凍融期巴音布魯克高寒濕地土壤細菌群落變化及其響應機制

陳 末，朱新萍，蔣靖佰倫，買迪努爾·阿不來孜，孫 濤，賈宏濤,2*

（1.新疆農業大學草業與環境科學學院，烏魯木齊 830052；2.新疆土壤與植物生態過程重點實驗室，烏魯木齊 830052）

濕地生態系統單位面積儲存的碳遠高于任何其他生態系統[1]，因而引起廣泛關注。其中，高寒濕地生態系統因植被類型較為單一而更加脆弱，其有機質含量高且分解比較緩慢對氣候變化極為敏感，是溫室效應的指示器[2]。土壤微生物作為濕地生態系統功能過程的關鍵媒介[3]，在驅動物質循環和能量流動過程中具有重要作用[4]。

凍融是全球中高緯度和高海拔地區的常見現象，全球氣候變暖導致高寒濕地的凍融格局更加多變。相關研究證明濕地土壤微生物的生命活動可以從非生長季持續到冬季[5-6]，但其生理活性會受凍融期內土壤溫度[7-8]、土壤濕度[9-10]、積雪厚度[11]和土壤養分[12]等因子劇烈變化的影響。尤其在融凍期間，冰雪融化促使地表形成活躍層，進一步加強微生物復活后的生存能力[13]。并且，微生物代謝活動的變化，可能會潛在形成正反饋回路，改良表層土壤的解凍條件[14]。通常在這一階段，微生物群落會出現呼吸峰值，更多的猜測這可能是一種應激反應[15]。

當前，凍融對土壤微生物的研究多基于時空尺度上微生物生物量[16-18]、土壤養分[19-20]、土壤溫室氣體排放通量[21]的監測，因地域條件等因素的限制，關于高寒濕地土壤微生物群落的研究極為少見。相較于平原濕地，高寒濕地土壤微生物群落中可能含有較多的嗜冷微生物類群，對氣候變化響應更加迅速，群落演替變化更加明顯。因此，探明凍融期高寒區土壤微生物群落結構和功能作用的變化以及微生物的耐冷機制顯得極為重要。鑒于此，本研究以巴音布魯克高寒濕地沼澤土壤為研究對象，在野外條件下探究凍融期土壤細菌群落結構和功能作用的變化，同時分析微生物不同影響因子的貢獻率。研究結果可為高寒濕地生態系統功能過程提供基礎數據，豐富高寒濕地土壤微生物生態學研究，也可為凍融期土壤微生物代謝潛能對環境變化響應機制的解析提供新思路。

1 材料與方法

1.1 采樣點概況和樣品采集

巴音布魯克天鵝湖高寒濕地（83°40′～84°40′E，42°35′～43°00′N）位于新疆維吾爾自治區和靜縣境內，海拔2300～3042 m，面積約為770 km2，年平均氣溫約4.6℃，年最低氣溫達-48.1℃[22]。凍融期6～7個月，歷史最大凍土深度為4.39 m，是我國氣象站記錄中的最高值[23]。濕地水分主要來源于高山冰雪融水和自然降水，被譽為中亞干旱區的空中濕島[2]。濕地沼澤區主要植被為細果苔草（Carex microglochn）、黑花苔草（Carex melanantha）、海韭菜（Triglochin maritimum）和線葉嵩草（Kobresia capillifolia），總蓋度大于80%[24]。

2018年9月，在沼澤區苔草群落內完全隨機設置24塊重復小區（2 m×2 m），相互間隔大于3 m，去除小區內土壤表面0～2 cm的新鮮凋落物[21]，并用1 m高的鋼質柵欄圍護，盡量保證試驗一致性。依據土壤溫度和土壤濕度的變化，將凍融期分為3個階段，分別為初凍期（2018年10月）、凍結期（2018年11月—2019年2月）、融凍期（2019年3月—4月）。于3個時期的典型天氣采集小區圍欄內0～5 cm表層土壤樣品：t0（初凍期），t1=140 d（凍結期），t2=185 d（融凍期）。每次隨機選擇8個小區，小區內采用5點法采集，混合均勻后裝入同一根冷存管，編號并儲存于液氮罐中，用于提取微生物總DNA進行高通量測序。同位置、同方法另采集2份土壤帶回實驗室，自然風干后用于土壤理化性質測定。

1.2 實驗方法

1.2.1 土壤理化性質測定

試驗區內，設置兩臺15通道的自動氣象站（U30-NRC，HOBO，USA）收集0～5 cm土壤溫度（ST）、土壤濕度（SM）。積雪厚度（SD）為每日12：00人工測量。土壤樣品研磨過篩后，采用元素分析儀（Vario El III，Elementar，Germany）測定土壤全碳（TC）和土壤全氮（TN），TC和TN的比值作為土壤碳氮比（C/N）。

