲寄生寵物犬小腸腸道寄生線蟲病，主要寄生于寵物犬十二指腸，吸附于腸壁上并吸取寵物犬的營養物質，該寄生蟲可以引起不同日齡寵物犬發病，主要引起胃腸消化道功能紊亂、排血便、脫水、貧血、消瘦等，嚴重者可導致死亡[3-4]。大腸桿菌(Escherichiacoli)是動物和人主要條件致病菌之一，可以引起多種動物和人發病。貉大腸桿菌主要引起不同日齡貉急性或者慢性腸道傳染病，其中以幼貉易感染，臨床中主要以腹瀉和敗血癥為主要癥狀，嚴重可導致急性死亡[5-6]。

2018年12月，昌黎縣某養貉場，烏蘇里母貉出現精神沉郁、厭食、眼結膜蒼白、消瘦、排出帶有血液的紅色的水樣糞便。為了鑒定引起母貉腹瀉的病原，采集糞便及肛拭子病料組織進行病原的檢測，為該病的治療提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 病料來源

2018年12月，昌黎縣某養貉場，烏蘇里母貉出現精神沉郁、厭食、眼結膜蒼白、消瘦、排出帶有血液的紅色的水樣糞便，采集其糞便及肛拭子，進行病原學檢測。

1.2 主要試劑與儀器

動物線蟲基因DNA組提取試劑盒、2×TaqMarker Mix、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購TaKaRa生物工程(大連)有限公司；DL2000 Marker購自北京中科瑞泰生物有限公司；犬瘟熱病毒、犬細小病毒、犬冠狀病毒膠體金試紙條均購于上海快靈生物科技有限公司；大腸桿菌特異性生化鑒定試劑盒購于上海信帆生物科研所；藥敏紙片購于常德比克曼生物科技有限公司。

1.3 實驗動物

(25±2)g健康昆明系小鼠8只，由河北省預防獸醫學重點實驗室提供。

1.4 病毒性疾病膠體金試紙條檢測

按照說明書，采集患病貉的糞便加入PBS中，離心取上清，用膠體金試紙條檢測犬瘟熱病毒、犬細小病毒、犬冠狀病毒抗原，采集血液分離血清，用膠體金試紙條檢測犬瘟熱病毒抗原。

1.5 線蟲卵囊分離與形態學觀察

采集的貉糞便，用飽和食鹽水漂浮法收集線蟲卵囊，取洗滌干凈卵囊，400×倍帶有標尺的顯微鏡下觀察線蟲蟲卵形態結構，根據《小動物寄生蟲病學》和《家畜寄生蟲圖譜》等[7-8]文獻圖譜確定線蟲的種類。

1.6 線蟲基因組的提取與PCR鑒定

王挺等[9]，根據GenBank中登錄的線蟲ITS基因序列，設計ITS基因保守區引物ITS-1：5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3′，ITS-2：5′-TTAGTT-TCTTTTCCTCCGCT-3′引物由上海生工生物工程有限公司合成。用動物線基因DNA組提取試劑盒提取卵囊DNA組模板，用提取的DNA為模板進行PCR擴增與鑒定。將PCR產物送上海生工生物工程有限公司測序，其測序結果與GenBank中登錄的鉤口線蟲基因序列進行同源性比較。

1.7 細菌學鑒定與藥敏試驗

1.7.1 細菌分離培養

采集患病貉的肛拭子及糞便樣品經過處理后，無菌條件下接種于無菌的動物血培養基，在37℃恒溫培養箱中培養12—18 h，選取動物血培養基上生長優勢單個菌落接種于大腸桿菌特異性鑒定顯色培養基進行鑒別培養，對大腸桿菌在普通營養肉湯中進行純化培養后染色鏡檢觀察其形態學。

1.7.2 分離菌株生化特性鑒定

按照說明書對分離的菌株進行生化特性試驗鑒定。

1.7.3 細菌致病性試驗

將8只小白鼠分成2組，試驗組灌胃攻毒4只小白鼠，接種劑量為0.5 mL(107CFU/mL)，對照組的小白鼠給予等量的無菌普通營養肉湯，攻毒后觀察7 d，并記錄試驗組和對照組小白鼠的發病及死亡情況，對死亡的小白鼠無菌條件下，取其病料組織進行細菌學鑒定。

