植物Na+，K+/H+反向轉運體：pH 平衡與囊泡運輸

王立光 葉春雷 陳軍 朱天地 李靜雯

（甘肅省農業科學院生物技術研究所，蘭州 730070）

細胞內穩定的pH 微環境可以保證植物在生物和非生物脅迫下進行正常的生命活動和生長發育［1］。植物正常生長發育細胞內精準的pH 調控不僅調節酶活性和細胞代謝活動，還調節細胞生長、DNA 復制、RNA 和蛋白合成等生理活動［2-4］。植物根毛的形成與細胞內pH 變化密切相關，根毛形成過程中，首先根毛起始發生部位細胞壁酸化，當酸化過程停止，根毛起始過程結束，頂端開始生長，且細胞壁酸化的同時，胞質pH 發生改變［5-6］。擬南芥中研究成果表明，生長素是通過質外體pH 調節促進根細胞擴張［7］。另外，氣孔的開閉過程中，保衛細胞內的pH 存在相應的變化，氣孔打開過程中保衛細胞胞質pH 降低，氣孔關閉過程中保衛細胞胞質pH 升高［2，8］。研究發現細胞內pH 調控系統是植物在長期進化過程中獲得的抗逆機制，強化細胞pH 調控能力可提高植物抗性［9-11］。在環境科學研究中，可以通過測定樹葉汁液的pH 來研究樹種抗毒氣污染能力，從而進行綠化樹種的選擇［12-13］。如植物抗氟能力是由葉片細胞的pH 值和等電點的差值，即“耐酸力”決定的［14］。越來越多的證據表明，pH 的變化在植物細胞中扮演者第二信使或信號的角色［15-17］。

細胞內的囊泡運輸既是生命活動的基本過程，又是一個極其復雜的動態生物學過程，伴隨整個生長發育階段。囊泡運輸包含出芽、運輸、錨定和融合等過程，涉及到多種調控因子和蛋白質。研究表明，動物細胞內的囊泡運輸出現障礙會導致細胞功能紊亂和許多重大疾病的發生［18］。植物細胞膜上的各種功能蛋白、細胞壁合成所需的各種酶類及元件、細胞外分泌蛋白及物質都由細胞內囊泡運輸完成。植物細胞囊泡運輸在植物營養、應對環境脅迫、光響應、激素轉運及信號響應和特異性防御響應等過程中發揮重要作用［19-20］。植物內有多條囊泡運輸途徑，很多結構蛋白和調控蛋白參與到這些途徑中，通過影響囊泡運輸調控植物生長發育［21-26］。

Na+，K+/H+反向轉運體（NHX）屬于一價陽離子/H+反向轉運體（Cation/proton antiporter，CPA）基因家族中的CPA1 亞家族，它們廣泛存在于植物、動物、酵母和細菌等生物體內。植物NHX 常以多基因家族形式存在，并在細胞內廣泛分布。根據亞細胞分布，植物NHX 基因家族成員分為質膜NHX（Plasma membrane NHX），液胞NHX（Vacuolar NHX）和內膜NHX（Endosomal NHX）3 類。植物NHX 最先由Ratner 從大麥質膜上發現，此后在甜菜貯藏組織中檢測到液胞NHX 活性［27-28］，但第一個被克隆到的植物NHX 成員是擬南芥AtNHX1［29］，后續大量植物NHX 基因被鑒定、克隆。植物NHX的離子轉運驅動力由質膜H+-ATPase（P-ATPase）、液胞膜H+-ATPase（V-ATPase）和H+-PPiase 產生的H+電化學勢梯度提供［30-32］。大量研究表明，維持細胞內pH、離子穩態及胞內正常的囊泡運輸對細胞活動及功能至關重要，而植物NHX 是植物體內重要跨膜反向轉運蛋白，對維持pH、離子平衡及囊泡運輸具有重要作用，并在細胞各種生理生化過程中擔當重要角色，包括滲透調節、逆境響應及細胞生長等生理生化過程［33-39］。本文綜述了植物NHX 在pH 平衡、囊泡運輸方面的研究進展。

