規(guī)模化畜禽養(yǎng)殖場糞便中多重耐藥菌分離鑒定及其耐藥特征

唐偉欣，孫興濱，高浩澤，程首濤，仇天雷*，王旭明

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，哈爾濱 150040；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，北京 100097）

為了滿足消費者對禽畜產(chǎn)品日益增長的需求，我國的養(yǎng)殖模式已從散戶養(yǎng)殖轉(zhuǎn)向規(guī)模化、集約化養(yǎng)殖。伴隨著集約化禽畜養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，抗生素作為疾病預(yù)防和治療藥物、生長促進劑廣泛應(yīng)用于集約化畜禽養(yǎng)殖[1]。我國每年抗生素原料生產(chǎn)量約21萬t，其中有近一半的抗生素應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)[2]。而這些用于畜禽養(yǎng)殖的抗生素大多數(shù)不能被動物完全吸收，約有60%～90%的抗生素以原藥或初級代謝產(chǎn)物的形式排放到環(huán)境中，導(dǎo)致抗生素殘留，并引起環(huán)境中耐藥菌和耐藥基因的富集擴散[3-4]，如不經(jīng)有效的無害化處理，會給公共健康帶來嚴重威脅[5-6]。眾多研究證實，畜禽糞便已經(jīng)成為了自然環(huán)境中耐藥細菌和耐藥基因的“儲存庫”[7]。多重耐藥菌是指對臨床使用的3類或3類以上抗菌藥物同時呈現(xiàn)耐藥的細菌，牛天琦[8]利用卡那霉素等8種抗生素平板從雞糞中分離并鑒定了多株多重耐藥菌，集中分布于厚壁菌門、放線菌門、變形菌門中。張昊等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在含有四環(huán)素、環(huán)丙沙星及慶大霉素的平板上，從豬糞、雞糞中分離出的多重耐藥菌主要為埃希氏菌屬、不動桿菌屬、變形桿菌屬、依格納季氏菌屬和費克藍姆菌屬。Yang等[10]在雞糞樣品中檢測到包括大腸埃希氏菌（Escherichia coli）、糞產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenesfaecalis）和腸球菌（Enterococcus spp）在內(nèi)的多種抗生素耐藥的致病菌。但以上研究多集中于養(yǎng)殖糞便中抗生素耐藥微生物的分離及鑒定，對豬、牛、雞等不同養(yǎng)殖來源糞便以及有機肥中多耐藥細菌特征的對比研究并不多見。

由于四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類和磺胺類抗生素是我國畜禽規(guī)模化養(yǎng)殖常用的抗生素[11]，這四類抗生素多重耐藥菌的存在會對畜禽養(yǎng)殖造成危害，如果糞污處理不當會造成一定的環(huán)境及健康風(fēng)險。因此，本研究從我國北方地區(qū)的典型集約化養(yǎng)殖場采集了肉雞、蛋雞、肉牛、奶牛、生豬5種不同禽畜糞便，以及糞源有機肥樣品。首先，通過對四環(huán)素、恩諾沙星、磺胺甲惡唑和泰樂菌素4類抗生素的多重耐藥菌計數(shù)，了解不同養(yǎng)殖糞污中多重耐藥菌的污染狀況及堆肥前后多重耐藥菌的數(shù)量變化特征；其次，通過對多重耐藥菌的分離、純化及16SrDNA基因全長對比，確定所獲得的耐藥菌株的分類地位；通過藥敏試驗，探討不同養(yǎng)殖糞便來源的多重耐藥細菌對不同抗生素的耐藥分布情況；最后，通過擴增整合子基因盒，總結(jié)畜禽糞便中多重耐藥菌的可移動元件特征。本研究為了解禽畜糞便中常見的多耐藥微生物種類及其耐藥特征，以及養(yǎng)殖糞污處理對耐藥微生物的有效控制等方面均提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品的來源、采集及含水率測定

