蛹蟲草多糖的提取及對小鼠脾細胞增殖的影響

李志濤，孫金旭，劉海鵬，王青華，張志強，高越，王暉

（1.衡水學院生命科學系，河北衡水053000；2.衡水市食品藥品檢驗檢測中心，河北衡水053000）

蛹蟲草又名北冬蟲夏草，是一種藥食兩用的真菌，其含有多種生物活性物質，醫療保健功能很高，其中，蛹蟲草多糖是其最重要的生物活性成分之一[1-4]。目前，多糖提取的傳統方法多為熱水提取法，這種方法存在費時長、提取率低等問題，超聲波提取可以破壞細胞結構，有助于多糖的溶出，可以明顯縮短提取時間，提高多糖的提取率，微波提取方法簡單且多糖的提取率相對較高，超聲和微波提取法相比傳統提取方法優勢明顯[5-10]，但多糖提取率仍不夠理想，目前，單獨采用微波法或超聲法提取蛹蟲草菌絲體多糖的報道很多，但將微波提取法和超聲提取法結合起來提取蛹蟲草菌絲體多糖的報道很少見，因此，本研究采用微波法和超聲波法協同提取蛹蟲草多糖，優化蛹蟲草多糖的最佳提取工藝，旨在最大限度的提高蛹蟲草多糖的提取率，并研究提取到的蛹蟲草多糖對小鼠脾細胞增殖的影響，為進一步研究蛹蟲草多糖的免疫活性和開發蛹蟲草資源提供技術參數和科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛹蟲草菌絲體：衡水學院發酵工程實驗室提供。60 ℃下恒溫烘干。

葡萄糖：泰州市興華化學品公司；無水乙醇：天津市金衛爾化工公司；RPMI-1640 不完全培養液：Gibco公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2FD 型超凈工作臺：上海璽恒實業有限公司；KS16000G 型臺式高速離心機：上海冠森生物科技有限公司；EL-320 型電子天平：常州市天之平儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 超聲波-微波協同法提取蛹蟲草多糖

1.3.1.1 提取工藝[11-13]

蛹蟲草→粉碎→加蒸餾水浸泡→置于超聲-微波協同反應儀→超聲波提取（固定微波功率）→離心得上清液→濃縮→加入乙醇沉淀→靜置→離心得沉淀→無水乙醇、丙酮分別洗滌→低溫干燥→蛹蟲草多糖

1.3.1.2 蛹蟲草多糖的測定[14]

利用苯酚-硫酸法進行測定多糖，標準曲線見圖1。把葡萄糖的毫克數作為橫坐標，吸光度值（波長490 nm）作為縱坐標，得到葡萄糖標準曲線的回歸方程為：Y=6.718 8X，相關系數R2=0.999 1。隨后測定出多糖樣品的吸光度，根據標準曲線的回歸方程，計算出試驗樣品中多糖的含量。

1.3.2 試驗設計

1.3.2.1 單因素試驗

1）最佳物料粒度的確定

圖1 苯酚-硫酸標準曲線Fig.1 Standard curve of phenol-vitriol

設置料液比1∶30（g/mL），固定微波功率為400 W，超聲波功率為200 W，超聲波時間35 min，提取溫度60 ℃，超聲波提取 1 次，乙醇和濃縮液之比 3 ∶1（體積比）。將粉碎后的蛹蟲草菌體粉末分別通過孔徑為0.106 mm（140 目）、0.125 mm（120 目）、0.150 mm（100 目）、0.180 mm（80目）、0.250 mm（60 目）的篩網進行過濾，按照多糖提取工藝流程進行試驗，探究物料粒度對多糖提取率的影響，進而確定最佳的物料粒度[15]。

2）最適料液比的確定

采用得到的最佳物料粒度，固定微波功率為400 W，超聲波功率200 W，超聲波提取時間35 min，提取溫度為 60 ℃，提取次數 1 次，乙醇和濃縮液之比 3 ∶1（體積比）。調節料液比分別為 1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60、1 ∶70（g/mL），按多糖提取工藝流程進行試驗，探索料液比對多糖提取率的影響，進而確定合適的料液比。

3）最佳超聲波功率的確定

采用得到的最佳物料粒度和料液比，固定微波功率為400 W，超聲波時間為35 min，提取溫度60 ℃，提取次數設為1 次，乙醇和濃縮液之比3 ∶1（體積比）。設置超聲波功率分別為 100、200、300、400、500 W，按照多糖提取工藝流程進行試驗，探究超聲波功率對多糖提取率的影響，進而確定出最佳的超聲波功率。