1.7.4 藥敏試驗分析

按照CLSI推薦的標準K-B紙片法對分離菌株進行藥敏試驗。

2 結果

2.1 病毒性疾病膠體金試紙條檢測結果

細小病毒抗原、犬冠狀病毒抗原、犬瘟熱病毒抗原膠體金試紙條檢測均為陰性。

2.2 線蟲卵囊分離與形態學觀察結果

結果見圖1。從患病的貉糞便中分離到卵囊，從400倍帶有標尺的顯微鏡下觀察線蟲蟲卵形態可見，該蟲卵卵囊為無色透明的橢圓形蟲卵結構，卵囊兩端呈鈍圓，卵囊殼薄，其卵囊的卵殼與卵內的細胞蟲卵胞之間有較明顯的空隙，卵囊的大小約為58—76 μm×35—41 μm，卵囊內有6—8個內細胞，呈桑葚狀。《小動物寄生蟲病學》和《家畜寄生蟲圖譜》等[7-8]文獻圖譜中報道的鉤口線蟲卵囊的形態和大小一致，初步鑒定為鉤口線蟲。

圖1 貉鉤口線蟲蟲卵形態結構(400×)Fig.1 Morphological structure of eggs of leptospira in mink(400 ×)

2.3 線蟲PCR鑒定結果

用ITS基因保守引物擴增出大約為734 bp左右的目的基因片段(圖2)，其測序結果后與GenBank中登錄的鉤口線蟲ITS基因參考序列同源在98.9%—99.9%，因而證實了分離的線蟲卵囊為鉤口線蟲。

圖2 貉鉤口線蟲PCR鑒定結果Fig.2 Identification of racoon Nematode by PCRM：DL-2000 Marker；1—2：為樣品 Samples

2.4 細菌分離鑒定結果

分離的菌株在動物血培養基上長出具有濕潤的、灰白色的、大小一致的菌落；在大腸桿菌特異性鑒定顯色培養基上長出了圓形、邊緣整齊的、綠色的菌落；染色鏡檢結果顯示，分離菌株的形態學與報道的大腸桿菌形態學一致。

2.5 分離菌株生化特性鑒定

從患病貉的體內分離到菌株發酵葡萄糖、麥芽糖、枸櫞酸鹽、甘露醇等，分離到菌株產酸不產氣；分離菌株的吲哚試驗和V-P試驗均為陰性；生化特性試驗結果顯示，分離菌株被鑒定為大腸桿菌。

2.6 細菌致病性試驗結果

在攻毒后的48—72 h，試驗的小白鼠出現死亡率為75%，到試驗后的96 h，死亡率為100%，從試驗組死亡的小白鼠體內分離到大腸桿菌，對照組的小白鼠直到7 d試驗結束健康存活，致病性試驗結果表明，從患病的貉的體內分離到大腸桿菌具有致病性。

2.7 藥敏試驗

由表1可知，分離菌株對頭孢曲松、頭孢噻呋、美羅培南、左氧氟沙星4種藥物敏感，對頭孢他啶、恩諾沙星、大觀霉素、林可霉素、阿米卡星5種藥物中敏，對慶大霉素、阿莫西林、氨芐西3種抗菌藥物耐藥。

3 討論

鉤口線蟲病傳播途徑廣泛，主要以口感染為主，也可以通過胎盤傳播，貉、犬等動物是多種人獸共患寄生蟲的終末宿主和中間宿主，在飼養過程中與人們接觸，可能多種人獸共患寄生蟲病感染人，對人們的健康存在潛在威脅[10-11]。因此，在貉養殖過程中定期進行驅蟲，同時還要注意環境衛生，減少相關寄生蟲病發生與流行。大腸桿菌是在自然界分布廣泛的一種人畜共患的條件病原菌，主要引起貉的腹瀉和敗血癥，該病的傳播與食物和環境密切相關，飼養管理不善、環境條件變化等應激因素，也可以引發該病的發生[12]。肖立榮等[13]研究表明從秦皇島地區患腹瀉的水貂體內分離了大腸桿菌，且對多種抗生素具有耐藥性。張召興等[14]研究表明從40多份送檢的腹瀉病貉體內分離鑒定出16株，對常用的抗菌藥物具有不同的耐藥性。

表1 藥敏試驗結果

Tab.1 Drug sensitivity test results

注：S.敏感，I.中敏，R.耐藥

Note：S.indicates sensitivity，I.indicates moderate sensitivity and R.indicates drug resistance

本試驗通過采集患腹瀉病母貉的糞便、肛拭子和血液，通過膠體金試紙條檢測犬細小病毒抗原、犬冠狀病毒抗原、犬瘟熱病毒抗原均為陰性，排除病毒性疾病的感染。在患病貉的糞便中分離卵囊，通過鑒定為鉤口線蟲，且分離到的大腸桿菌具有很強的致病性。因而證實了鉤口線蟲和大腸桿菌混合感染是引起母貉腹瀉的主要因素。腹瀉的母貉被診斷為鉤口線蟲病與大腸桿菌病混合感染。引起貉發病的因素很多，主要與食物和環境有關，因此，在貉養殖的過程中，應該注意食物新鮮度和環境的衛生，定期驅蟲。針對貉鉤口線蟲和大腸桿菌混合感染，選擇驅蟲藥物和對大腸桿菌敏感的藥物結合治療，同時應該注意環境的消毒。