典型養雞場及其周邊土壤中抗生素的污染特征和風險評估

涂 棋，徐 艷*，李二虎，師榮光*，鄭向群，耿以工

（1.農業農村部環境保護科研監測所，天津 300191；2.天津市農業生態環境監測與農產品質量檢測中心，天津 300193）

抗生素作為可抑制微生物生長、繁殖乃至殺死微生物的自然產生、部分合成或全合成的一類化合物，現已廣泛應用于動物感染性疾病的預防和治療以及促進畜牧業的增長[1]。我國作為世界上最大的抗生素生產和消費國，抗生素年用量約為1.62×108kg，其中52%用于牲畜[2]。在美國，每年銷售的1.35×107kg抗生素約80%用于動物生產[3]。然而應用于畜禽的抗生素無法被畜禽完全吸收，多達30%～90%的殘留化合物通過畜禽糞便或尿液排出[4]。大量抗生素殘留引起的細菌耐藥問題堪憂。有研究者發現，土霉素（OTC）和金霉素（CTC）是動物糞便中回收頻率最高的兩種抗生素，雞糞和豬糞中OTC濃度最高，分別達到 417 mg?kg-1[5]和 764 mg?kg-1[6]。Zhao等[7]檢測到雞糞中諾氟沙星的殘留濃度高達225 mg?kg-1。因此，畜禽糞便作為養殖環境中抗生素的重要存儲庫，成為周邊環境中抗生素的主要排放源[4]。值得關注的是，釋放到環境中的抗生素對本地微生物群落造成選擇性壓力，從而誘導出耐藥菌，引起大范圍細菌耐藥[8]。

目前，許多專家學者已經在養殖場及其周邊環境中檢測出了多種類且高殘留的抗生素。Zhi等[9]對天津市養殖場廢水處理過程中的廢水樣品的58種獸藥抗生素進行了分析，四環素類抗生素（TCs）在原廢水中的殘留濃度最高，尤其CTC的殘余濃度高達130.67±5.90 μg?L-1。趙晶等[10]發現上海市養殖場及周邊環境的不同采樣介質中喹諾酮類抗生素（QLs）均有較高檢出率（53.3%～100%），在糞肥和土壤中QLs濃度均值高于周邊地表水和蔬菜樣，表明QLs在糞肥-土壤-蔬菜系統中具有一定的遷移能力。成玉婷等[11]發現磺胺類抗生素（SAs）在有機蔬菜基地土壤中總濃度最高值為973 μg?kg-1，且檢出率均≥94%，推測因長期大量施用糞肥，致使土壤中含有大量有機質，這些有機質可與抗生素發生吸附作用使其在土壤中累積[12]。這些研究結果表明，糞肥的抗生素多種類不同程度被檢出并向周邊環境中遷移。

歐洲已在2005年完全停止使用抗生素作為生長促進劑[13]。中國政府也意識到抗生素濫用、過度使用及耐藥性等問題的嚴重性，已經頒布了一些相關的政策法規[14]。然而土壤中抗生素的殘留濃度仍處于較高水平，亟需評估其生態風險。常用的污染物生態風險評估方法主要有3種：風險商值法（Risk quotient，RQ）、物種敏感性分布法（Species sensitivity distribu?tion，SSD）和概率生態風險法（Probabilistic ecological risk assessment，PERA）[15]。其中RQ法對毒理數據的要求較少，操作難易程度低[16]，已被廣泛用于評估環境中抗生素潛在生態風險的大小[17-19]，且RQ值可以分為 3 個污染等級[20]：0.01≤RQ＜0.1，為低風險；0.1≤RQ＜1，為中等風險；RQ≥1，為高風險，易于說明污染風險程度。

本研究選取天津市5個不同規模的養雞場，采集養雞場新鮮雞糞、周邊近土及對照遠土3類樣品，用超高效液相色譜-質譜聯用（UPLC-MS/MS）方法檢測樣品中5大類抗生素，分析各類抗生素的污染特征及各抗生素與環境因子的相關性，從而識別關鍵影響因素，并綜合文獻中各抗生素急性毒性數據，預測本研究土壤環境中抗生素抗性選擇的無效應濃度，借鑒RQ法對土壤環境中抗生素進行生態風險評估，最終提出相應的消減對策，為日后畜禽養殖業抗生素污染防治和糞肥合理化施用提供依據。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