本次試驗所需用的畜禽糞便采取5點混合取樣的方法，共采集16個樣品，分別是雞糞樣品5種（蛋雞2種，肉雞3種）、牛糞樣品4種（奶牛2種，肉牛2種）、豬糞3種、雞糞有機肥2種、豬糞有機肥2種，每種樣品各20 g。雞糞及豬糞有機肥樣品均采自養(yǎng)殖小區(qū)的堆肥設(shè)施，采樣季節(jié)堆肥輔料以秸稈為主。采集糞便樣品后，迅速帶回實驗室于4℃保藏，在24 h內(nèi)進行耐藥菌的計數(shù)和含水率測定。

1.2 培養(yǎng)基的配制

將溶化的LB固體培養(yǎng)基降溫至50℃左右后，加入4種抗生素后倒平板。抗生素的最終濃度為：四環(huán)素16 μL·mL-1，恩諾沙星1 μL·mL-1，磺胺甲惡唑76μL·mL-1，泰樂菌素1 μL·mL-1。同時設(shè)置不加抗生素的LB培養(yǎng)基平板，進行細菌總數(shù)的測定。

1.3 多重耐藥菌的計數(shù)、分離及篩選

稱取10 g糞便或有機肥樣品，倒入裝有已滅好菌的90 mL生理鹽水的三角瓶中，制成均勻的懸液。按10倍法進行系列稀釋，稀釋到10-6。土壤懸液涂布接種：空白板選取 10-3、10-4、10-53個稀釋度，添加抗生素板選取10-2、10-3、10-43個稀釋度。待土壤懸液吸收后將平板倒置于28℃恒溫箱中，培養(yǎng)48 h。取出平板，選取菌落數(shù)在20～200的平板進行計數(shù)。同時隨機挑選5個單菌落，接種新平板并培養(yǎng)48 h。隨后多次劃線純化后，將獲得的菌液與30%甘油等體積比混合后，保藏于-80℃冰箱中待用。

1.4 多重耐藥菌的分子鑒定

采用EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit試劑盒提取菌株DNA，PCR擴增16SrDNA基因，引物為：27F、1492R。PCR反應(yīng)體系為：PCR mix為12.5μL，forward primer及reverse primer均為1μL，ddH2O為9.5μL，template DNA為1μL，共 25μL。PCR反應(yīng)條件：初始變性98℃，3 min循環(huán)1次；變性98℃，10 s循環(huán)30次；退火55℃，10 s循環(huán)30次；延伸72℃，10 s循環(huán)30次；最終延伸72℃，3 min循環(huán)1次；4℃保持。待PCR反應(yīng)結(jié)束后，將擴增產(chǎn)物送到北京博邁德基因技術(shù)有限公司測序。

1.5 多重耐藥菌的耐藥性試驗

1.5.1 藥敏紙片

本次試驗采用藥敏紙片瓊脂擴散法（K-B）檢測細菌耐藥性，所用的抗生素紙片有頭孢噻呋、氟苯尼考、環(huán)丙沙星、青霉素、慶大霉素、諾氟沙星、氨芐西林、恩諾沙星、紅霉素、氯霉素、磺胺甲惡唑、左氧氟沙星、阿米卡星、四環(huán)素、頭孢哌哃。

1.5.2 涂布法測定細菌耐藥性

采用紙片法進行藥物敏感性檢測，具體試驗方法參照文獻[12]。

1.6 耐藥菌整合子擴增

1.6.1 Ⅰ、Ⅱ類整合子的擴增

對已有的85株菌株進行PCR擴增Ⅰ、Ⅱ類整合子基因，引物為：intlF、intlR；int2F、int2R。PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參考文獻[13]。待PCR反應(yīng)結(jié)束后，對擴增出的DNA進行電泳，有電泳條帶的則表示含有Ⅰ、Ⅱ類整合子基因。

