外源L-天冬氨酸納米鈣抑制棉花生長的效應(yīng)及潛在機制

劉亞林，閆 磊，曾 鈺，賈志賢，姜存?zhèn)}

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)微量元素研究中心，資源與環(huán)境學(xué)院，武漢 430070）

由于納米材料具有比一般材料更加獨特、優(yōu)異的磁、光、電、聲、熱、力及化學(xué)特性，而被廣泛應(yīng)用在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域[1]。在使用過程中，不可避免地有一部分納米顆粒（Nanoparticles，NPs）會隨工業(yè)廢棄物和廢水排放到環(huán)境當(dāng)中[2]，對環(huán)境造成一定的影響。隨著納米技術(shù)的快速發(fā)展，為了應(yīng)對納米材料對環(huán)境的危害，納米材料的毒性評價受到越來越多的關(guān)注。

研究表明，大多數(shù)金屬NPs如納米氧化鋅（ZnONPs）、納米氧化鈦（TiO2-NPs）、納米銀（Ag-NPs）、納米氧化銅（CuO-NPs）等都會改變植物的生長狀態(tài)，對植物生長產(chǎn)生影響。對耐銅型海洲香薷的研究表明，CuO-NPs處理顯著抑制了植株根系伸長，使生物量下降[3]。但高濃度CuO-NPs（＜50 nm）對擬南芥種子的發(fā)芽率并未產(chǎn)生影響[4]。Ag-NPs對黃菖蒲的早期生長階段進行處理后發(fā)現(xiàn)，其在培養(yǎng)后期能顯著降低黃菖蒲生長速率[5]，同時其也抑制了擬南芥根系的伸長和葉片的膨大[6]。ZnO-NPs處理顯著抑制了黑麥草的苗期生長，對其產(chǎn)生毒害作用[7]。TiO2-NPs處理會使玉米根細胞壁孔徑減小，水勢減弱，生長速率受抑[8]。但也有研究表明，添加TiO2-NPs溶液能夠提高葉綠素含量，并促進黃瓜對P、K養(yǎng)分的吸收和根系生長[9]。Ag-NPs能顯著抑制擬南芥的生長，降低其光合作用并引起DNA損傷[10]，這種現(xiàn)象在一年或多年生黑麥草的研究中也被發(fā)現(xiàn)，CuO-NPs能引起黑麥草基因突變和氧化修飾[11]，并導(dǎo)致活性氧（ROS）含量升高，產(chǎn)生氧化脅迫[12]。植物自身會產(chǎn)生一系列的調(diào)節(jié)機制，大量的ROS會被SOD、POD等抗氧化酶所清除[13]，同時植物本身也會調(diào)控葉片光合色素含量以適應(yīng)這種脅迫[14]。但也有研究表明，利用納米材料開發(fā)的納米肥料可控制釋放調(diào)節(jié)植物生長和增強靶標(biāo)活性。

作為新型鈣制劑，L-天冬氨酸納米鈣[Calcium L-aspartate nanoparticles，Ca（L-asp）-NPs]結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、水溶性好、人體吸收率高，是具有生物活性的有機酸鈣，其作為人體鈣營養(yǎng)強化劑已被廣泛應(yīng)用[15]，但其進入環(huán)境后的風(fēng)險性評價鮮有報道。本文以南方常見經(jīng)濟作物棉花為試驗材料，設(shè)置不同濃度的Ca（L-asp）-NPs處理，測定植株干鮮質(zhì)量、根系形態(tài)、元素含量、葉綠素、抗氧化酶、MDA、電導(dǎo)率等指標(biāo)，以期為深入揭示Ca（L-asp）-NPs納米顆粒對植物的毒性效應(yīng)及對環(huán)境的影響機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和設(shè)計