1 植物NHX 調節胞內pH 平衡

真核生物細胞被生物膜區分為很多區室，各區室的pH 并不是均一的，而是存在差異。pHluorin 作為一類pH 敏感的熒光蛋白，在不同的pH 條件下，其激發光譜和發射光譜將會發生變化，可以反映其所在區域的H+濃度，將pHluorin 與特異定位的蛋白融合并進行表達，就能對不同亞細胞結構內的pH進行測定［40］。對植物細胞器和膜微囊的pH 測定表明，膜微囊運輸的分泌途徑中各細胞器區室內的pH存在差異，總體上從內質網（ER）到液胞表現為一個逐漸酸化的體系，但也有大量報道稱反面高爾基體管網狀狀結構（TGN）內的pH 比液胞前體（PVC）的低［33，41-45］，這些進展為NHX 在pH 調節中的作用研究奠定了基礎。

植物NHX 家族成員分布在質膜、液胞膜和內膜系統上，且介導Na+，K+與H+的跨膜反向轉運，那么NHX 在介導離子轉運過程中對胞內各區室的pH 穩定有怎樣的作用呢？釀酒酵母中ScNHX1基因缺失后液胞和胞質的pH 明顯降低，突變體菌株對酸性pH 的耐受性減弱［46-47］。擬南芥中質膜AtNHX7/SOS1 缺失將導致胞質和液胞的pH 降低，影響pH 動態平衡［48-50］。植物液胞NHXs 也與胞內pH 動態平衡有密切關系。牽牛花的花色變化是由液胞內pH 的改變實現的，牽牛花液胞pH 為6.5 時花為紅色，液胞pH 為7.5 時花為藍色，而InNHX1基因突變后花色改變受阻，進一步研究發現，引起牽牛花花色改變的pH 變化是由增強InNHX1、V-ATPase和H+-ATPase 的表達和活性實現的［51-53］。擬南芥nhx1 nhx2雙突變體的研究發現AtNHX1和AtNHX2基因缺失將導致根伸長區、成熟區細胞和胚軸細胞液胞pH 顯著降低，對根尖細胞液胞pH 沒影響［45］。進一步對擬南芥其它液胞NHXs 研究發現，單獨敲除AtNHX1或AtNHX2基因不能改變根細胞液胞的pH，即使敲除AtNHX1或AtNHX2基因的同時再敲除AtNHX3和AtNHX4基因，也不能明顯改變根細胞液胞pH［54］，這些結果表明，AtNHX1 和AtNHX2 有功能冗余，這在氨基酸序列上也得到了體現，它們的相似度達到87.5%，同時證實在擬南芥液胞NHXs成員中，主要調節pH 的為AtNHX1 和AtNHX2，并不是所有成員都具有顯著作用。Andres 等［8］發現，AtNHX1 和AtNHX2 調節氣孔開閉過程中，可以有效地調控液胞pH。另外有報道顯示，煙草HbNHX1基因過表達可以使葉片表皮液胞pH 升高，沉默使pH 降低，表明其對維持pH 平衡具有調節作用［55］。這些研究表明，在植物中質膜和部分液胞NHXs 參與胞內各區室的pH 調節，從而使pH 微環境向植物生長有利方面改變。