1.6.2 Ⅰ、Ⅱ類整合子基因盒的擴增

對上述有電泳條帶的DNA進行PCR擴增Ⅰ、Ⅱ類整合子基因盒，引物為：intl-VF、intl-VR；int2-VF、int2-VR。PCR反應(yīng)體系為：PCR mix為20μL，引物為0.8μL，ddH2O為16.4μL，template DNA為2μL，共40μL。PCR反應(yīng)條件同上。待PCR反應(yīng)結(jié)束后，將擴增產(chǎn)物送到北京博邁德基因技術(shù)有限公司測序。

1.7 數(shù)據(jù)分析

利用軟件Origin 8.5進行試驗數(shù)據(jù)的整理和作圖；采用R語言LSD方法對不同種類樣品的計數(shù)結(jié)果是否存在顯著差異進行統(tǒng)計分析；利用MEGA-X軟件進行16SrDNA序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 養(yǎng)殖場糞污中多重耐藥菌概況

本文選擇四環(huán)素、恩諾沙星、磺胺甲惡唑和泰樂菌素作為典型抗生素，對17個養(yǎng)殖場糞便及有機肥樣品進行多重耐藥培養(yǎng)后計數(shù)，結(jié)果表明，所有糞樣品中，雞糞中多重耐藥菌絕對數(shù)量較高，范圍在8.23×106～8.61×107cfu·g-1；豬糞其次，范圍在 2.83×104～3.70×106cfu·g-1；牛糞最少，范圍在2.53×105～1.70×106cfu·g-1。而有機肥樣品中耐藥菌的絕對數(shù)量有明顯下降，其范圍在5.30×103～1.23×106cfu·g-1之間。

如表1所示，在糞樣品中，雞糞中耐藥菌平均絕對數(shù)量和相對數(shù)量均最高，耐藥菌的平均數(shù)量是4.26×107cfu·g-1，平均占比為29.14%；其次為豬糞，耐藥菌的平均數(shù)量是3.95×106cfu·g-1，平均占比為9.13%；而牛糞中耐藥菌的絕對數(shù)量和相對數(shù)量均最低，耐藥菌的平均數(shù)量是1.17×106cfu·g-1，平均占比為0.79%。與Yang等[10]研究結(jié)果類似，雖然生豬養(yǎng)殖過程中抗生素使用濃度和糞便中抗生素殘留均高于肉雞養(yǎng)殖，但雞糞中多重耐藥菌的比例都遠高于豬糞，這說明抗生素殘留濃度并不是多重耐藥菌多少的唯一決定因素，還與養(yǎng)殖動物腸道微生物組成相關(guān)。而養(yǎng)牛場中抗生素使用頻率和濃度均最低，這與牛糞中多重耐藥菌濃度較低的規(guī)律保持一致。統(tǒng)計分析表明，雞糞中多重耐藥菌數(shù)顯著高于其他糞源（P＜0.01）。

表1 養(yǎng)殖場糞污與有機肥中可培養(yǎng)多耐藥細菌計數(shù)結(jié)果Table 1 Counting results of culturable multi-drug resistant bacteria in farmmanure and organic fertilizer

在有機肥中，雞糞有機肥耐藥菌平均相對豐度最低，耐藥菌的平均數(shù)量是7.45×103cfu·g-1，平均占比為0.43%；而豬糞有機肥耐藥菌平均相對豐度最高，耐藥菌的平均數(shù)量是3.69×105cfu·g-1，平均占比為3.17%。雞糞有機肥中耐藥菌的絕對數(shù)量與雞糞相比下降了4個數(shù)量級，平均相對數(shù)量也同時降低，從29.14%下降到3.17%；豬糞有機肥中雖然平均絕對數(shù)量變化不大，但由于堆肥能夠減少總的微生物數(shù)量，使得多重耐藥微生物的相對數(shù)量有所下降，從9.13%下降到0.43%。統(tǒng)計分析表明，雞糞和豬糞中多重耐藥菌的比例顯著高于牛糞和有機肥，說明對雞糞和豬糞進行好氧堆肥能夠有效降低其中的多重耐藥菌的絕對數(shù)量和相對數(shù)量，而牛糞中多重耐藥菌數(shù)量相對較少。