試驗材料為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花遺傳育種研究室提供的鄂抗8號棉花種子，種子用濃硫酸（98%）脫絨露出黑色的種殼后隨即用清水洗凈殘留的硫酸，然后將種子放入36℃烘箱中烘干48 h以破除種子休眠。破除休眠的種子，用60℃的溫開水浸泡6 h至種皮發(fā)軟，將浸泡好的種子置于紗布上，再用兩層紗布覆蓋，轉(zhuǎn)入30℃培養(yǎng)箱暗中催芽48 h，此過程中不定期澆水以保持種子濕潤。發(fā)芽后的種子轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)箱（溫度：白天30℃/黑夜18℃，光強：10 000 lx）進行培養(yǎng)，待長出兩片真葉后，在4月22日將其移到5 L的黑色塑料桶中進行全營養(yǎng)液培養(yǎng)，每桶移栽兩株。營養(yǎng)液配制參考阿夫多寧和Arnon的配方并略有改 動[16]：0.240 g·L-1NH4NO3，0.100 g·L-1Na2HPO4·12H2O，0.100 g·L-1NaH2PO4·2H2O，2 mg·L-1KCl，0.360 g·L-1CaCl2·2H2O，0.500 g·L-1MgSO4·7H2O，0.22 mg·L-1ZnSO4·7H2O，1.81 mg·L-1MnCl2·4H2O，0.09 mg·L-1（NH4）6Mo7O24·4H2O，1.2 mg·L-1H3BO3，0.08 mg·L-1CuSO4·5H2O，48.5 mg·L-1EDTA-Fe。

1.2 測定項目及方法

1.2.1 生長指標(biāo)和生物量的測定

植株收獲時，每個處理隨機選取3株棉花，用直尺測量整株植株的高度和主根長度，取其平均值作為測量值。用Epson Perfection V700型根系分析儀對根系形態(tài)進行掃描，利用WinRHIZO根系分析系統(tǒng)分析植株總根長（Total length，TL）、根表面積（Total sur?face area，TSA）、根總體積（Total root volume，TRV）、根平均直徑（Average diameter，AD）和根尖數(shù)（Forks，F(xiàn)）等根系形態(tài)指標(biāo)。樣品收獲后用超純水沖洗干凈，將植株分為根、莖和葉3部分，分別測定各部位的鮮質(zhì)量，然后將樣品放于105℃烘箱中殺青30 min，然后在70℃下烘干至恒質(zhì)量，稱量干質(zhì)量[17]。

1.2.2 鈣含量的測定

棉花根、莖、葉片的鈣含量用干灰化-原子吸收分光光度法測定[18]。即將烘干稱質(zhì)量的樣品磨碎過篩，取0.1 g樣品放置于坩堝中，用電爐碳化后轉(zhuǎn)入馬弗爐在500℃條件下干灰化4 h后移出，用0.1 mol·L-1的HCl溶解稀釋后用原子吸收光譜儀測量鈣含量。鈣的轉(zhuǎn)移因子（TF）按照下列公式計算：

式中：Cashoot代表地上部鈣含量；Caroots代表根部鈣含量。

1.2.3 葉綠素含量的測定

稱取0.2 g新鮮葉片，去中脈后剪碎放在50 mL比色管中，加入25 mL 95%的乙醇，封口后黑暗中放置24 h，搖勻，以95%的乙醇為空白測量665、649、470 nm處的吸光度，色素濃度（mg·L-1）按照下式計算[19]：

土地經(jīng)過整理后，郭書鳳種上了大白桃品種桃樹，還在稍微差些的地里種上了核桃和麥黃杏等。機遇是給有準(zhǔn)備的人的，郭書鳳就這幾塊零零碎碎的加起來二畝地的果園，經(jīng)過精心管理，很快就要開始有收益了。