內膜NHXs 定位在ER、高爾基（Golgi）、TGN和PVC 等內膜系統的膜結構上，其功能研究相對滯后。Martinier 等［41］將擬南芥內膜NHXs 轉入煙草細胞發現，轉基因煙草細胞的液泡分選受體（Vacuolar sorting receptor，VSR）、TGN 及PVC 等的pH 升高，證明了內膜NHXs 參與調節內膜系統內各區室的pH穩態。Reguera 等［39］構建了nhx5 nhx6雙突變材料，并利用pHluorin 與特異定位的蛋白對VSR、Golgi、TGN 和LPVC 內的pH 進行了測定，結果發現nhx5 nhx6雙突變植株內這些區室的pH 與野生型相比都顯著降低。同時，Wang（王立光）等［35］利用微電極法和pH 敏感的熒光探針BCEFF 測定了nhx5 nhx6雙突變植株葉片細胞液和根細胞液胞的pH，也得到了相似結果，即nhx5 nhx6雙突變植株葉片細胞液和根細胞液胞的pH 低于野生型植株。Fan（樊立剛）等［37］在證實ANHX5 和AtNHX6 也存在于ER上的同時，發現nhx5 nhx6雙突變植株細胞內ER的pH 顯著低于野生型，從而證明內膜AtNHX5 和AtNHX6 具有調節ER 內pH 的功能。這些研究成果雖然證明植物內膜NHXs 調節pH 的區室不同，但使植物內膜NHXs 具有調節細胞各區室pH 的功能得到了證實，也使內膜NHXs 行使調節pH 功能的區室部位得到完善。同時，這些研究都表明內膜NHXs 的缺失導致這些區室pH 降低，這也說明在正常生長條件下區室酸化將不利于植株生長發育，植物要進行正常的生理活動，各區室需維持一定的pH。

以上研究結果表明，NHX 調節機制在維持各個區室pH 穩態的過程中發揮重要作用。P-ATPase 和V-ATPase 等建立pH 梯度，NHX 作為質子滲漏機制，從而對各區室的pH 進行調節，當加入P-ATPase、V- ATPase 或NHX 的抑制劑，將改變這些區室的pH 平衡，相似的結論在動物細胞內也得到驗證［43，56-58］。植物NHX 在高鹽和鉀營養脅迫等條件下，可以通過其離子反向轉運功能，使離子外排或者區室化，從而減輕毒害。而與此同時，細胞內一些區室H+的變化也伴隨發生，這表明此時H+的轉運也是利于植物減弱脅迫的反應。同時，各區室的pH 改變應該也利于植物抵抗脅迫。但這種pH 的改變會持續多久，是否有其它的作用機制對pH 再次進行調節目前還未知，這很可能是植物NHX 增強其抗逆性的另一個潛在調節機制。另外，從已有的研究結果預示NHX對外界環境pH 的適應調節也可能發揮重要作用，尤其是在增強堿性或酸性土壤環境植物生存能力方面，但目前相關研究還未見報道。

2 植物NHX 影響囊泡運輸

植物有著復雜的內膜系統，使蛋白的合成、加工和運輸有著多元化的途徑，這些過程需要經由囊泡運輸途經多個區室完成［21-22］。對植物NHX 的亞細胞定位及功能研究表明，NHX 主要存在于分隔區室的膜上，并調節囊泡運輸，從而影響蛋白轉運和存貯。NHX 對囊泡運輸的影響最早在scnhx1酵母突變體內得到證實，發現突變體內Pep12p、Vps10p和Vph1p 蛋白在液胞旁的類“class E”間隔內積累，并且部分Vma2p 蛋白也聚集在此處，并未完全進入液胞，說明其囊泡運輸過程被部分阻斷［59］。Bowers 等［59］將酵母ScNHX1 與植物、動物及細菌的NHX 蛋白序列比對分析發現，它們的跨膜區域存在4 個保守的酸性氨基酸殘基（D201、E225、D230和E355），在酵母中將這4 個氨基酸殘基分別突變變為不帶電荷的極性氨基酸殘基（D201N、E225Q、D230N 和E355Q），其 中D201N、E225Q 和D230N3個氨基酸殘基中的任何一個突變都會導致酵母表現出scnhx1突變菌株表型，說明這3 個保守的酸性氨基酸序列對ScNHX1 功能及其對囊泡運輸具有決定性作用。同時，Qiu（邱全勝）等［60］報道酵母ScNHX1 缺失導致液胞融合活力降低，但不影響可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子結合蛋白受體（Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factorattachment protein receptor，SNARE）復合體的形成，ScNHX1參與從次級內體（Late endosomes）到液胞的囊泡運輸過程和液胞融合的起始過程。Mitsui 等［47］發現ScNHX1 通過將Vps27p 招募到內膜上，從而促進多泡體（MVB）形成。而Kallay 等［61］研究結果表明，ScNHX1 參與囊泡運輸是在內體（endosome）或MVB 形成后到液胞的過程，并獨立于ESCRT 途徑。這些結果雖然對ScNHX1 參與囊泡運輸的過程有不同的解析，但都表明了酵母ScNHX1 參與囊泡運輸，影響蛋白轉運、融合和存貯。另外，在動物內RNAi沉默NHE6 和NHE8 也會導致內體運輸和再循環中斷［62-63］，證實其參與囊泡運輸。既然在酵母、動物中NHX 具有這些功能，那么在植物中的是否具有相似功能呢？這些研究方法和成果為植物NHX 的研究奠定了基礎。

