不同麥秸還田模式對稻田土壤微生物活性和微生物群落組成的影響

王 寧，羅佳琳，2，趙亞慧，李 勇，于建光，2，4*

（1.江蘇省農業科學院農業資源與環境研究所，南京 210014；2.南京農業大學資源與環境科學學院，南京 210014；3.江蘇省常州市金壇區土壤肥料技術指導站，江蘇常州 213200；4.農業農村部江蘇耕地保育科學觀測實驗站，南京 210014）

在長江中下游地區，稻麥輪作作為典型的種植模式在保障主要糧食供應上起著重要的作用，但由于小麥收獲后秸稈產生量大以及茬口時間短、季節緊，秸稈還田作為一種直接有效的秸稈處置措施被廣泛采用。秸稈還田不僅能夠改善土壤結構、增加土壤養分和提高作物產量[1-3]，而且對土壤微生物也有著重要的影響[4-5]。

微生物量碳氮和酶活性作為土壤微生物活性的重要指標，是土壤養分轉化和有機質分解的關鍵因子，常被用于評價土壤質量的生物學特性[6-9]。近年來，利用土壤微生物活性指標的變化來評價麥秸還田對稻田土壤生態學效應的研究相對較多。研究發現，秸稈還田對稻田土壤微生物活性的影響與秸稈還田方式、土壤性質等多種環境因子密切相關[10-12]，因此，合理的秸稈還田技術能夠有效地改善土壤微生物活性進而提升土壤肥力。然而，由于目前土壤環境的復雜性，使得對于典型稻麥輪作區大田試驗條件下不同小麥秸稈還田模式對稻田土壤微生物活性的影響效應仍不夠明確。

細菌是土壤微生物的重要組成部分，直接影響土壤物質循環和養分轉化等[13-14]。然而由于土壤中大部分細菌很難分離培養，采用傳統的土壤微生物研究方法如微生物平板培養法、變性梯度凝膠電泳（DG?GE）等通常無法詳細描述出土壤微生物的群落多樣性和組成方面的信息[15-17]，使得對于土壤細菌生物多樣性的研究仍然匱乏，有關其演替規律仍不清楚。近年來興起的現代分子生物學技術如高通量測序技術等[13-14]，為深入探究土壤微生物群落組成、功能及其適應機制提供了良好的契機。已有研究表明，不同微生物在秸稈降解過程中起著不同的作用，例如，在秸稈降解初期細菌起主要作用[18-19]，而且秸稈還田顯著增加擬桿菌門（Bacteroidetes）、β-變形菌門（Betapro?teobacteria）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）豐度，從而改變土壤細菌群落[20-21]。然而目前關于典型稻麥輪作區大田試驗條件下稻田土壤細菌群落組成對秸稈還田的響應仍不夠清晰。

因此，本試驗擬通過研究長江下游典型稻麥輪作區不同小麥秸稈還田模式對土壤微生物活性和微生物群落組成的影響，為尋求良好的土壤微生物生態環境提供理論和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗于2017年6月至11月在江蘇省常州市金壇區薛埠鎮羅村稻麥輪作試驗田進行。該試驗田0～20 cm土壤的理化狀況為：pH值5.81、堿解氮51.3 mg·kg-1、速效磷12.2 mg·kg-1、速效鉀190 mg·kg-1、有機質23.7 g·kg-1。

1.2 試驗設計與田間管理

試驗采用隨機區組排列，設置四種處理，分別為對照（Control）、麥秸直接還田（S）、麥秸與氮肥配施還田（SN）、麥秸泡田還田（SP），每個處理三個重復。每個小區面積為2000～3000 m2，小區之間以自然田埂或筑埂分隔。試驗前先將上季的小麥收獲，留茬10 cm左右，然后通過收割機將小麥秸稈粉粹，長度約5～10 cm。待秸稈均勻拋撒后采用常規旋耕還田，深度為10～12 cm，上水泡田若干天后移栽稻秧苗，品種為武運粳23號，11月1日收獲。各處理施肥和泡田具體管理情況見表1，其中Control、S和SP處理下氮、磷、鉀肥總施用量分別為270、37.5、71.25 kg·hm-2；SN處理下氮肥用量增加到330 kg·hm-2，磷肥和鉀肥施用量保持不變。基肥在泡田、整地前施；分蘗肥在插秧后7～10 d施；穗肥在倒三葉期（8月上旬）葉色褪淡時施。除草、病蟲害防治等按照當地常規管理。