（1）葉綠素a Chl a=13.95A665-6.88A649

（2）葉綠素b Chl b=24.96A649-7.32A665

（3）類胡蘿卜素

1.2.4 根系抗氧化酶活性、MDA含量、電導(dǎo)率的測定

取0.5 g新鮮根，加入5 mL 50 mmol·L-1磷酸緩沖液（PBS，pH=7.8），在預(yù)冷的研缽上磨碎后轉(zhuǎn)入10 mL離心管中離心成勻漿（20 min，4℃，10 000×g），收集上清液作為酶提取物。超氧化物歧化酶（SOD，EC 1.15.1.1）采用氮藍四唑光還原法測定，過氧化物酶活性（POD，EC 1.11.1.7）采用愈創(chuàng)木酚氧化法測定，抗壞血酸過氧化物酶活性（APX，EC 1.11.1.11）和過氧化氫酶活性（CAT，EC 1.11.1.6）以及MDA含量在用分光光度計（UV-1800，Mapada）測量不同吸光度下的光密度（OD）后計算求得，電導(dǎo)率由電導(dǎo)儀測定并計算求得[19]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)處理，Duncan新復(fù)極差法進行單因素方差分析及顯著性檢驗（ANOVA，SPSS Statistics 20.0），Origin 8.6pro作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度Ca（L-asp）-NPs對棉花生長的影響

不同濃度外源Ca（L-asp）-NPs對棉花的生長均產(chǎn)生抑制作用，且隨其濃度的增加，抑制作用顯著增強（圖1A）。與對照相比，棉花株高在外源添加25 mg·L-1Ca（L-asp）-NPs時便開始出現(xiàn)顯著下降，株高減少約 14%，50、75、100 mg·L-1處理時，下降率為37%、30%、35%，均達顯著水平，但此3個處理之間無明顯差異（圖1B）。主根根長在50 mg·L-1處理以后開始出現(xiàn)顯著差異，在50、75、100 mg·L-1處理時，根長減少了27%、34%、33%（圖1C），說明正常生長的棉花植株在外源添加Ca（L-asp）-NPs后，其地上部和地下部生長會受到顯著的抑制作用。

2.2 不同濃度Ca（L-asp）-NPs對棉花植株生物量的影響

對棉花植株的干鮮質(zhì)量進行分析發(fā)現(xiàn)，Ca（L-asp）-NPs濃度不同時，植株根、莖、葉的干鮮質(zhì)量差異顯著（表1）。根系鮮質(zhì)量最大出現(xiàn)在75 mg·L-1處理，最大干質(zhì)量出現(xiàn)在25 mg·L-1處理。隨著Ca（L-asp）-NPs濃度的增加，莖的干鮮質(zhì)量顯著下降，且在100 mg·L-1時達到最小值，此時與對照相比干鮮質(zhì)量分別減少66%和63%。葉的干鮮質(zhì)量最小值也出現(xiàn)在100 mg·L-1，與對照相比分別減少52%和50%。但施入Ca（L-asp）-NPs后，植株的根冠比增大，這可能是由于棉花對Ca（L-asp）-NPs毒害所作出的適應(yīng)性改變。

2.3 不同濃度Ca（L-asp）-NPs對棉花鈣含量及其轉(zhuǎn)運的影響

如圖2所示，隨著外源Ca（L-asp）-NPs的施入，棉花植株根、莖、葉的鈣含量呈顯著先增加后減少的趨勢。根鈣含量和葉鈣含量最高出現(xiàn)在75 mg·L-1處理，分別為7905 mg·kg-1和38 117 mg·kg-1，比對照增加102%和51%，達到顯著差異水平，但施入量超過75 mg·L-1時，鈣在根和葉中的含量呈現(xiàn)下降趨勢。莖鈣含量最大出現(xiàn)在50 mg·L-1處理時，為13 144 mg·kg-1，比對照增加61%，此后鈣含量也呈下降趨勢。對鈣的轉(zhuǎn)移因子進行計算發(fā)現(xiàn)，與對照相比，鈣的轉(zhuǎn)移因子在Ca（L-asp）-NPs施入后顯著下降，其最小值出現(xiàn)在50 mg·L-1處理時，為6，這說明施入Ca（L-asp）-NPs嚴重抑制了鈣向地上部的轉(zhuǎn)移。

2.4 不同濃度Ca（L-asp）-NPs對光合色素含量的影響

如圖3所示，與對照相比，添加25 mg·L-1Ca（L-asp）-NPs對Chl a、Chl b的含量無顯著影響，但顯著提高了Car的含量。添加量超過25 mg·L-1時，Chl a、Chl b的含量顯著下降，而Car的含量與對照相比無顯著差異。Chl a/b的值在添加外源Ca（L-asp）-NPs時有明顯提升，這說明外源添加Ca（L-asp）-NPs對棉花光合色素的影響較大。