植物中關于質膜NHX 在囊泡運輸中作用的研究還未見報道，但液胞NHX 參與囊泡運輸的作用已有報道。Sottosanto 等［64-65］發現擬南芥atnhx1突變體內多個與囊泡運輸相關基因的轉錄水平受到影響。Hamaji 等［66］證實鹽脅迫下植株內AtNHX1 會定位在胞質內的膜微囊上，這表明在鹽脅迫條件下，AtNHX1 很可能參與了囊泡運輸。內膜NHX 的研究直接證實植物NHX 參與囊泡運輸。Bassil 等［67］發現與野生型植株相比，內膜NHX 缺失雙突變體nhx5 nhx6內FM4-64 被運輸到液胞的時間變長，進一步通過用GFP 標記的CPY（carboxypeptidase）瞬時表達發現，突變植株不能像野生型植株內那樣使其進入液胞，而是聚集到質外體。轉錄分析發現，在nhx5 nhx6內VTI12、VSR1、VPS35、RABF2a 和ARFa1e 等與囊泡運輸相關蛋白的轉錄水平都發生了改變［67］。Reguera 等［39］通過透射電鏡發現，雙突變體nhx5 nhx6的種子內PSV（Protein storage vacuoles）的數目增多，而體積變小，種子貯藏蛋白2S 和12S主要分布在質外體，并非PSV 內，同時，種子內存在大量p2S 和p12S 貯藏蛋白的前體蛋白，這表明缺失突變體內囊泡運輸中的蛋白轉運和液胞融合過程受到影響。進一步分析發現擬南芥內膜NHX 的缺失導致液胞分選受體2；1（Vacuolar sorting receptors2； 1，VSR2；1）與運輸物（Cargoes）間結合作用降低，從而導致囊泡運輸受到影響［39］。Ashnest 等［68］在雙突變體nhx5 nhx6種子內也發現PSV 具有相同的形態且p2S 和p12S 貯藏蛋白的前體蛋白也較多，同時雙突變體nhx5 nhx6胚中液泡加工酶（Vacuolar processing enzyme，VPE）會被錯誤的運輸到質外體。Ashnest 等［68］研究表明AtNHX6 的C 端與細胞分選復合體（Sorting machinery）的組分SNX1（Sorting nexin 1）具有相互作用，從而影響VSR 從TGN 回送ER，調節囊泡運輸。Wu（武學霞）等［36］發現人工貯藏蛋白GFP-CT24 在雙突變體nhx5 nhx6內不能像野生型中被運輸到PSV 中，而是被運輸到質外體，同樣，甘薯液胞貯藏蛋白與綠色熒光蛋白的融合蛋白Spo：GFP（Sporamin：green fluorescent protein）在雙突變體nhx5 nhx6的原生質體細胞內70%表現為非液胞表達模式，遠遠高于野生型原生質體細胞內29%的非液胞表達模式，同時在雙突變體nhx5 nhx6種子內存在大量2S 白蛋白和12S 球蛋白的前體蛋白，且這些前體蛋白主要分布在質外體。他們還發現AtNHX5 中的D164、E188、D193和AtNHX6 的D165、E189、D194 中的任何一個保守氨基酸殘基突變，都將影響種子貯藏蛋白的運輸。另外，雙突變體nhx5 nhx6內SNARE 的SYP22 和VAMP727 在PVC 中的亞細胞定位受到影響，致使它們被滯留在Golgi 和TGN 內，從而阻擾SNARE 調控PVC 和液胞間融合的過程，對囊泡運輸途徑產生不利影響［36］。Dragwidge 等［38］證明雙突變體nhx5 nhx6細胞內的內膜運動降低，Golgi 和TGN/EE（Early endosomal）內蛋白回收受阻，說明內膜NHX 對于功能性Golgi 和TGN/EE 活力、TGN/EE 蛋白質回收是必須的。