本試驗的新鮮雞糞樣分別采集于天津市漢沽區（a養雞場）、津南區（b養雞場）、靜海區（c養雞場）和西青區（d、e養雞場）的5個中小型典型養雞場，其養殖規模依次約為0.8萬、0.8萬、5萬、1.1萬只和0.9萬只，周邊近土樣采集于各養雞場的周邊土壤（10 m附近處），對照遠土樣采集于遠離各養雞場50 m附近區域土壤，各樣本均取3個平行樣混合均勻作為代表樣本，分別為：雞糞樣、周邊近土樣和對照遠土樣，5個養雞場共計15個樣品。根據四分法取1 kg左右裝入帶蓋棕色瓶中，及時運回實驗室，于-20℃冰箱保存備測。雞糞樣本、近土樣和遠土樣分別用F、S、K來表示，5個養雞場依次用a、b、c、d和e命名，例Fa是a養雞場的雞糞樣。所采樣的5個養雞場采樣期間均未暴發疫病。

1.2 理化性質測定

雞糞測定pH、全氮、全磷及有機質依據標準《有機肥料》（NY 525—2012）[21]，土壤測定pH、全氮、全磷及有機質參照《土壤農化分析》[22]。全氮、全磷采用全自動連續流動分析儀（AA3）測定。有機質的測定采用重鉻酸鉀容量法。用電感耦合等離子體質譜儀（ICP-MS）測定雞糞和土壤樣品中7種重金屬元素的總濃度（總Zn、Cu、As、Cr、Cd、Ni和Pb）。

1.3 抗生素測定

1.3.1 抗生素及試劑

鑒于抗生素在養殖場的廣泛應用，本研究選取五類18種抗生素作為目標篩選化合物。其中5種磺胺類抗生素（SAs）：磺胺嘧啶（Sulfadiazine，SD）、磺胺甲惡唑（Sulfamethoxazole，SMX）、磺胺二甲嘧啶（Sulfad?imidine，SM2）、磺 胺 氯 噠 嗪（Sulfachlorpyridazine，SCP）、甲氧芐啶（Trimethoprim，TMP）；4種四環素類抗生素（TCs）：四環素（Tetracycline，TC）、土霉素（Oxy?tetracycline，OTC）、金霉素（Chlorotetracycline，CTC）、強力霉素（Doxycycline，DXC）；3種喹諾酮類抗生素（QLs）：環丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）、恩諾沙星（En?rofloxacin，ENR）、氧氟沙星（Ofloxacin，OFL）；3種大環內酯類抗生素（MAs）：紅霉素（Erythromycin，ETM）、羅紅霉素（Roxithromycin，ROX）、泰樂菌素（Tylosin，TYL）；3種β-內酰胺類抗生素（β-lactams）：氨芐青霉素（Ampicillin，AMP）、頭孢氨芐（Cefalexin，CLX）、呋喃唑酮（Furazolidone，FUR）。回收率指示物：13C6-磺胺嘧啶、甲氯環素、洛美沙星及13C3-咖啡因分別作為磺胺類、四環素類、喹諾酮類及剩余類抗生素的替代物。內標指示物：西瑪通。色譜純試劑：甲醇、乙腈；分析純試劑：檸檬酸、丙酮、甲酸、NaH2PO4、Na2EDTA、NaOH、HCl等。

1.3.2 樣品前處理及測試分析

養雞場雞糞及土壤樣品預處理提取液及混合標準儲備液的制備采用萬位寧等實驗方法[23]。首先添加提取液（重復3次）及4種替代物于雞糞和土壤樣品中超聲提取目標抗生素，合并稀釋提取液，過SAX和HLB串聯組裝的萃取柱，固相萃取（SPE）純化目標抗生素，氮氣吹至近干，加入內標物儲備液定容過濾膜，隨后使用UPLC-MS/MS聯用技術對目標抗生素進行上機檢測。儀器的色譜和質譜工作條件參考已優化的方法[23]。標準曲線的線性相關系數R2均≥0.99，達到分析要求。在分析過程中執行了嚴格的質量保證和質量控制，抗生素替代物的回收率為52.3%～89.2%。