2.2 養(yǎng)殖糞污中多重耐藥菌多樣性分析

通過多重耐藥培養(yǎng)基篩選、分離和純化，總共分離出75株多重耐藥菌，其中來自于雞糞源的有23株，豬糞源的有11株，牛糞源的有18株，有機肥來源的23株。經(jīng)16SrDNA序列全長測序及系統(tǒng)發(fā)育樹分析（圖2），75株菌共有32個種（Species）分布于17個屬、11個科、3個門中（表2）。

圖1 養(yǎng)殖場糞便中多重耐藥菌系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 1 Multi-drug resistant phylogenetic tree in farmmanure

表2 多重耐藥菌系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系Table 2 Phylogenetic relationships of multi-drug resistant bacteria

經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育樹圖分析表明，在門水平，禽畜養(yǎng)殖糞便中多重耐藥菌集中分布Proteobacteria、Firmicutes和Actinobacteria，這與王曉慧[14]研究的結(jié)果較為一致。其主要分布在Proteobacteria，有41株，包括雞糞源13株、牛糞源16株、豬糞源6株、雞糞有機肥源3株和豬糞有機肥源3株；其次是Firmicutes，有18株，包括雞糞源7株、雞糞有機肥源5株和豬糞有機肥源6株；在Actinobacteria中也有16株分布，包括雞糞源3株、牛糞源2株、豬糞源5株和雞糞有機肥源6株。在屬水平中，Escherichia中分離到的耐藥菌株數(shù)量最高，為13株，占總耐藥菌株數(shù)量的17.33%，該屬細菌在雞糞、豬糞、牛糞和有機肥中均有分離。Escherichia是動物糞便中常見的耐藥菌屬[15-16]，其分離源主要有豬糞、雞糞等[17]，我們應(yīng)更加重視其在環(huán)境中的傳播風(fēng)險。其次為Corynebacterium，占總耐藥菌株數(shù)量的14.67%，已有研究表明棒狀桿菌能夠引起嚴重的呼吸道感染、心內(nèi)膜炎、骨髓炎、肺炎等[18-19]。再次為Staphylococcus，占總耐藥菌株數(shù)量的9.33%，葡萄球菌也是重要的人畜共患致病菌，近年來MRSA[20-22]由于其超強的耐藥性而受到臨床和環(huán)境研究領(lǐng)域的廣泛關(guān)注，雖然本研究中并未發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌，但有兩個近源屬被分離，且都分離自有機肥，說明堆肥對葡萄菌屬耐藥菌的控制作用有限。最后為Kurthia，占總耐藥菌株數(shù)量的8%，目前，并未發(fā)現(xiàn)特庫氏菌為病原菌的明確記載，其廣泛分布于環(huán)境中，尤其是動物糞便中[23]。

通過對比不同養(yǎng)殖用途畜禽糞便中多重耐藥菌的數(shù)量及種類可知，在23株雞糞分離源的菌株中，有8株菌來自于蛋雞源，15株菌來自于肉雞源。蛋雞源中分離出的變形桿菌屬菌株最多，有3株，占37.5%；而在肉雞源中，分離出的庫特氏菌屬最多，有6株，占40%。其次是志賀氏菌屬，有5株，占33.33%。在18株牛糞分離源的菌株中，來自于奶牛源和肉牛源的株菌各為9株。奶牛源的菌株中，嗜冷桿菌屬比例最多，有4株，占44.44%，其次是埃希氏菌屬，有3株，占33.33%。肉牛源的9株菌中，分離出的埃希氏菌屬菌株最多，有5株，占55.56%。