4）最佳超聲時間的確定

采用得到的最佳物料粒度、超聲波功率和料液比，固定微波功率為400 W，提取溫度調節到60 ℃，提取次數設定在1 次，乙醇和濃縮液之比3 ∶1（體積比）。調節超聲波時間分別為 20、25、30、35、40 min，依照多糖的提取工藝流程進行試驗操作，分析超聲波提取時間的改變對多糖提取率的影響，進而確定最佳的超聲波時間。

5)最適提取溫度的確定

采用得到的最佳物料粒度、超聲波功率、超聲波時間和料液比，固定微波功率為400 W，提取次數1 次，乙醇和濃縮液之比在3 ∶1（體積比）。設定提取溫度分別為 40、50、60、70、80 ℃，按照多糖提取工藝流程完成試驗操作，研究提取溫度對多糖提取率的影響，進而得到合適的提取溫度。

6）最適超聲提取次數的確定

采用得到的最佳物料粒度、超聲波功率、超聲波時間、提取溫度和料液比，固定微波功率為400 W，乙醇和濃縮液之比在3 ∶1（體積比）。超聲波提取次數分別為 1 次、2 次、3 次、4 次、5 次，按多糖提取工藝流程進行試驗，研究超聲波提取次數對多糖提取率的影響，進而確定合適的超聲波提取次數。

7）最佳乙醇與濃縮液之比的確定

采用得到的最佳物料粒度、超聲波功率、超聲波時間、提取溫度、超聲波提取次數和料液比，固定微波功率為400 W。調節乙醇與濃縮液之比（體積比）分別為 1 ∶1、2 ∶1、3 ∶1、4 ∶1、5 ∶1，按照多糖提取工藝流程進行試驗操作，研究分析乙醇與濃縮液之比對蛹蟲草多糖提取率的影響，進而確定出最佳的乙醇與濃縮液之比。

1.3.2.2 正交試驗

固定微波功率為400 W，選取7 個影響蛹蟲草多糖提取效果的主要因素，即物料粒度、料液比、超聲波功率、超聲波時間、提取次數、提取溫度、乙醇與濃縮液之比，進行七因素三水平的正交試驗。

正交試驗因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.3.2.3 蛹蟲草多糖對小鼠脾細胞增殖的影響[14]

頸椎脫臼處死小鼠，無菌條件下取脾，磨碎，過不銹鋼篩網，在1 000 r/min 條件下離心10 min，收集脾細胞，然后RPMI-1640（Roswell Park Memorial Institute-1640）不完全培養液洗滌，進行活細胞計數（臺盼藍染色法），用RPMI-1640 完全培養液（含10%的小牛血清）進行調整，使細胞密度達到 2×106（個/mL），制備成脾細胞懸液。于96 孔酶標板中加入100 μL 細胞懸液（每孔都加）。陰性對照：再加完全培養液20 μL；陽性對照：Con A（刀豆蛋白A）和完全培養液各加10 μL；試驗組：Con A（刀豆蛋白A）和樣品溶液各加10 μL。其中，陰性對照、陽性對照和試驗孔，各設置3 個重復孔。將96 孔細胞培養板放入CO2飽和濕度培養箱（37 ℃，5%CO2）中培養。培養至 66 h 后加 10 μL 無菌噻唑藍（5 mg/mL，每孔都加）。培養至72 小時后，加入十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS，10%的SDS，每孔都加）終止反應，測定OD490nm值。結果以刺激指數（stimulate index，SI）來表示，SI 值大于 1 時，多糖樣品對小鼠脾淋巴細胞的增殖具有促進作用（反之則具有抑制作用），SI 值越高，表示多糖樣品對小鼠脾細胞增殖的促進作用越大，即免疫調節活性越大[16]。

樣品溶液：取蛹蟲草多糖樣品，配制成3 組不同劑量的溶液，分別為低劑量組（0.5 mg/mL）、中劑量組（1.0 mg/mL）和高劑量組（2.0 mg/mL）。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 物料粒度對多糖提取率的影響

物料粒度對蛹蟲草多糖提取率的影響如圖2。

圖2 物料粒度對蛹蟲草多糖提取率的影響Fig.2 The material size influencing for extractionrate of polysaccharide from Cordyceps militaris

物料粒度的大小將影響最終的多糖提取率，物料粒度越小即粉末越細時，菌絲體被充分粉碎，致使菌體中更多的多糖從中溶解出來，那么多糖的提取率也會相應升高，但是如果物料粒度太小，在提取過程中會出現焦糊現象，所以提取率又會有所下降。由圖2看出，物料粒度在0.150 mm 時提取率最高，蛹蟲草多糖提取率為5.09%。所以后續單因素試驗均采用物料粒度為0.150 mm。