1.4 風險評估

本研究采用RQ法來評估18種抗生素在土壤中的殘留對生態系統抗性選擇的潛在風險。本研究中土壤預計無影響濃度（PNECsoil）的計算方法參考歐盟《關于風險評價技術導則文件》[24]與相關文獻[18-19，25]中的內容進行估算。

抗生素的RQ值按下式（1）計算[25]：

式中：MEC為實測環境濃度，μg?kg-1；PNEC是指用于抗生素耐藥性選擇的預測無效應濃度，μg?kg-1。

抗生素在土壤中毒性數據較少，且難以對PNECsoil值進行估算，因此采用公式（2）根據水體中抗生素的PNEC值[25]計算土壤中抗生素的PNEC值[18]：

式中：PNECsoil和PNECwater分別用于預測土壤和水環境中抗生素抗性選擇的無效應濃度，μg?kg-1、μg?L-1，其中PNECwater值（表1）通過收集急性或慢性毒理學實驗數據，并結合美國環保署EPA ECTOX數據庫得出[8]；Kdsoil為土壤-水的分配系數，L?kg-1。

PNECwater=EC50/AF （3）[18-19]

式中：EC50為急性毒性參考因子，半最大效應濃度，mg?L-1；AF為評估因子，根據歐盟《關于風險評價技術導則文件》提出的5種分類方法[24]，考慮到目標抗生素毒性數據只有1個短期試驗，且有研究表明急性毒性試驗風險評估AF為1000，慢性毒性試驗風險評估AF為100[26]，綜合考慮后AF取值1000。

為了最大化估計土壤中抗生素的影響，選擇現有研究中土壤類型相近的各抗生素土壤最低Kd值對PNECsoil進行估計[27]。

1.5 數據分析

Excel 2010處理數據，Origin 2017畫圖，采用冗余度分析（RDA）評價養雞場及其周邊土壤環境中理化性質與抗生素濃度的關系。

表1 預測土壤中目標抗生素的無影響濃度Table 1 Predicts the unaffected concentration of target antibiotics in soil

2 結果與討論

2.1 養雞場及其周邊土壤中抗生素的污染特征

采集于5個典型養雞場及其周邊土壤中3類樣品的5大類抗生素均普遍檢出（表2），其中除SM2、ETM及FUR外，雞糞樣中剩余抗生素的檢出率均達到 100%，雞糞樣中∑SAs、∑TCs、∑QLs、∑MAs、∑β-lactams的均值分別為4.11、143.34、90.46、258.14μg?kg-1和4.06 μg?kg-1，3類樣品的檢出率依次為：雞糞樣＞周邊近土樣＞對照遠土樣；包括周邊近土和對照遠土的土壤樣品中5大類抗生素檢出率依次為：TCs＞QLs＞SAs＞MAs＞β-lactams，各 土 壤 樣 品 中 采樣點∑TCs、∑QLs、∑SAs、∑MAs、∑β-lactams的檢出濃度范圍分別為 9.92～133.95、2.48～13.72、3.15～8.51、0.03～2.33 μg?kg-1和 0.01～0.40 μg?kg-1。Wei等[8]研究了我國畜禽糞便施肥菜田土壤中17種獸藥抗生素的殘留情況發現：TCs（82.75 μg?kg-1）＞QLs（12.78 μg?kg-1）＞MAs（12.24 μg?kg-1）＞SAs（2.61 μg?kg-1）＞AMs（0.06 μg?kg-1），該研究中各類抗生素平均濃度高于本研究中近土樣的檢出濃度且低于雞糞樣的檢出濃度，表明糞肥施用于蔬菜農田土壤中可直接提高抗生素殘留。

