小檗紅堿及其衍生物的制備與應用研究進展

王國勝，齊飛，高藝偉，奚洋，張子陽

（沈陽化工大學化學工程學院，遼寧 沈陽 110042）

小檗紅堿 （berberrubine，BRB），也叫鹽酸小檗紅堿，分子式：C19H16NO4·Cl，相對分子質量：357.79，純度98%以上，紅色晶體，熔點245℃，可溶于酸性溶液，不溶于石油醚、氯仿等溶劑。儲藏要求避光、低溫下保存，保存溫度在2～8℃。小檗紅堿的分子結構特征與小檗堿的一樣同屬于異喹啉結構，也稱為脫甲基小檗堿，存在于許多中藥材中，如黃連，黃柏等。近年來，隨著小檗堿的臨床應用以及開發研究的深入［1-6］，小檗堿與小檗紅堿的轉化關系［7］，構效關系［8，9］以及小檗紅堿的藥理與毒理作用［10，11］引起了廣泛的重視，臨床中發現小檗紅堿也具有一定的體外抗菌活性、體內抗腫瘤活性以及調脂活性［12，13］，由于其作用機制與他汀類藥物完全不同且有良好的安全性，被認為有望取代他汀類藥物的新靶標藥。目前，隨著對小檗紅堿以及小檗紅堿衍生物的藥用以及臨床應用研究的深入，對小檗紅堿的制備必將引起關注。未來，小檗紅堿的工業化生產將成為急需解決的問題。同樣，加大小檗紅堿及其衍生物的制備技術、藥用機制、臨床應用以及應用領域的開發等無論在學術研究還是新藥開發領域都會成為新的熱點和增長點。

1 小檗紅堿的制備技術

1.1 天然產物的提取分離

小檗紅堿存在于黃連、黃柏、三顆針等中藥材中很早就已經被證明了。對鹽黃柏、二妙丸等的比照樣品分析表明［14-16］，其中，小檗紅堿相對于小檗堿的含量較少，含量僅僅在0.2%～1.3% （質量分數）。小檗紅堿最早是從歐小檗 （Berberis vulgaris L）中分離得到的，隨后，從黃連中分離出小檗紅堿也獲得成功［17，18］。對裂葉星果草采用乙醇提取，經過熒光切割、柱色譜純化和離心薄層制備得到鹽酸小檗紅堿［19］。由于中藥材中小檗紅堿的含量較少，由天然產物提取小檗紅堿的技術難以工業化。但是，提取得到的小檗紅堿的重要信息，如熔點、紫外、紅外、核磁、質譜等的分析數據為小檗紅堿的物性、性能以及開發利用提供了科學基礎。

1.2 中藥的炮制轉化

采用高效液相色譜測定不同炮制方法、不同炮制溫度對黃連酒灸品種的生物堿含量的變化研究表明［20］，酒灸黃連隨著加熱溫度的增加，生物堿在160℃時的含量最高，在170℃時出現新的化學成分小檗紅堿。對黃柏及其飲片的炮制過程中生物堿成分的變化研究［21-24］，得到同樣的結論。即隨著炮制溫度的變化，黃柏中的生物堿的成分發生了變化，生成新的化學成分小檗紅堿，其含量隨著溫度的升高而增加。上述研究不僅僅發現了生物堿成分的變化，更主要的是轉化的溫度，以及轉化為新的化學成分是小檗紅堿，這為以小檗堿為原料，通過去甲基化轉化為小檗紅堿的化學合成提供了有力的佐證。

1.3 小檗堿的代謝轉化

采用混合人肝微粒體和重組人源細胞色素酶對小檗堿的酶反應動力學研究表明［25］，小檗堿在體外混合人肝微粒體溫孵體系中的主要代謝途徑為O-去甲基化，可生成小檗紅堿。在對鹽酸黃連堿和小檗紅堿在人源細胞單層模型中的吸收研究表明［26］，給大鼠灌胃小檗堿，在血漿中檢測到其主要代謝產物為小檗紅堿。對小檗堿的藥動學和代謝研究表明［27］，采用液質聯用技術對健康自愿者和患者的血漿進行檢測，發現小檗堿的主要代謝產物是小檗紅堿，且小檗紅堿比小檗堿的親油性強，其藥物活性也比小檗堿強。對小檗堿的代謝過程以及代謝產物的研究，不僅證明了小檗堿的代謝產物為小檗紅堿，也為生物轉化制備小檗紅堿提供了新的思路。