2.1.2 料液比對蛹蟲草多糖提取率的影響

料液比對蛹蟲草多糖提取率的影響如圖3。

圖3 料液比對蛹蟲草多糖提取率的影響Fig.3 The ratio of material to liquid influencing for extraction rate of polysaccharide from Cordyceps militaris

在提取的過程中的加水量將對多糖的提取率產生影響，伴隨著試驗中加水量的增加，多糖溶出越充分，多糖的提取率變大，但過多的加水量又會降低提取率，可能是由于超聲波破碎細胞的阻力變大，提取率降低。由圖3 可知，料液比為1 ∶40（g/mL）時多糖提取率最高，蛹蟲草多糖提取率為5.20%。所以后續單因素試驗采用料液比 1 ∶40（g/mL）。

2.1.3 超聲波功率對蛹蟲草多糖提取率的影響

超聲波功率對蛹蟲草多糖提取率的影響如圖4。

圖4 超聲功率對蛹蟲草多糖提取率的影響Fig.4 The ultrasonic power influencing for extraction rate of polysaccharide from Cordyceps militaris

由圖4 可知，在一定范圍內超聲波功率與多糖提取率成正比，在功率300 W 時達到最大值，之后提取率又會顯現出有所降低，這主要是因為功率偏低時，超聲波空化作用偏小，進而提取率偏低，反之，提取率增大，但是如果超功率過大，反而會使溶劑中出現較多的空化氣泡，其產生的阻礙作用會降低多糖的提取率。超聲波功率在300 W 時多糖提取率最高，蛹蟲草多糖提取率為5.41%。所以后續單因素試驗采用功率300 W。

2.1.4 超聲波時間對蛹蟲草多糖提取率的影響

超聲波時間對蛹蟲草多糖提取率的影響如圖5。

圖5 超聲時間對蛹蟲草多糖提取率的影響Fig.5 The ultrasonic time influencing for extraction rate of polysaccharide from Cordyceps militaris

由圖5 可得，初期超聲波時間的加長，會使提取率升高，在30 min 時提取率最高，隨后卻出現了負相關趨勢，這可能是由于隨著超聲波輻射時間的加長，蛹蟲草菌體細胞壁充分破裂，致使越來越多的蟲草多糖流出，所以多糖的提取率也隨之升高，但時間逐漸加長也會導致部分蟲草多糖的糖苷鍵損壞，會有更多的蟲草多糖被降解，因此提取率又會降低。多糖提取的最佳超聲波時間為30 min，蛹蟲草多糖提取率為5.41%。所以后續單因素試驗采用超聲波時間為30 min。

2.1.5 提取溫度對蛹蟲草多糖提取率的影響

提取溫度對蛹蟲草多糖提取率的影響見圖6。

圖6 提取溫度對蛹蟲草多糖提取率的影響Fig.6 The extraction temperature influencing forextraction rate of polysaccharide from Cordyceps militaris

溫度的高低設定是多糖提取過程中不可以忽略的一個因素，由圖6 可知，溫度與多糖提取率成正比，到60 ℃是最高，然后隨著溫度的升高，多糖提取率雖然同樣呈現出增高的趨勢，但增長極其緩慢，再考慮到能源消耗問題，采用60 ℃即可。故多糖提取的最佳溫度為60 ℃，蛹蟲草多糖提取率為5.53%。所以后續單因素試驗采用提取溫度60 ℃。

2.1.6 超聲波提取次數對蛹蟲草多糖提取率的影響

提取次數對蛹蟲草多糖提取率的影響如圖7。

圖7 超聲波提取次數對蛹蟲草多糖提取率的影響Fig.7 The extraction times influencing for extraction rate of polysaccharide from Cordyceps militaris

在多糖提取過程中，提取次數對得率大小存在一定的影響，提取次數越少，溶出的多糖就會更不完全，提取率越低，由圖7 可知，提取次數從2 次開始，提取率增長極其緩慢，故綜合操作的簡易性和經濟因素，選擇提取2 次最佳，蛹蟲草多糖提取率為5.79%。所以后續單因素試驗采用提取次數2 次。

2.1.7 乙醇和濃縮液之比對蛹蟲草多糖提取率的影響

乙醇和濃縮液之比對蛹蟲草多糖提取率的影響如圖8。

圖8 乙醇和濃縮液之比對蛹蟲草多糖提取率的影響Fig.8 The ratio of ethanol to concentrate influencing for extraction rate of polysaccharide from Cordyceps militaris

分析圖8，得知當乙醇與濃縮液之比逐漸增大時，多糖提取率增大，到達最大值以后，又隨著乙醇與濃縮液之比的增大反而開始出現降低的趨勢。由圖8 可知，多糖提取率最大值出現在乙醇與濃縮液之比為4 ∶1（體積比）時，蛹蟲草多糖提取率為6.11%。所以多糖提取過程中乙醇與濃縮液之比最佳應控制在4 ∶1（體積比）。