1.2.2 細菌16SrDNA測序

采用微生物Marker基因高通量測序評估細菌群落結構和多樣性，使用MN NucleoSpin 96 Soil試劑盒/強力土壤DNA提取試劑盒（PowerMag?Soil DNA iso?lation Kit，MOBIO）從樣品中提取細菌總DNA。細菌16SrRNA基因的V3～V4區用普通引物對（正向引物338F，5′-ACTCCTAGGGAGGAGCA-3′擴增；反向引物806R，5′-GGACTCHVGGGTWTTAT-3′）結合適配器序列和條形碼序列進行擴增。本研究所有樣品的測序和生物信息服務均在北京百邁客生物科技有限公司Illumina Hiseq 2500平臺完成。

1.3 分析方法

1.3.1 數據分析

基于R（v3.3.2）的agricolae軟件包進行正態分布和方差齊性檢驗（Normal distribution and homogeneity of variance Test）及單因素方差分析（One-way ANO?VA），并在5%顯著性水平下做LSD（Least significant difference）多重比較。

1.3.2 生物信息學分析

使用FLASH（v1.2.11）對原始數據進行拼接，通過Trimmomatic（v0.33）將拼接得到的序列進行質量過濾，借助UCHIME（v8.1）去除嵌合體，獲得高質量Tags序列。使用USEARCH（v10.0）對OTU進行相似度為97%的聚類，以測序所有序列數的0.005%作為閾值過濾OTU。使用RDPClassifier（v2.2）對分類群進行分類，最小可信度估計為80%。

借助Mothur（v1.30）分析細菌群落α多樣性，通過ggpubr軟件包中Kruskal-Wallis檢驗比較組間差異，并使用ggplot軟件包完成繪圖。使用ggalluvial等軟件包繪制細菌群落豐度變化沖擊圖。冗余分析（Reundancy analysis，RDA）環境因子對細菌群落組成的影響，蒙特卡羅置換檢驗（Monte Carlo permutation，n=999）測試分析結果的顯著性。基于KEGG數據庫，使用STAMP（v2.1.3）進行細菌功能差異顯著性分析及繪圖。

2 結果與分析

2.1 凍融期土壤理化性質的變化

依據土壤溫度、土壤濕度的變化，將凍融期分為初凍期、凍結期和融凍期（圖1）。在t0（初凍期）采樣7 d后，試驗階段內首次降雪。一個月后進入凍結期，土壤濕度迅速降低至25%左右。t0（初凍期）至t1（凍結期）的大部分時間里，樣地內土壤溫度在0℃以下，積雪厚度超過25 cm。t1（凍結期）采樣后，積雪融化，土壤溫度和土壤濕度均開始升高。最終取樣t2（融凍期），在研究區域內所有積雪融化后一周進行。凍融期內，土壤TC和TN均呈先顯著下降后顯著升高的趨勢，而C/N則相反（表1）。

2.2 凍融期土壤細菌群落物種多樣性的變化

所有測序文庫的覆蓋度均在99.5%以上，絕大部分細菌的序列可以被測出。3個時期土壤細菌群落α多樣性差異顯著（圖2）。OTU數量（OTUs）在t1（凍結期）細菌群落中顯著減少，并在t2（融凍期）細菌群落中顯著增加（圖2a）；可觀察到的物種數目也具有相似趨勢（圖2d），且t0（初凍期）細菌群落中物種數量顯著高于t2（融凍期）。從香農指數和辛普森指數來看（圖2b和圖2c），t2（融凍期）細菌群落的物種多樣性略優于t0（初凍期），遠高于t1（凍結期）。而比較ACE指數和Chao1指數可以看出，t0（初凍期）細菌群落豐富度優于t2（融凍期），遠高于t1（凍結期）（圖2e和圖2f）。

2.3 凍融期土壤細菌群落結構的變化

圖1 凍融期巴音布魯克高寒濕地土壤溫度、土壤濕度、積雪厚度日變化Figure 1 Daily changes of soil temperature，soil moisture and snow depth in Bayinbuluk alpine wetland during freeze-thaw period

表1 凍融期巴音布魯克高寒濕地土壤（0～5 cm）基本特征Table 1 Basic characteristics of soil（0～5 cm）in Bayinbuluk alpine wetland during freeze-thaw period