1.4 小檗堿的脫甲基化

將鹽酸小檗堿經過氨水和氯仿處理得到氯仿小檗堿，將其裝入硅膠柱，用氯仿與甲醇過柱洗脫，能得到小檗紅堿［28］。同樣，小檗堿經過層析柱發生脫甲基化也能得到小檗紅堿［29］。研究表明［7，30］，小檗堿和小檗紅堿可以互相轉化。目前，通過將小檗堿脫甲基化制備小檗紅堿已成為實驗室經常采用的方法。

1）真空熱解技術［31］。以小檗堿為原料，在高于160℃條件下，采用高溫脫甲基化可得到小檗紅堿，但是收率低，副產物多，分離提純困難。在真空條件下，或者在二氧化碳與氮氣等惰性氣體保護得條件下，可減少副產物，提高收率。

2）成酯水解技術［32］。以小檗堿為原料，在鹽酸吡啶及醋酐中回流，C9位脫去甲基，同時酯化生成9-酰基-9-去甲基小檗堿。在氫氧化鈉溶液中水解生成小檗紅堿，總收率71%～88%。該法脫甲基溫度低 （140℃），產物純度和收率較高。

3）微波輔助技術［33，34］。以高沸點穩定性高的極性介質DMF為溶劑，采用微波輔助技術，400W，輻射15min，收率可達到98%。相比較真空熱解法，具有快速、節能、產率高的優點。

4）催化脫甲基化［35］。以鹽酸小檗堿為原料，采用甲苯為溶劑，加入無水氯化鋁，在110℃條件下，回流反應1h，可制取小檗紅堿。該方法的優點是反應溫度可顯著降低，但是，仍然需要分離提純。

5）置換脫甲基［36］。鹽酸小檗堿與鹽酸吡啶在160～170℃的油浴中攪拌加熱至溶解，保溫條件下，繼續攪拌，混合物固化，冷卻后，加無水乙醇溶解，過濾得到固體，溶于熱水中，活性炭脫色，濾液加丙酮后，放置得到紅色針狀結晶。該反應可能是鹽酸吡啶通過置換反應奪甲基生成甲基吡啶鹽酸鹽，該方法提純精制過程繁瑣，且收率低。

以小檗堿為原料，通過去甲基化得到小檗紅堿是目前小檗紅堿制備的主要技術路線，僅限于實驗室研究，還沒有工業化生產技術。該技術不僅佐證了中藥炮制過程中小檗堿含量變化的情況，而且也證明了小檗堿與小檗紅堿的可逆性制備［7］。但是，必須清醒地認識，該技術是以小檗堿為原料合成小檗紅堿，不僅消耗了產量有限的小檗堿，同時也注定了增加了藥物的成本。研究開發替代化學原料的小檗紅堿的化學合成方法是未來研究的熱點。

2 衍生物與藥理作用

目前，對小檗紅堿的代謝過程及動力學研究表明［7，10，11，37-39］，小檗紅堿在人體內可快速吸收，且分布在腎、肝、脾和心等臟器，可經過肝與腎代謝。一定劑量的小檗紅堿對腎臟呈現毒性，但是，C-9位的糖脂化物無毒，這也為小檗紅堿C-9位衍生物的合成及應用提供了理論依據。隨著小檗紅堿的藥理作用研究發現［40］，其抗腫瘤作用、降血脂血糖作用、抗微生物作用、抗炎作用、對心血管系統的作用以及抗氧化作用引起了廣泛的關注，而且，小檗紅堿的衍生物表現出優于小檗紅堿本身的臨床醫療效果，尤其對小檗紅堿的C-9位的修飾改性成為了研究熱點［41-48］。