本研究中四環素類抗生素（TCs）具有最高檢出率和檢出濃度。TC、OTC、CTC、DXC均被100%檢出（表2）。除去Fb采樣點中遠高于其他抗生素濃度的DXC的異常值，各抗生素平均濃度依次為OTC（50.07μg?kg-1）＞TC（22.00 μg?kg-1）＞DXC（15.59 μg?kg-1）＞CTC（8.92 μg?kg-1），本研究結果與羅凱等[39]TCs濃度檢出水平一致。其中TCs的組成以OTC為主，表明OTC在畜禽糞便及糞污灌溉區均具有較高的檢出濃度[17]。在采集養雞場的3類樣品（即雞糞、近土及遠土對照樣）中，4種四環素類抗生素總濃度（∑TCs）均值分別為1 543.34、54.76、23.65 μg?kg-1，∑TCs呈現逐漸衰減的趨勢。且TCs的Kd值較高（見表1），增強其在土壤中吸附聚積的潛能，從而影響土壤中微生物的群落組成，促使其產生抗性菌，存在不可忽視的生態環境風險[40]。

喹諾酮類抗生素（QLs）總檢出率及檢出濃度低于TCs。CIP、ENR、OFL在雞糞樣中均100%檢出，雞糞樣檢出總濃度范圍為18.74～337.04 μg?kg-1，雞糞樣中的QLs檢出殘留量較高，可能由于QLs作為飼料添加劑，廣泛應用于畜禽養殖業，以促進畜禽生長及疾病的預防。在近土及遠土對照樣中，ENR和OFL全檢出，其中ENR的遞減趨勢較為明顯。整體上，3種QLs的濃度變化為：雞糞樣＞近土樣＞遠土對照樣，表明QLs污染有向周邊土壤遷移的趨勢[41]。

磺胺類抗生素（SAs）的檢出率和檢出濃度低于QLs。SAs的檢出濃度水平依次為：SD＞SMX＞TMP＞SCP＞SM2。其中SD的檢出量最高，在1.35～5.1 μg?kg-1水平，占總濃度的29.67%～91.11%；其次為SMX，濃度范圍為0.07～5.07 μg?kg-1，占總濃度的2.27%～59.58%，兩者共占總濃度的33.63%～100.00%。本研究中雞糞樣、近土樣和遠土對照樣中SAs的總濃度范圍分別為 3.09～4.93、3.43～8.51 μg?kg-1和 3.15～6.48μg?kg-1，3類樣品中∑SAs并未有逐漸降低的趨勢，這可能與SAs水溶性較強且難以降解的特性有關[42]，磺胺類抗生素的Kd值較低（表1），在土壤中的遷移能力較強，且作為早期最常用的抗生素種類之一，SAs在長期使用的過程中不斷向附近土壤進行遷移，導致周邊土壤的磺胺濃度不斷積累，接近甚至超過了糞便中的濃度；但其中養雞場c和e中∑SAs的濃度為：對照遠土樣＞周邊近土樣＞雞糞樣，這可能由于c、e養雞場的對照遠土樣受外部的SAs源污染。

表2 養雞場及其周邊土壤中5大類抗生素的總體檢出水平Table 2 Total detection levels of five major classes of antibiotics in chicken farms and surrounding soil

3種大環內酯類抗生素（MAs）檢出率及檢出濃度依次為：TYL＞ROX＞ETM。TYL作為獸醫臨床常用的抗菌藥物之一，在雞糞樣中全部檢出，采樣點總檢出率為80%，MAs中TYL有從雞糞樣向近土樣轉移的趨勢（圖1d）；TYL在Fb采樣點處具有異常濃度為1 274.20μg?kg-1，推測b養雞場在采樣前期過量使用TYL，用于促生長和防治感染性疾病。ROX檢出率高達100%，檢出濃度值較低，其濃度范圍為0.03～0.52μg?kg-1（表2）；ETM在雞糞樣中低于檢出限，表明ETM并未廣泛應用于本研究的5個養雞場中。

5個養雞場及其周邊土壤中β-內酰胺類抗生素（β-lactams）的檢出率和檢出濃度均低于TCs、QLs、SAs及MAs 4類。3種β-lactams均有較低的檢出率和檢出濃度，依次為：AMP＞CLX＞FUR（如圖1e）。β-lac?tams主要存在于雞糞樣中，周邊土壤環境幾乎未檢出（表2），無明顯的遷移變化。其中，AMP、CLX在雞糞樣中100%檢出且檢出濃度相近，AMP在近土樣和遠土樣均較低檢出率且微量檢出，CLX在土樣中未檢出，可能是由于AMP、CLX微量添加于飼料，用來畜禽疾病預防。