雖然細菌群落結構在生物復制中具有很大差異，但總體變化趨勢顯而易見。在各個水平上，隨時間推移，優勢菌類群演替明顯。在門水平上（圖3a），t0（初凍期）和t1（凍結期）樣品細菌群落更相似，均以Pro?teobacteria（變形菌門）為主（12.8%～45.7%），而t2（融凍期）樣品中可以看到Chloroflexi（綠彎菌門）豐度的增加。在綱一級（圖3b），3個時期均以嗜酸性變形桿菌為主。t0（初凍期）樣品中以Alphaproteobacteria（α-變形桿菌綱）豐度較高；t1（凍結期）和t2（融凍期）樣品中Gammaproteobacteria（γ-變形桿菌綱）豐度較高，同時，Betaproteobacteria（β-變形桿菌綱）僅存在于t0（初凍期）細菌群落中。更多的變化在目水平中可見（圖3c），例如，Anaerolineales（厭氧繩菌目）和Rhodospirillales（紅螺菌目）在t0（初凍期）細菌群落中豐度最高，而在t1（凍結期）和t2（融凍期）細菌群落中驟減；t1（凍結期）細菌群落中含有更多的Bacteroida?les（擬桿菌目）。在屬一級也發現了相同的模式（圖3d），同時各時期稀有分類群水平升高。Brevundimonas（短波單胞菌屬）是t0（初凍期）的代表，Ilumatobacter屬、Luteolibacter屬和Tabrizicola屬在t2（融凍期）中豐度較高。然而，由于檢測出更多的稀有類群，超過70%的reads不能夠被準確分類到該水平。

2.4 凍融期土壤環境和養分對細菌群落結構變化的影響

冗余分析表明，兩個維度共同解釋了凍融期土壤細菌群落結構變化（門水平）的87.29%（圖4），揭示了土壤環境對細菌群落β多樣性的影響。其中，環境因子解釋的變量為84.74%，土壤養分因子解釋量為73.91%，兩組變量的共同解釋量為71.36%。蒙特卡羅置換檢驗結果顯示，該排序模型在P=0.001時顯著，所有影響因子均與細菌群落分布極顯著相關。凍融期土壤環境的劇烈變化，對土壤細菌群落結構組成產生顯著影響。t0（初凍期）細菌群落主要受土壤濕度的影響較大；t1（凍結期）細菌群落受控于積雪厚度，經受t0（初凍期）～t1（凍結期）階段土壤環境的選擇作用，Bacteroidetes（擬桿菌門）成為t1（凍結期）細菌群落的優勢菌群；而Tenericutes（軟壁菌門）是t2（融凍期）細菌群落的特征物種。同時，土壤溫度和C、N含量在t0（初凍期）和t2（融凍期）采樣時期較為相似，與t1（凍結期）具有很大差異。

2.5 凍融期土壤細菌群落功能作用的變化

圖2 凍融期巴音布魯克高寒濕地土壤細菌群落α多樣性Figure 2 Alpha diversity of soil bacterial communities in Bayinbuluk alpine wetland during freeze-thaw period

圖3 細菌群落中門（a）、綱（b）、目（c）和屬（d）成員的結構和相對豐度Figure 3 Structure and relative abundance of members of phylum（a），class（b），order（c）and genus（d）in bacterial community

圖4 凍融期土壤環境和養分對細菌群落結構變化影響的冗余分析Figure 4 RDA analysis of effects of soil environment and nutrientson changes of bacterial community structure during freeze-thaw period

通過PICRUSt功能注釋軟件將測序所得細菌群落組成“映射”到Greengenes數據庫中，基于基因功能譜預測細菌基因組的潛在功能。3個時期，細菌群落包含的功能基因組成不同，通路類型差異顯著，表現出群落功能作用的多樣性和階段性。

“代謝”是最主要的通路類型（圖5a）。t0（初凍期）和t2（融凍期）細菌群落中包含更多氨基酸、脂類、能量和與異生素代謝相關的功能基因。而相比于t2（融凍期）細菌群落，萜類化合物和聚酮化合物的代謝功能在t0（初凍期）和t1（凍結期）細菌群落中更多的被表達。同時，聚糖合成與代謝相關的功能作用在t1（凍結期）和t2（融凍期）細菌群落中得到了加強。“分子信號轉導”是另一組通路類型，在細菌群落的功能預測中具有重要意義。相比于t0（初凍期）細菌群落，“轉錄”“翻譯”和“信號轉導”功能基因在t1（凍結期）和t2（融凍期）細菌群落中的表達更顯著（圖5b）。同時，細菌群落的“環境適應性”“細胞活性”和“細胞生長和死亡”也是3個時期細菌群落功能顯著差異的一類通路類型（圖5c）。t1（凍結期）和t2（融凍期）時期，細菌群落需要更高的細胞活性來適應凍融期的環境變化，但是仍然無法避免部分細菌類群在凍結期的消亡。