1.3 取樣測定方法

在水稻成熟期（2017-11-01），采用五點取樣法在各試驗小區采集深度為0～20 cm的土壤樣品。所有土壤樣品挑除動植物雜體后混勻，分為三部分：一部分風干后用于土壤性質和土壤酶活性的測定，一部分鮮樣保存于4℃冰箱用于土壤微生物量碳氮的測定，最后一部分鮮樣保存于-20℃冰箱用于細菌群落結構分析。

土壤pH值采用酸度計（pHs-3C型精密pH計，上海雷磁儀器廠）測定（土∶水=1∶5）；土壤電導率（EC）采用電導儀（DDSJ-318型電導率儀，上海雷磁儀器廠）測定；土壤總有機碳（TOC）采用重鉻酸鉀外加熱法[22]；土壤溶解性有機碳（DOC）采用有機碳分析儀（Shimadzu TOC-Vcph，Japan）測定（土∶水=1∶5）；土壤全氮（TN）采用半微量開氏法[22]；堿解氮（AN）采用堿解擴散法[22]；有效磷（AP）采用鉬銻抗比色法[22]；速效鉀（AK）采用火焰光度計比色法[22]；土壤過氧化氫酶（Catalase）采用高錳酸鉀滴定法[23]；多酚氧化酶（Poly?phenol oxidase，PPO）采用鄰苯二酚比色法[23]；酸性磷酸酶（Acid phosphatase，ACP）采用對硝基苯磷酸二鈉比色法[23]；蔗糖酶（Invertase）采用二硝基水楊酸比色法[23]；脲酶（Urease）采用靛酚比色法[23]；微生物量碳氮（MBC、MBN）采用氯仿熏蒸浸提法[24]。

根據FastDNA?Spin Kit for Soil試劑盒說明書提取土壤微生物總DNA，所獲得的DNA送至上海美吉生物有限公司，用于Illumina Miseq測序，細菌群落組成高通量測序所用引物為515F（5′-GTGCCAGC?MGCCGCGG-3′）和 907R（5′-CCGTCAATTC?MTTTRAGTTT–3′）[25]。

1.4 數據處理

高通量測序所得原始序列首先經拼接和過濾后去除含錯誤接頭、漏測核苷酸（N）或者連續出現10次以上堿基的序列；再次過濾低質量的序列（含20個以上低質量的堿基），并去除引物。所得的序列隨后在I-Sanger云平臺進行分析，流程主要包括：參照綠色基因數據庫（Greengenes database，2011版）在97%的相似度水平劃分序列的OTU；挑選代表的OTU用RDP分類；去除含嵌合體的OTU歸類為葉綠體或線粒體的OTU以及只出現一次的OTU；在不同的分類水平上將具有相同歸屬的OTU合并；將所有樣品的序列數校正到樣品中出現的最低序列數，并在此基礎上做系數分析，計算物種群落組成、物種差異性分析和β多樣性。其中β多樣性是指根據樣品兩兩間bray-curtis做非度量多維尺度分析（NMDS），用于表征樣品之間基于一些OTU存在與否的細菌群落的相似性。測序數據圖形繪制均在I-Sanger云平臺上完成。