圖1 養雞場及其周邊土壤中抗生素的濃度水平和分布特征Figure 1 Concentration and distribution of antibiotics in the chicken farm and its surrounding soil

2.2 抗生素與環境因子的相關關系

5個典型養雞場及其周邊土壤中3類樣品的理化性質見表3。由表3可知，新鮮雞糞樣的pH均值為6.68，普遍偏酸性，周邊近土和對照遠土樣普遍偏堿性；雞糞樣的含水率、TN、TP和TOC均值較高。整體上，3類樣品的理化因子（pH除外）濃度依次為：雞糞＞周邊近土＞對照遠土。

為了評價養雞場周邊土壤中環境因子[包括理化因子：pH、含水率、TN、TP、TOC；重金屬因子：Total（As、Cd、Cr、Cu、Ni、Pb及Zn）]對抗生素濃度的影響，本研究采用冗余分析（RDA），結果表明，18種抗生素在第Ⅰ軸和第Ⅱ軸的解釋量分別為34.8%和24.5%，RDA分析中第Ⅰ、Ⅱ軸解釋了土壤樣品中抗生素濃度數據總方差的59.3%，對抗生素濃度與環境因子關系的累積解釋量達75.3%，因此，第Ⅰ、Ⅱ軸在一定程度上反映抗生素濃度與環境因子的關系（圖2）。

RDA圖中射線的長度代表對模型貢獻率的大小，射線越長，貢獻率越大；射線的夾角代表其相關性，夾角的余弦值等于兩者的相關系數，環境因子射線在抗生素濃度射線上的垂直投影越長，則對抗生素濃度影響越大[43]。養雞場周邊土壤樣品中18種抗生素的射線分布如圖 2所示，TCs、QLs、SAs、MAs和βlactams 5大類抗生素的相關性不大，除TCs外，其余抗生素分布較集中，但射線較短；TCs（OTC、CTC、TC和DXC）的射線較長但分布較分散。環境因子TP、pH、TN射線均較長，對抗生素濃度差異性的解釋分別為29.27%、15.08%和12.00%。其中，pH與SMX正相關，與CIP、TMP、TYL等負相關；TP與SCP正相關，Mo、TOC與CTC正相關，TN、Total與DXC、ENR正相關?？梢缘贸觯煌目股嘏c大多數的單一環境因子之間沒有明顯的規律，通常受所有環境因子共同累加的影響。常規環境因子與重金屬通過影響抗生素在土壤中的吸附作用，從而影響抗生素在土壤溶液中的濃度、遷移能力、生物學效應及其降解效率[44]。

表3 養雞場及其周邊土壤中各采樣點的理化性質Table 3 Physical and chemical properties of each sampling point in the chicken farmand its surrounding soils

圖2 5大類抗生素與環境因子的冗余分析Figure 2 Redundant analysis of five major classes of antibiotics and environmental factors

2.3 養雞場周邊土壤中抗生素的生態風險評估及消減對策

2.3.1 生態風險評估

由于目標抗生素已有的土壤毒理數據較少，采用RQ法來進行初步評價研究[18]。本研究中β-lactams在土壤中檢出率和檢出濃度均較低（圖1e），故暫未評估其生態風險，ROX未檢索到相關的土壤分配系數（即Kd值），故不考慮其生態風險。抗生素從糞肥到土壤的遷移是一個復雜的過程。在實際環境中，很難計算從糞便到土壤的抗生素濃度[17]。本研究將重點討論在養雞場周邊近土（圖3S）和對照遠土（圖3K）中14種抗生素的生態風險。