2.5 不同濃度Ca（L-asp）-NPs對根系形態(tài)指標(biāo)的影響

TL、TSA、AD、TRV、F是用來評價根系生長狀況的良好指標(biāo)，對這些指標(biāo)分析發(fā)現(xiàn)，外源施入Ca（L-asp）-NPs嚴重抑制了根系的生長（表2）。與對照相比，TL、TSA、TRV、F的值顯著減小，且都在施入100 mg·L-1Ca（L-asp）-NPs時達到最小值，下降率為71%、68%、62%、81%，而AD的值在顯著增大，在施入100 mg·L-1Ca（L-asp）-NPs時達到最大，為對照的120%。

2.6 不同濃度Ca（L-asp）-NPs對根系抗氧化酶活性的影響

由圖4可知，根系SOD、POD、APX、CAT活性在外源輸入Ca（L-asp）-NPs后顯著下降，SOD、POD、APX活性在100 mg·L-1處理時活性最低，而CAT活性最低出現(xiàn)在50 mg·L-1處理。4種抗氧化酶的活性都隨著外源Ca（L-asp）-NPs的施入而呈現(xiàn)減弱的趨勢，但在施入 50、75、100 mg·L-1Ca（L-asp）-NPs時，POD、APX、CAT的活性未出現(xiàn)顯著變化。

表2 不同濃度Ca（L-asp）-NPs對根系形態(tài)指標(biāo)的影響Table 2 Effects of different concentrations of Ca（L-asp）-NPs on root morphological parameters

圖2 不同濃度Ca（L-asp）-NPs對棉花鈣積累及轉(zhuǎn)運的影響Figure 2 Effects of different concentrations of Ca（L-asp）-NPs on Ca accumulation and transport in cotton

圖3 不同濃度Ca（L-asp）-NPs對葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量及葉綠素a/b的影響Figure 3 Effects of different concentrations of Ca（L-asp）-NPs on chlorophyll a，chlorophyll b，caroteneoid content and chlorophyll a/b

2.7 不同濃度Ca（L-asp）-NPs對根系MDA含量及電導(dǎo)率的影響

MDA含量常用來表示質(zhì)膜的過氧化程度。如圖5所示，添加25 mg·L-1Ca（L-asp）-NPs時，棉花根系MDA含量與對照相比顯著增高，而超過25 mg·L-1時，則顯著降低，說明外源Ca（L-asp）-NPs施入量達到一定值時，會顯著降低質(zhì)膜過氧化程度。對根系電導(dǎo)率的測定也更加驗證了這個結(jié)果。

3 討論

NPs進入環(huán)境被植物吸收后會對植物產(chǎn)生一系列的作用，根系是吸收NPs的第一器官。我們對棉花的試驗也發(fā)現(xiàn)，作為納米材料的Ca（L-asp）-NPs被施入后，顯著抑制了棉花生長，造成其株高和根長隨著濃度的增加而減小，并因此導(dǎo)致植株生物量下降，但在施入75 mg·L-1Ca（L-asp）-NPs時，根鮮質(zhì)量出現(xiàn)最大值，這可能與此時Ca（L-asp）-NPs的濃度、形狀和粒徑有關(guān)[20]，還有待進一步探究。

圖4 不同濃度Ca（L-asp）-NPs對根系抗氧化酶活性的影響Figure 4 Effectsof different concentrations of Ca（L-asp）-NPs on root antioxidant enzyme activities