所得數據采用Excel 2007和SPSS 23.0軟件進行處理與統計分析，圖形繪制采用SigmaPlot 10.0。

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質

不同麥秸還田模式下，稻田土壤部分理化性質的變化見表2。由表2可以看出，與未施用麥秸的對照土壤相比，S處理稻田土壤pH、TOC和AK含量都有上升趨勢，土壤EC和TN則呈現下降趨勢，但影響效應并不顯著（P＞0.05），而稻田土壤中AP含量則顯著提高，AN含量顯著降低（P＜0.05）。三種麥秸還田模式下，稻田土壤中pH、TOC、DOC、AK、EC和TN并無顯著變化。與S處理相比，SN處理顯著提高了土壤中AN含量，并顯著降低了稻田土壤中AP的含量，而與對照土壤相比，SN處理顯著提高了土壤中DOC含量；SP處理與S處理相比僅顯著降低了土壤中AP含量，而對其他性質無顯著影響。以上研究結果表明，麥秸還田主要顯著改變了土壤中易被微生物可利用的碳、氮、磷的含量如DOC、AN和AP，而對土壤中pH、EC、TOC、TN和AK則無顯著影響。

表1 不同麥秸還田模式下稻田施肥和泡田管理情況Table 1 Fertilization and ponding treatments in paddy soils with different straw returning

表2 不同麥秸還田模式下稻田土壤理化性質的變化Table 2 Soil properties in paddy soils with different straw returning

2.2 土壤微生物量碳和微生物量氮

不同麥秸還田模式下稻田土壤MBC和MBN含量，以及計算的MBC/MBN見圖1。由圖1可以看出，與對照土壤相比，三種麥秸還田模式下稻田土壤MBC含量由249 μg·g-1升高到257～282 μg·g-1，但其升高效應并不顯著（P＞0.05）；而土壤中MBN則是由16.9μg·g-1顯著提高到24.6～31.3μg·g-1（P＜0.05），提高了45.6%～85.2%，其中SN處理下土壤中MBN含量最高。基于MBC和MBN結果，還發現麥秸還田下MBC/MBN由14.9顯著降低到8.58～10.7（P＜0.05），其中SN處理下土壤中MBC/MBN最低。以上研究結果表明，麥秸還田提高了稻田土壤中MBC和MBN含量，并顯著降低了土壤中MBC/MBN比值。

圖1 不同麥秸還田模式下稻田土壤微生物量碳、氮含量以及微生物量碳氮比的變化Figure 1 Concentration in microbial biomass carbon（MBC）and nitrogen（MBN）,and MBC/MBNin paddy soils with different straw returning

2.3 土壤酶活性

不同麥秸還田模式下稻田土壤的過氧化氫酶、多酚氧化酶、酸性磷酸酶、蔗糖酶以及脲酶活性見圖2。由圖2可知，與對照土壤相比，三種麥秸處理模式下，S和SN處理稻田土壤中過氧化氫酶活性由0.92 mL·g-1顯著增加到 1.12 mL·g-1和 1.06 mL·g-1，增加了15.2%～21.7%，而SP處理土壤中過氧化氫酶則無明顯變化；S和SN處理稻田土壤中蔗糖酶活性無顯著變化，而SP處理土壤中蔗糖酶活性由對照的10.5 mg·d-1·g-1顯著提高到 17.1 mg·d-1·g-1，增加了61.9%；三種麥秸處理模式下稻田土壤中多酚氧化酶活性由對照的16.7 μmol·g-1·h-1顯著提高到 23.5、24.8 μmol·g-1·h-1和21.5 μmol·g-1·h-1，分別提高了40.5%、48.1%和28.7%；三種麥秸處理模式對稻田土壤中酸性磷酸酶活性無顯著性影響。此外，S和SP處理下稻田土壤中脲酶活性由對照71.0 mg·d-1·g-1降低到54.8 mg·d-1·g-1和60.5 mg·d-1·g-1，顯著降低了22.8%和14.8%，而SN處理下土壤中脲酶活性增加了9.86%，但其增加效應并不顯著。以上結果表明，麥秸還田主要顯著提高了稻田土壤中多酚氧化酶活性，但對于酸性磷酸酶活性則無顯著影響，而稻田土壤中過氧化氫酶、蔗糖酶和脲酶活性的變化在不同麥秸還田模式下不同。

