單壁碳納米管載錦鯉皰疹病毒ORF149核酸疫苗的構建

胡峰 王慶 李瑩瑩 曾偉偉 王高學 朱斌 王英英 尹紀元

（1. 中國水產科學研究院珠江水產研究所 農業部漁藥創制重點實驗室 廣東水產動物免疫技術重點實驗室，廣州 510380；2. 上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306；3. 西北農林科技大學動物科技學院，楊凌 712100）

鯉皰疹病毒3型，又稱為錦鯉皰疹病毒（Koi herpesvirus，KHV）， 是 引 起 鯉（Cyprinus carpio Linnaeus）、錦鯉及其變種錦鯉皰疹病毒?。↘oi herpesvirus disease，KHVD）的病原。自1997年在德國首次發現以來，截至目前，已經在以色列、美國等全球多個國家報道。KHVD死亡率高達80%以上，對全世界多個國家地區的鯉魚及錦鯉養殖產業造成了巨大的經濟損失［1］。

目前，錦鯉皰疹病毒病沒有藥物可以防控，疫苗是控制疾病最有效的方法。有5種基本的疫苗概念：活疫苗、減毒疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗和DNA疫苗。在實驗室條件下，活疫苗能夠提供較好保護，但其可能造成毒力較大殘留，應用于實際存在一定的安全風險［2］。大多數可用于水產養殖的疫苗是滅活的非復制疫苗［3］。然而，與大多數細菌疫苗所達到的保護相比，滅活疫苗實際的免疫保護性相對較低［4］。亞單位疫苗是去除病原體中與激發機體保護性免疫無關甚至有害的成分，但保留有效免疫原成分制作的疫苗。關于KHV亞單位疫苗研究的報道不多，張子鵬等［5］利用pET原核表達系統表達KHV ORF030和ORF131，注射免疫鯉魚后進行攻毒檢測，保護率20%-60%不等。DNA疫苗是由裸質粒DNA組成，會導致疫苗接種的魚肌肉組織中致病蛋白的基因表達，引起機體免疫應答產生相關抗體，從而起到免疫保護作用［6］。相比傳統疫苗具有高效性、易于制備、穩定性高等優點，缺點是需要通過注射免疫，只適合個體注射，不適合大規模的接種，在實際養殖中具有一定的限制性。DNA疫苗首次在魚類中利用并產生功效是虹鱒魚對感染性造血壞死病毒的免疫實驗［7］。隨后，有學者對病毒性出血性敗血癥［8］、病毒性神經壞死病毒［9］、感染性胰腺壞死病毒［10］、病毒性出血熱敗血癥病毒［11］和鯉春病毒［12］的DNA疫苗進行了大量研究。Zhou等［13-14］分別以KHV ORF25、ORF81為靶基因制備的DNA疫苗經證明能顯著降低死亡率（小于20%），表明DNA疫苗具有較好的防控效果。

CyHV-3隸屬于皰疹病毒目異皰疹病毒科鯉皰疹病毒屬，是具有囊膜的雙鏈DNA病毒［15］，病毒顆粒直徑為167-200 nm，基因組全長295 kb，共編碼164個開放閱讀框（Open reading frame，ORF），是已知基因組最大的皰疹病毒［16-18］。生物質譜技術鑒定結果表明，CyHV-3含有46個結構蛋白，包括16個囊膜蛋白、3個衣殼蛋白、2個皮層蛋白和25個未知蛋白［19］。純化的CyHV-3病毒顆粒的質譜分析檢測到40種編碼的基因產物，包括13種預測的包膜蛋白［20］。然而，到目前為止，僅使用特異性抗血清或單克隆抗體（mAb）鑒定和表征了少數CyHV-3蛋白。采用KHV陽性血清識別純化病毒粒子，再通過質譜分析產生抗體的主要免疫原性蛋白，篩選出ORF92、ORF66、ORF72和ORF81。另外，德國KHV OIE參考實驗室驗證ORF149蛋白具有較強的免疫原性，這些是本研究中疫苗研制的重要候選抗原。Michel等［21］借助液相色譜串聯質譜分析，確定了KHV 基因組中有13個ORF編碼囊膜蛋白，包括ORF132、ORF059、ORF65、ORF136和 ORF149等，在此之前，通過試驗唯一能確定編碼囊膜蛋白的僅有 ORF81［22］。