在所有耐藥菌株中，僅在雞糞中分離出的菌有：Ignatzschineria cameli、Proteus mirabilis、Proteus penne?ri、Kurthia gibsonii、Lysinibacillus jejuensis、Glutamici?bacter halophytocola，其中Ignatzschineria是雞糞中主要的多重耐藥菌屬之一，并且其菌體內(nèi)攜帶有能夠整合多重耐藥基因的整合子結(jié)構(gòu)[10]。Proteusmirabilis是一種腐生性的條件致病菌，其自身的多重耐藥性可能與養(yǎng)殖場抗生素使用不規(guī)范有關(guān)[24-25]。Kim等[26]在豬糞中分離出Lysinibacillusjejuensis，本研究表明其分離源并不僅限于豬糞中。僅在牛糞中分離出的菌有KE701379_s、Psychrobacter faecalis、Psychrobacter pul?monis、Providencia alcalifaciens、Oblitimonas alkaliphi?la、Corynebacterium casei、Corynebacterium freneyi，嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）主要存在于魚類、家禽及肉制品中[27]，目前并未發(fā)現(xiàn)它的致病性。由于長期濫用廣譜抗生素，造成普羅威登斯菌屬（Providencia）對β-內(nèi)酰胺類、氟喹諾酮類、氨基糖苷類等11類的13種常用藥物高度耐藥[28]，此外王建昌等[29]也在一進口美國種豬新鮮糞便樣品中分離到一株blaNDM-1基因陰性的雷氏普羅威登斯菌；僅在豬糞中分離出的菌有Psy?chrobacter maritimus、Corynebacterium stationis，棒桿菌屬（Corynebacterium）的部分細菌是一類生豬鼻腔內(nèi)常攜帶的病原菌，目前有研究表明，其有可能通過空氣傳播給人類[30]。有機肥中耐藥菌與養(yǎng)殖糞便中有所不同，其主要分布在不動桿菌、假單胞菌、氣球菌和葡萄球菌屬內(nèi)，而在畜禽糞便耐藥菌中占優(yōu)勢的腸桿菌和棒狀桿菌并不占據(jù)優(yōu)勢，可能原因是腸桿菌和棒狀桿菌的耐熱性不好，在堆肥的高溫過程中多被有效殺滅，曾維揚[31]的研究中指出在60℃水浴處理0.5 min后，腸桿菌的死亡率高達99.9%。王曉慧[14]也指出棒狀桿菌在經(jīng)過高溫堆肥后也呈現(xiàn)下降趨勢，而革蘭氏陽性菌的Aerococcus和Staphylococcus相對有更好的耐熱性，因此在有機肥中更易于存活。續(xù)彥龍等[32]研究指出在堆肥第0 d，樣品中金黃色葡萄球菌濃度均達到108cfu·g-1，堆肥第7 d時，實驗組樣品中金黃色葡萄球菌即使降低至103cfu·g-1，但仍有較好存活。此外，Aerococcus和Staphylococcus同屬于厚壁菌門，許修宏等[33]指出，在堆肥中其相對豐度整體呈先升后降趨勢，在升溫期和高溫期相對豐度最高表明其耐熱性較好。