3 討論

3.1 凍融對高寒濕地土壤細菌群落結構的影響

凍融期內，高寒濕地土壤細菌群落的α多樣性指數變化趨勢明顯。t1（凍結期）細菌群落的多樣性、豐富度及均勻度遠低于t0（初凍期）和t2（融凍期）。t0（初凍期）土壤細菌群落復雜而穩定，生存環境適宜，物種數量最高。t1（凍結期）土壤溫度和土壤濕度對細菌群落具有較為強烈的選擇作用，大量細菌死亡，導致群落物種多樣性驟降。隨著t2（融凍期）的到來，土壤環境轉良，群落中優勢菌種加速繁殖。但由于凍融期環境因子的影響貢獻率較大，以致于細菌群落從冰凍中恢復后，大部分細菌類群活動表達存在潛在的時間延遲，這與我國東北沼澤土壤細菌凍融前后群落變化趨勢基本一致，差別主要表現在細菌類群豐度上的差異[25]，后者細菌類群中Acidobacteria（酸桿菌門）、Firmicutes（厚壁菌門）豐度較高。這些差異可能是由地域氣候、土壤養分及地上植被組成的不同造成的。

細菌群落結構對凍融期土壤環境變化響應敏感。高寒濕地土壤細菌群落進化出一系列復雜的適應能力，以抵消低動能環境和冰水轉化的潛在不利影響。凍融期土壤溫度、土壤濕度及積雪厚度的變化是影響細菌群落結構變化的主要因素。生長活躍的細菌類群，通常受凍融的影響更為嚴重。本試驗中，Chloro?flexi（綠彎菌門）在t1（凍結期）階段豐度驟降，Acido?bacteria（酸桿菌綱）和Betaproteobacteria（β-變形菌綱）甚至出現了消亡殆盡的現象。土壤碳氮養分的利用也被證明與異養細菌數量呈線性關系，而溫度和水分的有效性同樣也是影響異養細菌活性的重要因素[7]。短期凍融過程，C/N較低的細菌群落占比更大，部分類群仍保持較高活性，增強了土壤中無機氮的固持。具體的研究結果更依賴于凍融對微生物群落的影響強度以及微生物群落的恢復能力[26]。冗余分析結果顯示，凍融期t0（初凍期）和t2（融凍期）細菌群落中細菌群落結構與土壤TC、土壤TN關系更密切，而t1（凍結期）細菌群落則相反。同時，土壤TC和土壤TN在t1（凍結期）土壤細菌群落中含量最低，這可能是在t0（初凍期）～t1（凍結期）的前期階段，細菌群落活性較高，消耗了更多的土壤氮素的結果。對凍融期東北沼澤濕地土壤細菌群落的研究，通過主坐標分析（PCoA）同樣證實了細菌群落結構在凍融前后發生了明顯變化[25]，并通過冗余分析說明溫度和溶解性碳是濕地土壤細菌群落短期凍融前后發生變化的主要影響因子，綜合分析與本研究整體保持一致。總體來說，凍融期內土壤細菌群落中細菌群落結構差異明顯，演替頻繁，證明了細菌群落對環境變化的響應是迅速的。凍融期后，細菌群落多樣性和豐富度、均勻度均有所增加，也體現出不同的細菌類群在應對凍融期環境變化時具有不同的生存策略。

3.2 凍融對高寒濕地土壤細菌群落功能的影響

為更好地理解高寒濕地土壤微生物生態學，應將微生物群落功能與環境因子結合分析。細菌類群進化多種生理適應機制應對凍融環境變化，這使得它們可以在環境脅迫下生存甚至保持活躍。細菌群落的抗寒機制主要體現在膜流動性的調控、應答因子的產生、冷適應性基因的響應等方面。細菌群落礦化分解生態系統中的碳氮養分以支持自身面對壓力的生理反應及抗逆能力[27]。

圖5 凍融期巴音布魯克高寒濕地土壤細菌功能作用差異顯著性分析Figure 5 Significant difference analysis of soil bacterial functions in Bayinbuluk alpine wetland during freeze-thaw period