ORF149基因全長2 100 bp，含699個氨基酸，理論分子量為72.0 kD，只包含一個潛在的N-糖基化位點，93個O-糖基化位點。Fuchs等［23］在細菌和昆蟲細胞中成功表達ORF149，產生多克隆/單克隆抗體（PAbs/MAb），以此來研究它的免疫原性。此外，通過間接免疫熒光和免疫電鏡分析發現，ORF149識別CyHV-3病毒粒子能夠產生特異的中和Mab，證明ORF149可能是其主要免疫顯性蛋白之一［20］。Torrent等［24］通過新型 ELISA 方法發現ORF149編碼的蛋白質具有抗原性，并將其免疫顯性表位定位于蛋白質氨基末端部分。ORF149編碼的包膜糖蛋白，具有中和表位，可能在病毒附著和細胞穿透中發揮作用，因此是疫苗開發和診斷測試的良好目標抗原［25］。

碳納米管（Carbon nanotubes，CNTs）作為一些特定結構的藥物載體，具表面積大、體積小、表面反應活性高、易于表面修飾和優良跨膜作用。納米載體是以納米尺度材料制成的，能夠攜帶具有診斷和治療用途的藥物和基因分子的載體。納米載藥系統能夠改善藥物理化性質、極易穿透細胞膜、組織屏障，可高劑量的實現靶向給藥到細胞內發揮生物學效應，已經成為動物疫苗的重要載體，成為國內外研究的熱點。關于魚類納米載體疫苗的研制，也是近年來水產疫苗的研究熱點，并且主要以納米包裹顆粒的形式出現。Adomako等［26］制備了PLGA納米載傳染性造血壞死病毒DNA疫苗，口服免疫虹鱒可刺激免疫應答；Rivas-Aravena等［27］用殼聚糖納米載傳染性鮭魚貧血病 DNA疫苗口服免疫大西洋鮭魚，能夠顯著提高免疫保護率。

因此，本研究在克隆、分析KHV囊膜蛋白ORF149基因的基礎上，將其完整編碼序列插入PcDNA-3.1（+），構建重組質粒，再與氨化的單壁碳納米管進行連接，構建單壁碳納米管載ORF149核酸疫苗，旨為探索KHV疫苗的增效機制、開發新型KHV核酸疫苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

鯉魚腦細胞系（CCB）由德國動物健康研究院（FLI）病原學研究所KHV參考實驗室Sven M.Bergmann博士饋贈；鯉皰疹病毒3型GZ1301株由本實驗室分離和保存；載體pMD18-T及E. coliDH5α 購自日本 TaKaRa公司 ；pcDNA-3.1（+）由本實驗室保存；單壁碳納米管（SWCNTs）樣品由西北農林科技大學王高學教授惠贈。

瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（DP209-03）、質粒小提試劑盒（DP103）、DAB顯色試劑盒購自天根生化科技有限公司；rTaq Mix、限制性酶XhoI和EcoR I、DNA-Tailing Kit（6109）、DNA marker、T4 Liqase和 Liqase buffer 購自TaKaRa公司；X-treme gene HP DNA transfection Reagaent購自Roche公司（瑞士）；兔抗KHV抗體由本實驗室制備和保存；SDSPAGE試劑盒、Alexa Fluor 488標記的羊抗兔 IgG（H+L）購自Life Science公司（美國）。其他試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 基因克隆 根據GenBank中CyHV-3 ORF149基因序列，用Primer Premier5.0設計特異性引物（F：CAGAATTCCTGAGGACCATGCTCCGTC；R：CACTCGAGCAAGCAAGCAAAAGCAC；劃線部分分別為限制性內切酶EcoR I和XhoI 酶切位點）并由生工生物公司合成。

PCR反應體系：12.5 μL rTaq Mix、上下游引物各 1 μL（10 μmol/L）和 2 μL DNA 模板，補滅菌水至25 μL。反應程序如下：94℃，5 min；94℃，30 s，55℃，30 s，72℃，45 s，30個循環；72℃，10 min。將PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收后與 pMD18-T載體連接，轉化至DH5α感受態細胞，篩選陽性克隆進行菌液PCR和雙酶切鑒定，并由艾基生物公司測序驗證。

1.2.2 重組表達質粒構建 對重組克隆載體pMD18-T-ORF149、真核表達載體pcDNA-3.1（+）進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳、切膠、回收、DNA純化試劑盒純化，再將目的片段和雙酶切后的真核載體進行連接。酶切體系為 ：10×buffer 2 μL，EcoR I和XhoI各 1 μL，質粒 1 μg，補 ddH2O 水至20 μL。37℃水浴酶切2 h。連接體系 ：T4 Liqase 1.5 μL，10×T4 Liqase buffer 1.5 μL，pcDNA-3.1（+）3 μL，目的片段 9 μL。16℃連接過夜。將連接產物轉化至DH5α感受態細胞，篩選陽性克隆進行菌液PCR和雙酶切鑒定并由艾基生物公司測序驗證，該重組真核載體命名為pcDNAORF149。