2.1 C-9-O-衍生物

2.1.1 親油性

1）抗癌活性。以真空裂解小檗堿得到的小檗紅堿為原料，在乙腈溶液中，堿性條件下與氯芐回流反應合成9-O-芐基化合物，通過常規的倍半稀釋法和MTT法分別進行抗菌和細胞毒實驗表明［49］，衍生物的活性有所提高，抗菌活性比小檗堿提高30倍，含氯素芐基引入后活性更強，對人肺癌和人宮頸癌細胞的增殖有較強的抑制作用。將萜烯基引入C-9-位生成9-O-萜烯基小檗堿［50］，表明親油性基團的引入，表現出對癌細胞的生長的抑制性和活性。

2）抗菌抗炎活性。以氮氣保護熱解小檗堿得到的小檗紅堿為原料，在乙腈溶液中，與4-氯丁氧苯反應得到9-苯氧丁基小檗堿，體外抑菌實驗表明［51］，對常見致病菌體現了良好的抗菌活性，對耐藥產氣菌的效果最佳，其次是大腸桿菌、痢疾桿菌、鏈球菌和耐甲氧西林金葡菌，其抗菌效果其中對耐藥產氣菌和大腸桿菌的抑制作用最為明顯，與小檗堿相比提高了16倍。將甲硝唑與苯三唑引入 C-9-位［52，53］，均表現出較好的抗菌性作用。將含有CF3—，NO2—，CN—等基團的甲苯引入C-9-位［54］，表現出較高的抗菌和抗真菌活性，作用機制為衍生化合物通過氫鍵、π-π，π-陽離子、π-陰離子等與目標DNA緊密鍵合。

3）動脈粥樣硬化。采用高溫真空條件下，選擇性脫出9-位甲基，在堿性條件下，以酯鍵、酰胺鍵等作為連接臂，在小檗紅堿的9-位引入短鏈烷基、剛性基團、雜環以及取代芳環等不同類型取代基，涉及合成多個衍生物。對其抑制由白細胞介素 （IL-6）誘導的轉錄激活因子 （STAT）的磷酸化進行研究表明［55］，9-位剛性基團的引入有利于活性的提高，通過抑制過程磷酸化，進而抑制介導的炎癥反應，為新型抗動脈粥樣硬化候選藥物提供了良好的構效關系和科學依據。

4）阿爾茲海默癥。將鄰苯二酚和對苯二酚引入C-9-位［56］，其衍生物表現出優異的抗氧化活性以及淀粉樣蛋白的Aβ聚集，其中鄰苯二酚衍生物表現出優異的阿爾茲海默癥治療效果。將含氮苯環引入C-9-位［57］，其衍生物具有較好的抗膽堿酯酶活性與抗炎活性，是有潛力的抗阿爾茲海默癥化合物。將環己基氨基和烷基苯酚引入C-9-位［58，59］，其衍生物與乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶的動力學以及分子模擬研究表明，兩者的對接模式是通過催化活性位與外圍陰離子位點連接的。將噻吩以及氟代苯甲酰基團引入C-9-位［60］，其衍生物對逆轉錄酶的抑制活性研究表明，修飾的小檗堿具有抗HIV活性，且毒性較小。

5）降脂降糖。將親油性基團，如烷基醇、芳基醇等引入C-9-位［61］，構建系列酯類或者醚類活性化合物。研究表明酯類 （棕櫚酸酯）的引入有明顯的降膽固醇作用，可作為安全的口服降脂藥物，并且可提高口服小檗紅堿的生物利用度。將肉桂酸引入C-9-位［62］，生成肉桂酸小檗堿酯，顯著提高了低血糖癥活性，可作為可開發的新型抗2-型糖尿病藥物。

2.1.2 親水性

對小檗堿的C9位進行親水性修飾，合成了9-O-小檗堿糖苷同系物。對SD大鼠灌胃給藥實驗表明［63］，9-O-小檗堿糖苷同系物在口服生物利用度方面與小檗堿相比有顯著的優勢，為小檗堿的9.3倍。對大鼠灌胃給藥9-O-小檗堿葡萄糖苷，結果表明［64］，9-O-小檗堿葡萄糖苷具有明顯的體內降血糖與調節葡萄糖代謝異常能力。