2.4 土壤細菌群落組成

利用Illumina高通量測序技術，對12個不同麥秸還田模式下稻田土壤樣品按照97%相似性對非重復序列（不含單序列）進行OTU聚類。不同麥秸還田模式下，稻田土壤的細菌群落組成見圖3。由圖3可以看出，未施用麥秸的對照稻田土壤優勢細菌為綠彎菌門（Chloroflexi，25.5%）、放線菌門（Actinobacteria，24.1%）、變形菌門（Proteobacteria，18.2%）、酸桿菌門（Acidobacteria，10.1%）和 厚 壁 菌 門（Fimicutes，8.35%）。

圖2 不同麥秸還田模式下稻田土壤酶活性Figure 2 Soil enzyme activity in paddy soils with different straw returning

與對照土壤相比，麥秸還田處理對稻田土壤中主要優勢菌門豐度的影響見圖4。由圖4可知，麥秸還田條件下稻田土壤中優勢菌變形菌門（Proteobacte?ria）的豐度由18.2%提高至20.7%，而其他優勢菌門并無顯著變化。研究還發現，不同麥秸還田模式之間土壤中優勢菌門并無顯著差異（圖3）。以上結果表明，麥秸還田顯著提高了稻田土壤中變形菌門（Pro?teobacteria）的相對豐度，但對其他優勢菌門相對豐度并無顯著影響，且不同麥秸還田模式之間稻田土壤中優勢菌門相對豐度也無顯著差異。

為了進一步探究麥秸還田對土壤中細菌群落組成的影響，我們對不同麥秸還田模式下土壤中細菌群落組成進行了非度量多維尺度分析（NMDS）（圖5）。結果顯示，與對照土壤相比，S和SN處理下土壤中細菌群落組成有一定的遷移；SP和對照之間細菌群落組成正好重合。以上結果表明，麥秸直接還田和麥秸與氮肥配施還田改變了土壤中細菌群落組成，但麥秸泡田還田并未改變土壤中細菌群落組成。

3 討論

土壤微生物量碳氮是土壤微生物軀體中所固定的碳素和氮素，是土壤養分的儲存庫。已有研究表明，秸稈覆蓋還田能夠顯著提高土壤微生物量碳氮含量[11]。本研究也發現麥秸還田下稻田土壤中微生物量碳含量有上升趨勢，同時微生物量氮含量顯著提高。這很可能是由于秸稈還田提高了土壤中DOC含量，為微生物生長和繁殖提供了大量碳源，從而提高了土壤微生物量。土壤微生物生長不僅受碳源的影響，氮肥的調控也會影響土壤微生物的量[26]。當秸稈與氮肥配施還田時，氮肥施用為微生物生長提供了較多的氮源，刺激了微生物的生長[26]，因此麥秸與氮肥配施還田下土壤中微生物量氮含量最高。