1.2.3 獲取大量重組質粒 將含pcDNA-ORF149重組質粒的大腸桿菌DH5α，37℃振蕩培養1 h，涂于LB平板（含氨芐青霉素）培養，37℃過夜。挑取單菌落于LB液體培養基（含氨芐青霉素），37℃振蕩培養，過夜，從中另取1%菌液于新培養基中擴大培養，至OD600為0.6。參照說明書操作，采用無內毒素質粒提取試劑盒提取pcDNA-ORF149重組質粒。并通過瓊脂糖凝膠電泳和微量核酸分析儀檢測提取重組質粒的純度和含量。

1.2.4 質粒DNA瞬時轉染 將1個75 cm2細胞培養瓶的RK13單層細胞用胰酶消化后，用含10%犢牛血清的DMEM營養液吹打分散細胞，然后以一定密度接種于1個48孔細胞培養板（0.3 mL/well，用于做間接免疫熒光試驗）和1個6孔細胞培養板中（2 mL/well，用于免疫印跡分析（Western blotting）檢測，置37℃、5% CO2培養箱中培養。待培養細胞長至70%-80%單層時，用于真核表達質粒的轉染，本研究采用Roche 公司的X-treme gene HP DNA transfection Reagaent 進行轉染，具體轉染步驟參照說明書進行。

1.2.5 SDS-PAGE與Western blotting 轉染72 h后，收集6孔板轉染各種質粒和空白對照的細胞，進行West-blotting檢測。制備好1塊分離膠濃度為12%的SDS-PAGE膠；棄去細胞培養基，用PBS將細胞洗滌1次，然后用細胞刮刀將細胞從培養板上刮下來，分別放入到1.5 mL離心管中，6 000 r/min 離心2 min；在細胞沉淀中加入適量的 1× SDS- PAGE上樣緩沖液混勻，煮沸處理5 min；15 000 r/min離心3 min；將樣品加入到SDS- PAGE膠的對應孔中，200 V電泳45 min，進行蛋白分離；采用半干轉膜儀將蛋白移轉至硝酸纖維膜，轉膜條件是25 V作用 2 h；用含5%的脫脂乳的PBS室溫下封閉1 h或者4℃封閉過夜；加入20 mL含5%脫脂乳的PBST稀釋的（1∶1 000）兔抗KHV全病毒多抗，室溫下孵育1 h或者4℃封閉過夜；TBS-T洗滌3次，每次10 min；加入用TBST稀釋的（1∶5 000）HRP標記的二抗，避光作用60 min；避光用PBS-T洗滌5次，每次5 min；采用熒光信號掃描成像系統進行掃描，檢測特異性熒光信號。

1.2.6 間接免疫熒光（Indirect immunofluorescent assay，IFA） 在48孔板中轉染后72 h的細胞，將培養基棄掉，用PBS（pH7.4）洗2次，然后每孔加入100 μL 甲醇和丙酮（1∶1）混合液，-20℃固定30 min；倒掉固定液，在溫箱中晾干，大約干燥30 min；室溫下PBS洗滌3次，每次5 min，洗滌時放在小型搖床上輕微搖晃；用含有10% FBS（胎牛血清）的PBS室溫下封閉1 h；棄去封閉液，每孔加入100 μL用含10% FBS的PBS 1∶100稀釋的兔抗錦鯉皰疹病毒全病毒多抗，輕微搖晃室溫下孵育1 h；室溫下PBS洗滌3次，每次5 min；加入用PBS稀釋的（1∶10 000稀釋）alexa fluor 488 anti-rabbit IgG二抗，輕微搖晃室溫下孵育1 h；室溫下PBS洗滌4次，每次5 min；加入適量的碘化丙啶（PI）進行染核，室溫下孵育20 min；在熒光顯微鏡下觀察熒光并拍照。

1.2.7 單壁碳納米管載重組質粒表達系統構建 采用空氣氧化法［28］，將SWCNTs樣品置于馬弗爐中450℃加熱30-40 min，使樣品中的無定型碳轉變成CO2。采用混酸氧化法［29］，將上述空氣氧化法處理的SWCNTs樣品放入混酸（濃H2SO4∶濃HNO3=3∶1（V/V））中60℃加熱酸化處理12 h。碳納米管混酸混合物經微孔濾膜抽濾、純水洗滌至pH不再變化后置于80℃條件下干燥至恒重，即可獲得氧化單壁碳納米管（o-SWCNTs）。