在t0（初凍期）和t2（融凍期）的土壤細菌群落中，“代謝”組功能基因通路被顯著表達。氨基酸代謝是涉及大量代謝產物的復雜過程，也是脂類、碳水化合物、核酸和信號分子合成的前體，在能量的生產中被用作底物。而細菌進行能量代謝，完成三羧酸循環和氧化磷酸化過程與土壤中碳氮養分保持緊密關系。脂類作為生物體維持正常生命活動不可缺少的四大基本物質之一，其合成代謝在能量存儲中起直接作用，同時因其影響細胞膜構成而對物質運輸起到一定的間接作用。通過初級代謝，細菌群落可以將營養物質轉化為結構物質、具有生理活性的物質或為生長提供能量。初級代謝的產物，都是機體生存的必備基礎，因此極為重要。初級代謝紊亂，可以導致細菌的生長障礙甚至突變或死亡。同時，在一定的生長階段會出現次級代謝類型，其對環境條件極為敏感。如萜類化合物、聚酮類化合物代謝等，在抗生素、激素的產生及抗逆性的增強方面具有重要意義[28]。t0（初凍期）和t2（融凍期）細菌群落中，Proteobacteria（變形菌門）和Chloroflexi（綠彎菌門）占比較大，遺傳多樣性極為豐富，生理代謝類型更為廣泛，且具有纖維素的降解作用。Cyanobacteria（藍藻門）作為t0（初凍期）細菌群落的代表類群，可直接固氮提高土壤肥力。Acido?bacteria（酸桿菌門）作為t0（初凍期）細菌群落的又一代表類群，在降解植物殘體多聚物方面具有重要作用。t0（初凍期）土壤環境溫和穩定，新鮮的凋落物對細菌群落可能具有一定的刺激作用。

在t0（初凍期）～t1（凍結期）階段的后期，土壤環境的劇烈變化對細菌群落具有脅迫作用。當細菌群落受到如碳氮養分匱乏、冷激或熱激過程以及滲透壓失常等脅迫時，RNA聚合酶依靠大量Rpos識別啟動子，調節基因表達，促進生存所必需基因的轉錄表達，這一系列的復雜過程可以發生在轉錄和翻譯階段或者降解過程中，以及活性調節方面[29]。t1（凍結期）土壤細菌群落中含有更多的“分子信號轉導”功能基因，同時，對應著典型常見嗜冷菌類Bacteroidetes（擬桿菌門）、Firmicutes（厚壁菌門）豐度的增加。嗜冷菌tRNA轉錄后被修飾的程度較低，從而降低結構穩定性，細胞膜含有大量不飽和脂肪酸，防止細胞膜從液晶態轉變為凝膠態，保證膜具有良好柔性和流動性[30]，這也是長時間低溫環境馴化的結果。土壤環境溫度的驟降，促使細菌相應誘導表達多種冷激蛋白，從而協助低溫脅迫條件下RNA的轉錄以及DNA的復制，維持DNA和RNA二次結構低溫下的可變性，如轉錄、翻譯、蛋白質折疊以及細胞膜透性調控等。

環境因子的強烈篩選作用，導致t1（凍結期）土壤細菌群落結構的變化，部分嗜冷菌類群成為優勢菌群。與此同時，“生存”是微生物所有功能作用的基本，在t0（初凍期）群落中表達最頻繁的是“細胞的生長和死亡”功能基因，演替是細菌群落的常態。而在t1（凍結期）和t2（融凍期）細菌群落中，更多被表達的功能基因是“環境適應性”和“細胞活性”，以增加自身的抗寒性，適應高寒濕地的低溫環境。

高寒濕地土壤微生物生態學一直是濕地科學研究的薄弱環節，亟需更多關注。人類對微生物活動的了解遠滯后于環境變化，更多的科學問題不斷涌現。微生物群落的功能組成對氣候變化的適應機制如何？凍土區或凍融區土壤養分的有效性及其對微生物功能群落及酶活性的影響如何？未來應開展增加系統研究，綜合運用多種技術方法來度量微生物生理活動，為厘清和預測未來氣候變化條件下微生物在地球化學循環過程中的功能作用提供科學信息。

4 結論

（1）凍融期對巴音布魯克高寒濕地土壤細菌群落物種多樣性產生較大影響。凍結期，細菌群落物種多樣性、豐富度以及均勻度均顯著降低。

（2）凍融期內，細菌群落受土壤環境和養分的顯著影響，群落結構對微生境變化響應迅速，優勢菌群演替過程明顯。

（3）細菌群落功能發生顯著變化，整體趨勢表現為：凍融期前期，通過“代謝”供能和“信號轉導”調控來增強群落的“環境適應性”（抗寒性），從而維持凍結期和融凍期的“生存”及“細胞活性”。