整體上，養雞場周邊近土RQ值高于對照遠土的RQ值，這可能與周邊近土可直接接觸雞糞有關，雞糞含有的抗生素可直接遷移轉化到周邊近土中去[8]。由圖3可知，周邊近土樣和對照遠土樣中，以SMX、SD生態風險最高，RQ值遠大于1，均全部表現為高風險，兩者為養雞場土壤樣品中最嚴重的抗生素污染物，需采取減量使用等消減措施；SM2、TC、OTC、DXC、ENR、OFL、ETM及TYL的RQ值均在0.01～1范圍內，表現為中低風險，對土壤微生物有一定程度傷害，應給予重視；SCP、TMP、CIP以及遠土樣中的CTC均小于0.01，暫時表現為無風險，在后期風險評估中仍需關注。TCs、QLs和MAs的RQ值小于1，3類抗生素表現為有中低風險，對環境造成一定選擇壓力[8]，若考慮各抗生素的聯合作用，風險水平更需加強關注[45]。

表4為5個養雞場周邊近土的各類抗生素總含量減去對照遠土的各類抗生素總含量，排除外源抗生素的影響，得出RQ差值，用以評估由于養雞場來源對周邊近土抗生素的影響。由表4可知，∑SAs在a、b養雞場中的生態風險最高，在剩余養雞場中的RQ差值小于0，這可能由于c、d和e養雞場的對照遠土受外部的SAs源污染?！芓Cs、∑QLs和∑MAs 3大類抗生素的RQ差值大于0.01的均有4個養雞場，表明3大類抗生素均有一定程度的生態風險；養雞場a、b的4大類抗生素均存在較高的生態風險，對周邊土壤造成不同程度的污染。因此亟需開展有關畜禽糞便-土壤-作物系統中抗生素環境行為與調控等方面的研究[11]。

表4 養雞場周邊近土與對照遠土4大類抗生素的生態風險差值Table 4 Ecological risk difference of four major antibioticsin the near-soils and control remote soils around the chicken farm

圖3 養雞場周邊近處土壤（S）及遠處對照土壤（K）中主要抗生素的RQ值Figure 3 Risk quotient of predominant antibiotics in the soil（S）near the chicken farm and in the remote control soil（K）

2.3.2 污染消減對策

目前國家已出臺了相關法律法規和行動計劃，但抗生素污染問題仍較為突出。亟需提出消減對策，其關鍵途徑之一是源頭控制抗生素的使用[14]。首先建議國家加大相關法律法規執行力度、制定使用規范，并建立部門聯合管理機制；其次，政府需加強養殖業從業人員教育，引導農戶科學合理地使用抗生素；第三，主管部門應定期抽查養殖場，嚴格控制其使用抗生素的種類和劑量，建立殘留藥物的防控監測系統；第四，大力推廣具有高效性、安全性、不易產生抗性的抗生素替代品。途徑二是畜禽糞便施用前的無害化處理，常用的生物處理方式有好氧堆肥和厭氧發酵[46]，此外，也可通過糞便分離減緩抗生素殘留[47]。途徑三是在糞肥利用過程中，通過調控施用量、施用頻率、施用時間等因素加速土壤中抗生素的消減[48]。最終從源頭上控制抗生素的使用，在糞肥處理和末端利用中開發和優化去除抗生素殘留技術，消減抗生素殘留，遏制動物源細菌耐藥，進而降低抗生素的生態風險，保障養殖業生產安全。

3 結論

（1）養雞場及其周邊土壤中5大類抗生素均普遍檢出，檢出率依次為：TCs＞QLs＞SAs＞MAs＞β-lactams。3類采樣點中檢出率及檢出濃度依次為：糞便樣＞近土樣＞遠土樣，TCs和QLs的總濃度有依次衰減的趨勢，暗示有向土壤環境遷移轉化的可能。

（2）關鍵環境因子TP、pH和TN對目標抗生素濃度差異性解釋方差的貢獻率分別為29.27%、15.08%和12.00%，且抗生素的濃度差異、吸附能力等通常受所有環境因子共同累加的影響。

（3）養雞場周邊近土樣生態風險高于對照遠土樣，TCs、QLs和MAs均表現為中低風險；周邊近土與對照遠土的RQ差值表明，各養雞場已經對周邊土壤產生不同程度的污染。

（4）消減抗生素的對策應從抗生素使用源頭、畜禽糞便處理過程和末端進入土壤3個方面著手。