通過1，3-偶極環加成反應法［30］對氧化修飾的o-SWCNTs 樣品進行共價修飾。參照碳納米管和DNA質粒交聯方法［31］，將氨基化修飾單壁碳納米管超聲分散于PBS（pH7.4）緩沖液中，配成4 mg/mL的溶液。根據重組質粒pcDNA-ORF149的濃度，將其分散于PBS（pH7.4）溶液中，配成1 mg/mL的溶液。隨后分別各取上述單壁碳納米管溶液0.5 mL緩慢滴加到0.5 mL重組質粒pcDNA-ORF149溶液中，28℃恒溫攪拌30 min，制備單壁碳納米管載 pcDNAORF149核酸疫苗系統（SWCNTs-pcDNA-ORF149）。

1.2.8 單壁碳納米管載重組質粒合成效果檢測

1.2.8.1 核酸瓊脂糖凝膠電泳 單壁碳納米管，全部由碳原子構成，幾何結構可以視為由單層石墨烯卷曲而成，結構決定性質，因此單壁碳納米管具有優異的電子、機械、力學等性能。在本研究中，經氨基化修飾后的SWCTs與質粒在超聲作用下進行共價偶聯，形成單壁碳納米管載重組質粒系統。由于質粒的帶電性，在瓊脂糖凝膠電泳中會形成泳跡條帶，而質粒與單壁碳納米管共價結合后不能穿透瓊脂糖凝膠。所以，通過核酸瓊脂糖凝膠電泳可以檢測單壁碳納米管載重組質粒系統的合成效果。

1.2.8.2 掃描電鏡觀察 將制備的單壁碳納米管載 pcDNA-ORF149核酸疫苗樣品10 000×g下離心10 min，然后真空冷凍干燥至粉末狀態，通過場發射掃描電子顯微鏡（FE-SEM，JSM-7500F，JEOL，Tokyo，Japan）直觀檢測單壁碳納米管載 pcDNAORF149核酸疫苗系統（SWCNTs-pcDNA-ORF149）合成效果。

2 結果

2.1 目的基因克隆

PCR產物瓊脂糖凝膠電泳，可見1條2 100 bp左右的片段，與預期的片段大小符合（圖1）。測序后經BLAST比對，與GenBank中登錄的 KHV ORF149基因（NC_009127.1）核苷酸一致性為99%，本研究成功克隆了KHV ORF149基因。

圖1 PCR擴增ORF149基因產物電泳圖

2.2 重組真核載體的鑒定

將構建的重組原核載體pcDNA-ORF149進行雙酶切鑒定，獲得與預期大小相符的兩條條帶，表明重組原核載體構建成功（圖2）。

圖2 重組質粒pcDNA-ORF149雙酶切鑒定結果電泳圖

2.3 Western blotting分析

Western-blotting檢測結果顯示（圖3），pcDNA 3.1-ORF149真核表達質粒在轉染RK13細胞后，顯現出特異性條帶，即能檢測到特異性熒光信號，而未轉染質粒的空白對照細胞沒有檢測到熒光信號，表明重組質粒轉染后可成功表達目的蛋白。

圖3 真核重組表達載體pcDNA3.1-ORF149轉染細胞后Western-blot檢測結果

2.4 間接免疫熒光（IFA）分析

IFA結果顯示（圖4），pcDNA3.1-KO149真核表達質粒在RK13細胞中能檢測到特異性熒光信號，而未轉染質粒的空白對照細胞沒有檢測到熒光信號，再次驗證重組質粒轉染后可成功表達目的蛋白。

圖4 pcDNA-ORF149轉染后IFA檢測結果

2.5 單壁碳納米管載重組質粒合成效果檢測結果

2.5.1 核酸瓊脂糖電泳 將合成的不同濃度單壁碳納米管載重組質粒表達系統進行瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示連接后的表達系統在電泳圖譜上未出現條帶（圖5），說明連接成功。

圖5 單壁碳納米管載重組質粒合成檢測電泳

2.5.2 FE-SEM 從FE-SEM觀測結果中可以看出，單壁碳納米管載重組質粒系統中呈細管狀的o-SWCNT聚集性更好（圖6-A），與未加質粒的o-SWCNTs（圖6-B）差異明顯，而正是由于帶電荷的DNA基團的加入，才會改變其聚集狀態，因此說明單壁碳納米管與重組質粒連接成功。