2.2 L1（837）正交試驗優化提取蛹蟲草多糖工藝的研究

正交試驗優化數據分析結果見表2、表3。

表2 正交試驗對蛹蟲草多糖提取率影響分析Table 2 Orthogonal test analysis of the impact of extraction rate of Cordyceps militaris polysaccharides

續表2 正交試驗對蛹蟲草多糖提取率影響分析Continue table 2 Orthogonal test analysis of the impact of extraction rate of Cordyceps militaris polysaccharides

表3 正交試驗對蛹蟲草多糖提取率影響的顯著性分析Table 3 Orthogonal test of the impact of significant extraction rate of Cordyceps militaris polysaccharide analysis

由表2 可知，按照各個因素影響多糖最終得率的重要性可得：C＞A＞F＞G＞D＞E＞B，即超聲波功率＞物料粒度＞料液比＞乙醇與濃縮液體積比＞超聲波時間＞提取溫度＞提取次數，確定出了蛹蟲草多糖提取工藝的最佳試驗組合為：A2B3C2D2E3F2G2。由表3 可知，物料粒度和超聲波功率對蛹蟲草多糖提取的得率都表現出顯著影響。采用得出的最佳提取工藝組合進行后續驗證試驗，做3 個平行樣，通過計算平均數后得出蛹蟲草多糖得率為6.28%，高于熱水浸提法提取蛹蟲草菌絲體多糖的提取率（1.84%）[5]，也高于單獨采用超聲法提取蛹蟲草菌絲體多糖的提取率（5.57%）[10]或微波法提取蛹蟲草菌絲體多糖的提取率（5.78%）[17]，表明微波法和超聲波法協同提取蛹蟲草多糖具有意義。

2.3 蛹蟲草多糖對小鼠脾細胞增殖的影響

提取的蛹蟲草多糖對小鼠脾細胞增殖的影響見表4。

表4 蛹蟲草多糖對小鼠脾細胞增殖的影響Table 4 Effect of Cordyceps militaris polysaccharide on proliferation of mouse spleen cells

如表4 所示，蛹蟲草多糖低劑量組、中劑量組和高劑量組與對照組相比，SI 差異顯著（P＜0.05）；中劑量組和高劑量組與低劑量組相比，SI 差異顯著（P＜0.05）；中劑量組和高劑量組相比，SI 差異不顯著（P＞0.05）。低劑量組的SI 顯著低于中劑量組和高劑量組的SI，中劑量組對應的SI 最大，表明此劑量時蛹蟲草多糖對小鼠脾細胞增殖的促進作用最大，具有最強的免疫調節活性，但隨著劑量的提高，高劑量組的免疫調節活性與中劑量組相比卻呈現出下降的趨勢。該結果與朱軼鋒等的報道類似：朱軼鋒等研究了不同濃度的黃芪多糖對ConA 誘導的雞脾臟淋巴細胞增殖的影響，發現黃芪多糖對免疫調節活性有重要影響，在一定劑量范圍內，隨著黃芪多糖劑量的提高，免疫調節活性呈現先上升后下降的趨勢[18]。

3 結論

從正交試驗結果得出蛹蟲草多糖的最佳提取工藝條件是：物料粒度為0.150 mm，提取次數為3 次，微波功率400 W，超聲波功率為300 W，超聲波時間為30 min，提取溫度為 70 ℃，料液比為 1 ∶40（g/mL），乙醇與濃縮液體積比為4 ∶1。此條件下可得到多糖提取率為6.28%。超聲波功率、物料粒度對蛹蟲草多糖的得率均呈現出顯著的影響，其中，對蛹蟲草多糖得率影響最大的因素是超聲波功率。

蛹蟲草多糖低劑量組、中劑量組和高劑量組的SI均大于1，表明不同劑量的蛹蟲草多糖對小鼠的脾淋巴細胞增殖活性均表現出促進作用，蛹蟲草多糖能明顯提高小鼠的免疫調節活性。在一定劑量范圍內，隨著劑量的提高，免疫調節活性也相應的提高，但隨著劑量的進一步提高，免疫調節活性并沒有相應的提高，而是達到峰值后出現下降的趨勢，表明蛹蟲草多糖的免疫調節作用具有劑量效應，只有在適宜的劑量時才具有較高的免疫調節活性，其機理還需要進一步進行研究。本試驗僅檢測蛹蟲草多糖的免疫調節活性（細胞免疫試驗），接下來將做非特異性免疫試驗和體液免疫試驗[16]，進一步研究蛹蟲草多糖的免疫活性。