已有研究表明，秸稈還田條件下，土壤微生物量的增加能夠促進土壤酶內在的分泌物數量，從而提高土壤酶活性，而土壤酶能夠催化土壤中的生物化學反應，對土壤肥力有著重要的影響[27]。本研究也發現麥秸還田顯著提高了土壤中多酚氧化酶活性。氧化還原酶在土壤轉化過程中有很重要的作用，其中多酚氧化酶與土壤有機質的形成有關，是腐殖化的一種媒介[28]。麥秸還田條件下多酚氧化酶活性的提高很可能主要是有效促進秸稈腐質化，從而提高土壤有機質含量。而磷酸酶活性主要參與土壤中磷素的轉化，本研究發現三種麥秸還田模式下土壤有效磷含量并無顯著變化，因此三種麥秸還田對土壤磷酸酶活性也無顯著影響。此外，稻田土壤中過氧化氫酶、蔗糖酶和脲酶活性對不同麥秸還田模式響應有所差異。過氧化氫酶活性從某方面反映了加入到土壤中的秸稈的分解狀況，與土壤有機碳的轉化有關[29]。與麥秸泡田還田相比，麥秸直接還田和麥秸與氮肥配施還田時，泡田時間較短情況下，土壤中含氧量較高易于好氧微生物生長，而泡田時間延長的情況下土壤中含氧量逐漸降低，形成一定的厭氧環境，厭氧微生物量逐漸增多，其對秸稈的分解程度通常不如好氧微生物徹底。因此秸稈分解較快的麥秸直接還田和麥秸與氮肥配施還田下土壤過氧化氫酶活性更高。而蔗糖酶活性在麥秸泡田還田處理下較高，很可能是因為厭氧條件下，有機質分解不夠徹底，釋放出較多蔗糖，因此需要較高的蔗糖酶來進一步分解成更小分子有機碳。脲酶活性主要是與土壤中氮的供給與利用情況密切相關[29]。本研究發現麥秸還田顯著提高了土壤中溶解性有機碳含量，而微生物對土壤中C、N的利用有一定的比例范圍，一旦C/N比值變大，勢必引起微生物對N源的爭奪利用，麥秸直接還田和麥秸泡田還田下隨著秸稈的施入，土壤中堿解氮含量顯著降低（37.5 mg·kg-1vs28.6～31.3 mg·kg-1），造成土壤氮缺乏[30]，從而降低脲酶活性。而麥秸與氮肥配施還田隨著氮肥施用量的增大增加了土壤中堿解氮含量（49.4 mg·kg-1），因此脲酶活性則又有所提高。

圖4 麥秸還田對稻田土壤在門水平上的主要優勢菌豐度的影響Figure 4 Class distribution of bacterial community in soils with different straw returning

圖5 不同麥秸還田模式下稻田土壤在OTU水平上細菌群落組成的β多樣性Figure 5β-diversity of bacterial community at OTUlevel in soils with different straw returning

土壤微生物生物量碳氮比經常被用于描述微生物的群落結構信息[31]。一般來說，細菌的C/N比值在3～6之間，而真菌的C/N比值在7～12之間[32]。本研究中土壤微生物生物量碳氮的比值一直較大，維持在8～15（圖1），說明該土壤中真菌數量比較高，而秸稈還田后，土壤微生物生物量碳氮比有所降低，很可能是由于秸稈還田后土壤pH的升高更利于細菌生長[11，33]。細菌作為微生物重要組成部分之一，在稻田土壤碳氮元素轉化過程中的作用不可忽視。已有研究表明秸稈還田能夠顯著改變土壤細菌群落[20]，并能顯著增加擬桿菌門（Bacteroidetes）、β-變形菌門（Be?taproteobacteria）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）豐度[21]。本研究發現麥秸還田顯著增加了稻田土壤中變形菌門（Proteobacteria）的相對豐度，而細菌群落的遷移在不同麥秸還田模式下響應明顯不同。土壤細菌群落組成僅在麥秸直接還田和麥秸與氮肥配施還田處理中有一定遷移，而麥秸泡田還田處理下細菌群落組成并無變化，這很可能是由于不同麥秸還田模式下土壤性質變化不同，而土壤性質是調控土壤微生物群落結構的重要因子[14]。

4 結論

（1）三種麥秸還田模式均提高了稻田土壤微生物量碳氮含量，并顯著降低了微生物量碳氮比。

（2）麥秸還田顯著提高了稻田土壤中多酚氧化酶活性，但對酸性磷酸酶活性無顯著影響；而稻田土壤中過氧化氫酶、蔗糖酶和脲酶活性的變化與其麥秸還田模式緊密相關。

（3）麥秸還田顯著提高了稻田土壤中變形菌門（Proteobacteria）的相對豐度，其中麥秸直接還田和麥秸與氮肥配施還田改變了土壤中細菌群落組成，而麥秸泡田還田并未改變土壤中細菌群落組成。