雖然目前報道出多個內膜NHX 調節蛋白運輸和存貯的分子機制，但都表明擬南芥內膜NHXs 參與調節囊泡運輸過程，且內膜NHX 所存在的ER、Golgi、TGN 和MVB/PVC 等特殊位置，是很多蛋白合成和運輸的必經部位，很可能影響一些與囊泡運輸相關關鍵蛋白的運輸或后期修飾加工，從而進一步調節其它囊泡運輸途徑，這也可能是出現多個調解機制的原因，后續研究中或許將發現更多的調節機制。

3 總結和展望

隨著研究的深入，植物NHX 的功能逐漸從質膜NHX、液胞NHX 到內膜NHX 得證實，為全面深入了解植物NHX 提供了依據［69-70］。在植物體內，pH穩態的決定因素還不確定，已知H+-ATPase 和H+-PPiase 可以建立H+電化學勢梯度，為NHX、CHX和KEA 等離子反向轉運體提供驅動力［32］，表明細胞內pH 的動態平衡，需要H+泵建立pH 梯度，同時需要陽離子/質子（H+）反向轉運體作為質子滲漏機制，微調細胞內各區室的pH。研究表明NHX缺失導致pH 改變的情況下，植物通過囊泡運輸重塑細胞的過程出現障礙，這兩者往往是伴隨發生的，這說明NHX 對pH 的調節與囊泡運輸密切相關。植物NHX 定位于質膜，液胞膜和內膜系統的膜結構上，對各個區室pH 具有調節作用，而這些位置都是蛋白合成、加工、修飾的部位，任何一個部位pH 的改變都可能影響參與囊泡運輸相關蛋白的翻譯及翻譯后加工、修飾過程，也可能影響囊泡運輸過程中的囊泡出芽或膜融合過程，從而對植物生長發育造成不利影響。這也表明，植物NHX 對囊泡運輸的影響很可能通過調節pH實現。在一些離子脅迫條件下，植物NHX 會通過將離子外排及區室化等減輕毒害，同時，這必須伴隨著H+在一些區室的轉移，勢必會影響這些區室的pH，而pH 的改變將影響囊泡運輸中一些蛋白的編碼、修飾及加工等，同時也將對囊泡運輸的各過程造成影響，而這些都是植物在規避不利的非生物脅迫條件下的自主選擇。這就暗示，植物在遭受離子脅迫時，H+在各區室的轉移，造成囊泡運輸發生改變，可能是規避危害的一種方式或者還有其它途徑來重新調節各區室的H+濃度，使各區室pH 盡量恢復到脅迫前水平，保證囊泡運輸免被影響。目前，植物遭受離子脅迫的研究機理主要集中在陽離子轉移方面，而pH 平衡方面研究的還比較少，植物NHX 調節一價陽離子脅迫的研究如果從pH 和囊泡運輸方面著手，可能是新的研究領域。

目前，對植物NHX 的研究雖然已經取得了一系列進展，但大部分研究主要在模式植物擬南芥中進行，且關于NHX 是否在植物遭受外界環境酸、堿脅迫中的作用研究還相對較少，尤其是在農業種植中，由于過量使用化肥導致土壤酸化和鹽堿地等，其研究將更有意義。在遭受pH 脅迫時，NHX 很可能通過自身對pH 的調節作用，維持胞內pH 的穩態，并在一定范圍內保障很多關鍵蛋白的合成、加工，從而使囊泡運輸得以順利進行，為自身細胞塑造提供保障，進而減弱逆境脅迫。因此，在一些抗逆性強的植物內鑒定和克隆NHX，并對其相關功能進行研究將對生產具有重要意義。