植物的根冠是一個動態(tài)平衡系統(tǒng)，依賴與競爭并存，良好的根冠比能夠使植物更好地利用水分和營養(yǎng)，促進自身生長[21]。本研究表明，棉花的根冠比、AD在施入Ca（L-asp）-NPs后顯著增加，而TL、TSA、TRV、F等根系形態(tài)指標(biāo)顯著減少，這可能是根系的適應(yīng)性反應(yīng)。同時根系是植物吸收和轉(zhuǎn)運營養(yǎng)的主要部位，Ca（L-asp）-NPs處理后，植物根、莖、葉中的鈣含量都隨著處理濃度的增加呈先增加后減少的趨勢，說明一定濃度的Ca（L-asp）-NPs處理會增加棉花植株對鈣的吸收，但超過一定濃度后，即會抑制植物對鈣的吸收，這與氧化鈰納米顆粒（CeO2-NPs）施入土壤后根部鈰含量的吸收情況相同[22]，而與對CuO-NPs的研究不同，其研究表明根、莖、葉中的銅濃度隨著CuO-NPs濃度的升高而升高[3]，這可能是由于不同納米顆粒其本身性質(zhì)不同造成的。鈣的轉(zhuǎn)移因子（TF）定義為根冠鈣含量比[23]。研究表明，納米顆粒如CeO2-NPs、ZnONPs等處理會使植物的元素TF顯著降低[7，22]，本試驗結(jié)果也與此相同，這可能是由于大部分NPs吸附在根表或Ca（L-asp）-NPs較Ca2+更難運輸?shù)降厣喜肯鄳?yīng)部位所導(dǎo)致的[7]。

圖5 不同濃度Ca（L-asp）-NPs對根系MDA含量及電導(dǎo)率的影響Figure 5 Effects of different concentrations of Ca（L-asp）-NPs on MDA content and conductivity

葉綠素含量的高低能反映植物光合作用的強弱，而Chl a/b的高低能反映植物對光能吸收的強弱，其值越高，越不利于吸收光能[24]。本試驗表明，Ca（L-asp）-NPs處理后，Chl a和Chl b含量顯著下降，Chl a/b的比值升高，抑制了棉花的光合作用，從而抑制了其地上部的生長。大多數(shù)試驗證明，外源鈣的添加能夠減緩植物所遭受的逆境脅迫并提高葉綠素的含量[25-26]。但是對于NPs而言，Shi等[3]用CuO-NPs處理耐銅型海洲香薷后發(fā)現(xiàn)，隨著CuO-NPs濃度升高，葉綠素含量顯著降低。張傳玲等[27]研究發(fā)現(xiàn)，Ag-NPs處理擬南芥后能顯著減少葉綠素含量，降低其光合作用。本試驗結(jié)果也表明，Ca（L-asp）-NPs對植物生長的影響不僅是由其在溶液中析出的Ca所決定，很大一部分是與其NPs的性質(zhì)有關(guān)[3]。

抗氧化酶SOD、POD、APX、CAT是植物體內(nèi)產(chǎn)生的抵抗外界脅迫的防御酶[28]。研究表明，F(xiàn)e2O3-NPs、CuO-NPs等NPs處理植物后會通過顯著升高抗氧化酶活性清除產(chǎn)生的ROS等有害物質(zhì)，進而維持植株的正常生長[29-30]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，隨著Ca（L-asp）-NPs濃度的增加，根系4種抗氧化酶活性顯著降低，使質(zhì)膜的過氧化作用增加，從而產(chǎn)生更多的MDA，但試驗發(fā)現(xiàn)根系MDA除在25 mg·L-1處理時顯著升高外，其余濃度與對照相比均降低。這可能是由于低濃度的Ca（L-asp）-NPs更容易被根吸收；濃度較高時，納米顆粒的團聚現(xiàn)象使其不能輕易進入根細胞中，此時只有Ca（L-asp）-NPs析出的Ca2+進入，另外也可能是由于Ca（L-asp）-NPs吸附在根表，使?jié)B漏的離子不能進入溶液中[31]。

4 結(jié)論

（1）Ca（L-asp）-NPs進入環(huán)境中后會對植物生長造成一定的影響，抑制棉花生物量的積累和根系的生長，棉花自身通過形成良好的根冠比來適應(yīng)此脅迫。

（2）一定量的Ca（L-asp）-NPs處理會促進棉花對鈣的吸收，但Ca（L-asp）-NPs會降低葉片葉綠素含量，同時降低根系抗氧化酶活性、MDA含量和電導(dǎo)率，但其深入機制需要進一步探究。