3 討論

錦鯉皰疹病毒病是20世紀末確定的一種疾病，現已在全球范圍內爆發，嚴重威脅鯉和錦鯉養殖產業安全，是世界動物衛生組織（OIE）規定必須申報的疾病，為我國二類疫病。目前對該病的防治已經取得了一些進展，以色列科學家曾通過細胞培養的方式獲得傳代細胞系和致病力弱的毒株［32］，直接接種錦鯉和普通鯉，可以起到很好的免疫作用。而我國對該病的防治主要停留在使用抗生素階段，治療效果并不理想。大劑量抗生素的使用導致病毒產生耐藥性和變異，從而更難徹底根除此病。疫苗是控制病毒性疾病最有效的途徑，在一些常見的水產動物病毒病防控上應用廣泛。對于錦鯉皰疹病毒的防控，國內外專家都展開了積極研究。減毒疫苗和改良的活疫苗在實驗中證明具有顯著的抗病效果，對鯉魚具有一定的保護作用。但皰疹病毒的特點之一是在初次感染后具有潛伏宿主的能力，在一定的應激條件下，潛伏的病毒可被激活導致宿主發病?，F有的減毒疫苗存在毒力返強的風險，因此安全隱患令人擔憂。KHV全病毒滅活疫苗保護效果不佳，用KHV滅活病毒制備的脂質體疫苗免疫后鯉魚后，一定程度上提高了其免疫保護率，但成本較高。其他疫苗如滅活疫苗、普通DNA疫苗、亞單位疫苗亦存在安全性、免疫保護率低、成本高等缺點，不利于臨床應用和推廣。因此研制安全高效低成本的疫苗成為有效防治錦鯉皰疹病毒的重要手段之一。

圖6 單壁碳納米管載重組質粒合成FE-SEM觀察結果

疫苗載體系統已被廣泛研究，因為它們能有效地遞送抗原/ DNA分子，將肽/ DNA轉運到所需的位置并保持較高的濃度［33］。碳納米管（CNTs）作為一種新型納米載體所具有的特性，有利于其作為DNA疫苗復合物中的運載體［34］。這些特征包括低毒性、體內穩定性、較低的自身免疫原性及附加多個抗原的能力［34］。此外，碳納米管的顆粒性質和它們能夠快速進入抗原呈遞細胞（如樹突狀細胞）的優越特性，使得它們具有極高的潛力作為抗原/DNA載體［35-37］。

我國關于魚類納米載體疫苗的研究，Wang等［38］首先發現單壁碳納米管（Single-walled carbon nanotubes，SWCNTS）在水體中能夠高效穿透魚體表組織，能夠利用化學鍵將功能化修飾的碳納米管與草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）多種蛋白和嗜水氣單胞菌aerA蛋白偶聯制備的亞單位疫苗［39］，通過浸浴免疫夏花草魚均可提高免疫保護率，免疫相關基因和抗體水平顯著提高。Zhang等［40］用單壁碳納米管連接pET32a-G蛋白重組亞單位疫苗，在針對鯉春病毒（Spring viremia of carp virus，SVCV）浸泡及注射免疫中均能提高免疫保護率。在碳納米管載重組質粒的研究方面，Zhang等［41］用編碼基質蛋白的M基因成功構建SWCNTs-pcDNA-M核酸疫苗，在對鯉春病毒的肌肉注射免疫中可以增強約17.5%的保護率。研究結果證實，碳納米管不同于其它包裹顆粒形式的納米材料僅具緩釋、佐劑增效的作用，碳納米管偶聯疫苗呈管狀，不但具有緩釋、佐劑增效的同時，而且更重要的是穿透魚體表組織、細胞膜及細胞器的功能，并以化學合成的化學鍵連接蛋白及核酸疫苗，通過浸浴免疫和注射免疫，可以達到高效免疫效果。

本研究構建的單壁碳納米管核酸疫苗，相較于傳統的 KHV 減毒疫苗［42］、亞單位疫苗［43］、常規核酸疫苗［44］等，由于碳納米管的特性，理論上能夠更好的遞送抗原，達到更強的免疫保護作用。此外，傳統的疫苗一般通過注射免疫才能達到較好的保護效果，碳納米管疫苗因其微粒性和較強的體表滲透能力，可通過浸泡免疫產生相近的保護效果，這將極大降低疫苗操作和應用成本。單壁碳納米管載KHV ORF149核酸疫苗，能否起到免疫增效作用，有待于進一步實驗驗證。

4 結論

本實驗通過制備pcDNA-ORF149重組真核表達質粒，在驗證其能夠穩定表達后，將其成功與氨化后的單壁碳納米管連接，組成了單壁碳納米管載ORF149表達系統。