2.3 分離菌株的耐藥性特征

對23株雞糞多重耐藥菌樣品、18株牛糞多重耐藥菌樣品、11株豬糞多重耐藥菌樣品進行藥敏試驗，其抗生素耐藥檢測結(jié)果見表3～表5。

在雞糞中分離出的23株多重耐藥菌中，對15種抗生素的耐藥性由弱至強依次為：阿米卡星＜頭孢噻呋＜慶大霉素=左氧氟沙星＜頭孢哌哃＜氨芐西林＜青霉素=諾氟沙星＜四環(huán)素＜磺胺甲惡唑＜環(huán)丙沙星=恩諾沙星＜氯霉素=氟苯尼考＜紅霉素；而在牛糞中分離出的18株多重耐藥菌中，耐藥性由弱至強依次為：阿米卡星＜慶大霉素＜頭孢噻呋＜左氧氟沙星=環(huán)丙沙星=頭孢哌哃＜恩諾沙星＜氟苯尼考＜氯霉素＜諾氟沙星＜氨芐西林＜四環(huán)素=青霉素＜磺胺甲惡唑=紅霉素。在豬糞中分離的11株多重耐藥菌的耐藥性由弱至強依次為：阿米卡星＜頭孢噻呋=頭孢哌哃＜恩諾沙星＜青霉素=慶大霉素=氨芐西林=諾氟沙星＜左氧氟沙星＜環(huán)丙沙星＜氟苯尼考=氯霉素=磺胺甲惡唑＜四環(huán)素＜紅霉素。其中，3種分離源的菌株對紅霉素和四環(huán)素的耐藥性均高于70%，這可能與養(yǎng)殖過程中長期使用大環(huán)內(nèi)脂類和四環(huán)素類抗生素作為飼料添加劑有關(guān)，Pan等[34]檢測表明豬糞中四環(huán)素類抗生素殘留量達到764.4 mg·kg-1。除此以外，雞糞分離源菌株中檢測到耐藥率超過70%的抗生素有5種，為磺胺甲惡唑、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氯霉素及氟苯尼考。在牛糞分離源菌株中檢測到耐藥率超過70%的抗生素也有5種，為氯霉素、諾氟沙星、氨芐西林、青霉素及磺胺甲惡唑，它們常用于治療和預(yù)防疾病，Zhao等[35]對我國規(guī)模化養(yǎng)殖場畜禽糞便調(diào)查發(fā)現(xiàn)，環(huán)丙沙星、恩諾沙星在牛糞中含量分別為29.59 mg·kg-1和46.70 mg·kg-1。

蛋雞和肉雞分離源菌株耐藥性對比結(jié)果表明，在8株蛋雞分離源的菌株中，其對氟苯尼考、磺胺甲惡唑、紅霉素的耐藥率均達100%；而對頭孢哌哃及阿米卡星的耐藥率低于30%。與肉雞分離源的8株菌對比，除紅霉素耐藥率相同外，氯霉素和恩諾沙星的耐藥率也為100%；敏感率較高的是阿米卡星和頭孢噻呋。奶牛和肉牛分離源菌株耐藥性對比結(jié)果表明，兩者對磺胺甲惡唑和紅霉素的耐藥率均達到100%。在奶牛的分離源株菌中，其對頭孢稀類、氟喹諾酮類和氨基糖苷類抗生素耐藥率均低于50%，而耐藥率低于50%的肉牛分離源菌株中只有氨基糖苷類中的阿米卡星。

3類動物糞污中的多重耐藥菌均對養(yǎng)殖中常用的抗生素如氯霉素類、氟喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類、磺胺類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)脂類等抗生素有著較高的耐藥性，而對氨基糖苷類和頭孢稀類抗生素都有著較高的敏感率，尤其是對阿米卡星這種抗生素，豬糞中的多抗菌對其耐藥率為0，而在雞糞和牛糞中多抗菌的耐藥率也分別僅為13.04%和27.78%。楊永珍等[12]的研究也表明，在河南部分地區(qū)大多數(shù)雞志賀氏菌對氨芐/舒巴坦和阿米卡星較為敏感。佟盼盼[36]對來自東北和江蘇地區(qū)雞糞樣品中的大腸桿菌進行的藥敏試驗指出，其對四環(huán)素、環(huán)丙沙星、氯霉素、左氧氟沙星、慶大霉素耐藥率在50%以上，而對阿米卡星為敏感。對新疆耆縣規(guī)模化豬場大腸桿菌藥敏試驗顯示，對氨芐西林、氟苯尼考、慶大霉素、諾氟沙星及恩諾沙星這五種藥物耐藥率在26.5%～66.3%[37]，采集于武漢郊區(qū)規(guī)模化養(yǎng)殖場的樣品中分離的大腸桿菌對于頭孢噻呋、頭孢哌哃及阿米卡星的高敏率均在80%以上[38]。這表明不同地區(qū)多重耐藥菌的耐藥性都是類似的，與本研究相符。龐歌[39]在2010年研究顯示，針對河南區(qū)域雞源志賀氏菌的藥敏試驗，其對磺胺類及氟喹諾酮類抗生素耐藥性較高，而對氨基糖苷類抗生素較為敏感。由此可知，近些年來β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性有所提高。畜禽養(yǎng)殖動物發(fā)病的復(fù)雜性增加了抗菌藥物在臨床上的預(yù)防及治療用量，這使得來自于糞便的細菌也產(chǎn)生了嚴重的耐藥性。本研究也為日后養(yǎng)殖糞污處理過程中抗生素耐藥細菌的去除規(guī)律研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也使進一步改進糞污處理工藝的相關(guān)研究更易聚焦關(guān)鍵耐藥細菌和耐藥基因。