2.1.3 二聚體

通過小檗紅堿與6-海藻糖單對甲基苯磺酸酯和6，6’-海藻糖雙對甲基苯磺酸酯的反應得到單聯和雙聯衍生物。采用熒光光譜實驗分析其與DNA作用發現［65］，單聯體衍生物與DNA的結合能力與小檗堿相當，而雙鏈體衍生物與DNA的結合能力比小檗堿提高了約7倍。由聚四乙二醇醚將兩個小檗紅堿鏈接得到二聚體［66］，在二聚體與銅離子配比為1∶1時，通過先插入DNA使其多醚鏈形成具有金屬離子配位能力的構型，然后與銅離子形成對DNA具有斷裂功能的活性中心。對乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶的作用研究表明［67，68］，可形成雙抑制位點，顯著提高其抑制作用。將黃芩黃素引入C-9-位［69］，形成小檗堿與黃芩黃素的偶聯體，等同于二聚體聯合兩個藥的效果，具有降脂防聚集作用，是潛在的肥胖治療藥物。研究表明［70-73］，二聚體或者偶聯體衍生物與DNA之間的作用均比單體的小檗堿或者小檗紅堿有所增強。

2.2 C-12，13-衍生物

2.2.1 C-12-

將氨甲基引入小檗紅堿的C-12-位［74］，抗糖尿病活性的增強表明有利于2-型糖尿病的控制與治療。以正丁烷為溶劑，將咪唑與甲醛在110℃，進行小檗紅堿的 C-12-位修飾［75］，通過其與DNA作用研究表明具有較強的抗菌活性。將小檗紅堿進一步還原為四氫小檗紅堿，繼續在其C-12-位引入苯并咪唑基團，其衍生物與DNA作用研究表明［76］，含氟苯并咪唑基團抗菌和殺真菌活性最好。

2.2.2 C-13-

以小檗堿為原料，在甲苯溶液中，采用氯化鋁催化法，回流條件下去甲基得到小檗紅堿。分別在小檗紅堿的8、13位引入乙酰基、芐基和 （3′，5′-二硝基）芐基得到不同的小檗紅堿衍生物。對金黃色葡糖球菌、白色念珠菌、魯西特念珠菌、克柔念珠菌和隱球菌的抗菌實驗表明［35］，在小檗紅堿的13位引入芐基的化學結構修飾，能夠顯著提高抗菌活性，可能是修飾的產物具有更高的新脂性，可增強細胞膜的滲透性。在C-13-位引入4-異丙基苯基團或者叔丁基苯基團［77，78］，都表現出較強的抗菌活性，且口服安全性相對較高。

在保留小檗紅堿的異喹啉結構、二亞甲氧基、氮三角形結構以及C-9-甲氧基的同時，深入研究不同位置、不同基團的修飾與衍生，甚至二聚體或者偶聯體的開發，尤其是結合已經證明有效的小分子作用基團的引入，都將是小檗紅堿及其衍生物未來開發和研究的熱點。

3 小結

1）利用代謝轉化生成小檗紅堿的原理，積極開展生物合成小檗紅堿不失為一條可行的方案。

2）加快研究替代原料，積極開展化學合成小檗紅堿，不僅可減少小檗堿的消耗，同時可降低生產成本，并工業化生產小檗紅堿，為小檗紅堿的深入研究和應用開發提供制支撐。

3）繼續對小檗紅堿的代謝以及毒性的深入研究，實現可控給藥或者吸收，提高口服的絕對生物利用度。

4）加大對小檗紅堿及其衍生物的開發，開展小檗紅堿及其衍生物在抗阿爾茲海默癥、抗癌以及降糖等方面的研究和臨床應用研究，必將帶來較大的社會和經濟效益。

5）利用酸堿條件下小檗紅堿的酮與烯醇的互變異構原理，開發小檗紅堿基化學傳感器新技術。

6）在保持小檗紅堿的作用靶點的前提下，將已經證明的有效治療小分子與其二聚或者偶聯，未來可能產生神奇的治療效果。