液液萃取-氣相色譜法快速測定發酵液中的己酸含量

趙晨婕，潘明，*，劉念，王超凱，3，4，常少健，3，4，張翼，3，4，劉義會，3，4，郭杰，3，4，蔡海燕，3，4，李覓，3，4，余航，3，4，孫中理，3，4，李斌

（1.四川輕化工大學，四川自貢643000；2.四川省食品發酵工業研究設計院，四川成都611130；3.釀酒生物技術及應用四川省重點試驗室，四川成都611130；4.國家固態釀造工程技術研究中心，四川瀘州646000；5.瀘州和榮酒業有限公司，四川瀘州646000）

己酸乙酯是濃香型白酒的主要香味物質[1-3]，其具有菠蘿以及香蕉樣香氣，且香氣閾值很低[4-6]。在濃香型白酒特定的釀造環境下，己酸乙酯主要是在窖池內由己酸菌產生的己酸和酵母菌產生的乙醇通過微生物的酯化作用合成的[7-10]。在己酸菌培養液中，己酸等有機酸的組成及其含量往往隨菌種的種類、純度和發酵工藝的變化而變化[11-12]，分析其中的有機酸組成與含量對開發己酸菌菌種資源、完善己酸菌發酵生產工藝條件和科學地指導白酒生產都具有極其重要的意義。因此，在己酸菌的篩選、培養過程中如何快速、準確測定發酵液中的己酸等有機酸的含量是非常值得研究的[13-17]。

目前測定己酸菌發酵液中己酸的方法主要有：比色法和氣相色譜法。比色法主要原理是，硫酸銅與發酵液中的己酸反應呈藍色，己酸含量越高藍色越深，通過測定溶液OD 值算出己酸含量[18]。該法雖然操作簡便，但是試驗過程中萃取劑為乙醚，對環境和人體的傷害較大[19]；氣相色譜法對白酒中的有機酸含量檢測較為準確，但是發酵液中的己酸存在于水相中，提取己酸的方法影響到檢測的準確性[20]。發酵液經蒸餾后，在毛細管色譜柱上直接進樣檢測[21]，由于己酸沸點較高，直接蒸餾提取效率低，造成的誤差較大，經乙醇溶解，甲酯化處理后再蒸餾，餾出液直接進氣相色譜檢測，雖然結果較準確，但甲酯化的過程時間較長，操作復雜[22]。本研究主要考察利用有機溶劑液液萃取-氣相色譜法快速定量測定己酸菌發酵液中己酸含量方法的穩定性，為進一步的試驗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

己酸菌發酵液：食品發酵實驗室自備；氯化鈉（分析純）、乙酸乙酯（色譜純）、二氯甲烷（色譜純）、正己烷（色譜純）、己酸（色譜純）、2－乙基正丁酸（色譜純）、乙醇（色譜純）：西隴化工廠；0.45 μm 微孔濾膜：津騰試驗設備有限公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 6820 氣相色譜儀配氫火焰離子化檢測器（flame ionization detector，FID）、P/N5190-1483 進樣針、白酒分析專用色譜柱（型號FFAP）：美國Agilent 公司；ALC-110.4 電子分析天平：賽多利斯科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 內標物溶液制備

精密量取2-乙基正丁酸2 mL 至100 mL 容量瓶，使用60%的色譜級純乙醇定容，混勻，制得0.368 g/L的內標物溶液，備用。

1.3.2 樣品預處理方法

量取適量樣品，調節溶液pH 值，用移液管移取5 mL 玻璃試管中，加入2 g 氯化鈉，振蕩混勻。用大肚移液管精確移取10 mL 萃取劑加入玻璃試管中。上下搖晃10 次～15 次，放于試管架靜置30 min 后。吸取上清液經0.45 μm 微孔濾膜過濾至5 mL 容量瓶中，定容，加標100 μL，待上機測定。

1.3.3 氣相色譜分析條件

色譜柱：白酒分析專用色譜柱（型號FFAP）（50 m×0.25 mm×0.5 μm）。

程序升溫：初始溫度47 ℃，保持5 min，以4.5 ℃/min的速率升溫至70 ℃，再以5 ℃/min 的速率升溫到98 ℃，維持 1 min，以 5 ℃/min 的速率升溫至 145 ℃，以5 ℃/min 的速率升溫至 190 ℃，以 10 ℃/min 的速率升溫至230 ℃，保持15 min；汽化室溫度250 ℃；檢測器溫度 250 ℃，載氣為高純氮氣（N2），柱流速：3 mL/min；分流比為 1 ∶1；進樣量：0.6 μL；進樣模式：分流；進樣方式：手動進樣；數據分析：Agilent Cerity QA-AC 工作站軟件。