表3 雞糞中抗生素耐藥檢測結(jié)果（株）Table 3 Statistical results of antibiotic resistance test in poultry manure

表4 牛糞中抗生素耐藥檢測統(tǒng)計結(jié)果（株）Table 4 Statistical results of antibiotic resistance test in cow manure

表5 豬糞中抗生素耐藥檢測統(tǒng)計結(jié)果（株）Table 5 Statistical results of antibiotic resistance test in swine manure

2.4 多重耐藥菌的整合子構(gòu)成

整合子（Integrons）是耐藥基因傳播的重要參與者，它們常常能整合啟動子與新耐藥基因，雖然耐藥整合子本身不具有移動性，但其能與一系列耐藥基因的轉(zhuǎn)移和插入作用相關(guān)聯(lián)，對整合子結(jié)構(gòu)的解析有助于研究多重耐藥菌的進化及轉(zhuǎn)移能力評估。筆者對獲得的85株多重耐藥菌進行整合子檢測，結(jié)果表明，有69株菌含有Ⅰ類整合子基因，占81.2%；有50株菌含有Ⅱ類整合子基因，占58.8%。進一步對整合子的基因盒進行擴增，總共獲得了11種基因盒（表6），片段長度從0.8 kb到1.8 kb不等。在Ⅰ類整合子中有10個基因盒，其中分布較為廣泛的基因為氨基糖苷類耐藥基因aadA2 36%（n=12/33）和磺胺類耐藥基因dfrA17 33%（n=11/33）兩種，在雞糞、牛糞和有機肥中均有檢出。在Ⅱ類整合子中，僅有sat2-dfrA1一種基因盒檢出，片段大小均為1.2 kb，這一結(jié)果與Yang等[13]研究相類似，說明Ⅱ類整合子基因盒較為保守。

3 結(jié)論

（1）規(guī)模化畜禽養(yǎng)殖場糞便中，四環(huán)素、恩諾沙星、磺胺甲惡唑和泰樂菌素4種抗生素的多重耐藥菌污染狀況（絕對數(shù)量和相對數(shù)量）排序為雞糞＞豬糞＞牛糞，糞源有機肥中可培養(yǎng)的多重耐藥菌的絕對數(shù)量和相對數(shù)量均有所下降，說明堆肥是一種控制多重耐藥細菌的有效手段。

表6 分離菌株的抗生素耐藥性及其與整合子的關(guān)系Table 6 Antibiotic resistance of isolated strains and their relationship to integrons

（2）規(guī)模化禽畜養(yǎng)殖糞便中多重耐藥菌主要集中在Proteobacteria、Firmicutes和Actinobacteria3個門中，多重耐藥菌的優(yōu)勢屬為Escherichia、Corynebacteri?um、Kurthia；而有機肥樣品中多抗耐藥菌的優(yōu)勢屬與糞便中有所不同，為Staphylococcus和Glutamici?bacter。

（3）多重耐藥菌株的藥敏試驗結(jié)果表明，3類養(yǎng)殖動物糞便中的多重耐藥菌均對養(yǎng)殖常用抗生素如氯霉素類、氟喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類、磺胺類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)脂類抗生素等都有著較高的耐藥性；而對氨基糖苷類和頭孢稀類抗生素，尤其是阿米卡星都有著較高的敏感率。

（4）通過對Ⅰ、Ⅱ類整合子基因盒的擴增，明確了在養(yǎng)殖糞便和堆肥中廣泛存在的Ⅰ類整合子基因盒類型為aadA2和dfrA17，以及Ⅱ類整合子基因盒主要類型是sat-dfrA1。