2 結果與分析

2.1 己酸保留時間的確定

將己酸對照品處理后加內標100 μL，上機測定。色譜圖見圖1。

由圖1 可知，內標物和對照品均獨立出峰，2-乙基正丁酸和己酸保留時間分別為27.219 min 和28.962 min。

2.2 萃取劑選擇

分別以乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷作萃取劑，萃取同一發酵液中的己酸。按照1.3.2 節方法提取制備供試液，并按1.3.3 節條件進行氣相色譜法分析，記錄己酸峰面積。每種萃取劑做3 個重復試驗，結果見圖2。

相同濃度己酸溶液分別用相同體積乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷萃取，色譜峰面積可反映出不同萃取劑的萃取效果，峰面積越大說明該溶劑對己酸的萃取效果越好。由圖2 可知，3 種萃取劑萃取效果差異顯著（P＜0.05）。其中，乙酸乙酯的萃取效果最好，己酸平均峰面積為117.78，二氯甲烷的萃取效果次之，己酸平均峰面積為107.18，正己烷萃取效果最差，己酸平均峰面積為88.44。綜上所述，選取乙酸乙酯為萃取劑進行后續試驗。

2.3 發酵液pH值調節

圖1 己酸出峰時間Fig.1 Peak time of caproic acid

圖2 萃取劑萃取己酸效果Fig.2 Effect of extractant on caproic acid extraction

圖3 對己酸測定影響Fig.3 Effect of pH value on determination of caproic acid

由于己酸菌發酵產生的己酸會與發酵液中的物質發生反應，以鹽的形式存在于水相中，有機溶劑無法萃取，因此需調節發酵液的pH 值，利用強酸制弱酸的原理將己酸置換出來。以試驗室常用的硫酸和鹽酸作為備選pH 值調節劑。通過試驗發現，硫酸與萃取劑乙酸乙酯不互溶，鹽酸與萃取劑乙酸乙酯互溶。因此采用硫酸調節溶液pH 值不會對色譜柱造成損害。以1.5 mol/L 的硫酸將溶液 pH 值分別調整為 5、4、3、2、1，測定己酸含量的變化。每個試驗重復做3 個，結果見圖3。

由圖3 可知，發酵液pH 值從5 降低至2 的過程中，己酸含量從55.5 mg/100 mL 升至286.8 mg/100 mL，顯著升高。當pH 值達到2 時，再繼續降低pH 值到1，己酸變化不顯著。說明pH 值為2 時，發酵液中己酸從鹽的形式完全被置成酸。因此需要將發酵液pH 值調節至2，才能使己酸以游離態存在，保證后續檢測準確。

2.4 精密度試驗

精密度試驗考察濃度為55.0 mg/100 mL 的己酸溶液，用乙酸乙酯作萃取劑，按照1.3.2 節方法進行樣品前處理，進行氣相色譜法分析，分別平行測6 次，結果見表1。

表1 己酸精密度試驗結果（n=6）Table 1 Precision tests results of caproic acid

由表1 可知，已知濃度為55.0 mg/100 mL 的己酸溶液6 次測定結果在55.0 mg/100 mL～60.6 mg/100 mL之間，平均值為57.3 mg/100 mL，相對標準偏差RSD=3.46%，結果表明該方法精密度高。

2.5 加標回收率試驗

向濃度為129.6 mg/100 mL 的己酸菌發酵液中分別加入 50.0、100.0、150 mg/100 mL 的己酸標品，混勻。以乙酸乙酯作萃取劑按照1.3.2 節方法進行樣品前處理，進行氣相色譜法分析，每個濃度做3 個平行試驗，結果見表2。

由表2 可知，向濃度為129.6 mg/100mL 的發酵液中添加3 個濃度的己酸標品，回收率在98.19%～104.43%之間，相對標準偏差RSD 在2.19%～3.51%之間，己酸菌發酵液的pH 值低，且成分復雜，干擾因素多，該方法的回收率在80%～120%范圍內，相對標準偏差RSD 小于5%，說明該方法準確度良好。

表2 己酸加標回收率試驗結果Table 2 Adding standard recovery rate tests results of caproic acid

3 結論

在相同的己酸標準物添加量以及相同的氣相色譜條件下，使用乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷3 種不同的有機試劑作為萃取劑，萃取效果差異顯著。其中，乙酸乙酯的萃取效果最好，檢出己酸平均峰面積為117.78。pH 值為2 時，發酵液中己酸從鹽的形式完全被置成酸，此時己酸檢出含量最為準確。本試驗測定己酸的平均回收率在98.19%～104.43%之間，相對標準偏差RSD 在2.19%～3.51%之間，表明該方法準確度良好。