基于退火緩沖液的SLiCE無縫克隆方法的改良

楊東成 蔡松 趙筱 王金華 王永澤

（湖北工業大學生物工程與食品學院，武漢 430068）

構建重組質粒是現代分子生物學中十分重要的技術。傳統的質粒構建多采用限制性核酸內切酶和DNA連接酶的方式［1］，但這種方法常依賴酶切位點，酶切耗時較長還可能會引入一段不需要的序列，另外限制性核酸內切酶的價格也較為昂貴。近幾年以來，無縫克隆的方法發展迅猛［2-5］，相比較傳統方法，無縫克隆的方法不受酶切位點限制而且操作簡便快速。

目前市場上無縫克隆試劑盒種類繁多，如NEB公司的NEBuilder試劑盒、Thermo公司的GeneArt試劑盒、CloneTech公司的In-Fusion試劑盒等。其采用的無縫克隆技術和原理各有不同，共同的特點是成本相對較高，每次反應大約需要18-36美元［6］。Zhang等［7］所 建 立 的 SLiCE（Seamless ligation cloning extract）方法是一種利用大腸桿菌細胞內同源重組相關酶進行DNA克隆的新方法，其機理在于不依賴于 RecA-的片段重組［8-12］。Motohashi［13］從成本角度進一步優化了SLiCE技術，選用RecA-實驗菌株E.coliJM109提取細胞裂解液，并優化了裂解液配方降低了裂解成本，使基于SLiCE技術的反應折合人民幣僅僅0.4元一次［14］。相比較于市面上的無縫克隆技術，SLiCE技術為目前最便宜的無縫克隆技術［14］。

雖然SLiCE反應能實現較為經濟的無縫克隆，但是SLiCE反應產物的轉化依賴于高轉化效率的感受態細胞，例如Zhang等［7］采用1×1010CFU/μg電轉化效率的感受態細胞和1×109CFU/μg的化學轉化效率的感受態細胞，Motohashi［13］則采用的是1×108CFU/μg化學轉化效率的感受態細胞。商業化的高感受態細胞價格不菲，但自制高感受態細胞工序較為繁瑣，且轉化效率往往不穩定，因此很多無縫克隆方法建立時都考慮到了感受態細胞效率這個因素［6，14］。

對于無縫克隆的高感受態細胞依賴問題，Zhang等［7］將λ噬菌體Red/ET重組系統導入到DH108菌株用于SLiCE反應，通過提高克隆子形成率從而提高克隆效率［14］，由于菌株不易獲得使得該方法推廣到各個實驗室有一定困難；王廣珺等［15］在使用T4聚合酶進行無縫克隆的基礎上，通過添加退火緩沖液進行退火處理，將重組效率提高了10倍之多。

據最新報道體內細胞進行核酸片段重組是基于核酸外切酶［16］，對于采用細胞裂解液進行無縫克隆的SLiCE而言，我們推測采用退火處理［15］的方式也有可能提高SLiCE的重組效率。此外，電轉化法很容易獲得很高的轉化效率，但此前無縫克隆采用電轉化鮮有成功的例子，我們推測很可能與無縫克隆反應帶來雜質有關，如SLiCE反應就有反應緩沖液，因此本文對SLiCE反應產物進行了純化后再實施電轉化，以期待獲得更高的克隆效率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 本研究采用的菌株大腸桿菌（Escherichia coli）JM109、DH5α、MG1655 以及質粒pUC19等均為實驗室保存。

1.1.2 培養基 LB培養基：1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，0.5% NaCl；2×YT 培養基：1.6%胰蛋白胨，1% 酵母提取物，0.5% NaCl；SOC培養基：2%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，10 mmol/L NaCl，2.5 mmol/L KCl，10 mmol/L MgCl2，10 mmol/L MgSO4，20 mmol/L葡萄糖。

1.1.3 酶和試劑 高保真酶：PrimeSTAR Max DNA PoLymerase，大連TaKaRa產品；Taq聚合酶：2×Taq Master Mix（Dye Plus），南京Vazyme產品；限制性核酸內切酶：EcoR I和BamH I，大連TaKaRa產品；裂解緩沖液：3%（W/V）Triton X-100，50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）［17］；SLiCE buffer（10×）：500 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，100 mmol/L MgCl2，10 mmol/L ATP，10 mmol/L 二硫蘇糖醇，用0.22 μm濾膜過濾，以40 μL體積分裝到PCR管中，放置-20℃保存；10×退火緩沖液：0.1 mol/L Tris-HCl，pH 8.0，1 mol/L NaCl，10 mmol/L EDTA；硅藻土懸濁液：稱取1 g硅藻土（Celite545，Fluka），用5 mL蒸餾水懸浮并輕輕倒入已裝有45 mL蒸餾水的Falcone管中，4 min后回收懸濁液，再經1 300×g離心1 min，棄上清液。離心所得的顆粒用1 mL蒸餾水懸浮，經高壓滅菌后4℃保存備用［18］。

1.1.4 儀器與設備 MyCycler PCR儀，美國Bio-Rad公司產品；DYY-6C型電泳儀，北京是六一儀器廠產品；凝膠成像儀、金屬浴恒溫儀，美國Major Science公 司 產 品；Centrifuge 5417R、Centrifuge 5804R離心機，美國 Eppendorf公司產品。

1.2 方法

1.2.1 插入DNA片段和線性化載體DNA 的制備 有兩種方式都可將質粒變成線性化載體，其具體做法如下：

1.2.1.1 雙酶切法制備線性化載體 以來源于E.coliMG1655的可溶性吡啶核苷酸轉氫酶（Soluble Pyridine Nucleotide Transhydrogenase，udhA）的基因片段udhA（1 401 bp）作為插入基因，pUC19質粒作為線性化載體的模板。插入DNA片段采用表1的udhA-F和udhA-R引物進行擴增，采用限制性內切酶EcoR I和BamH I對pUC19質粒進行切割以獲得雙酶切線性化載體。隨后DNA片段都經過乙醇沉淀和膠回收試劑盒（OMEGA）純化。

表1 引物及序列

1.2.1.2 PCR擴增線性化載體 采用Linearized pUC-F 和Linearized pUC-R引物，以pUC19為模板，采用高保真酶進行PCR，PCR條件為：98℃預變性 30 s；98℃變性 10 s，50℃退火 15 s，72℃延伸30 s，共30個循環；最后72℃延伸5 min。對應的插入DNA片段則采用表1的LinearizedudhA-F和LinearizedudhA-R引物進行擴增。插入DNA和載體DNA的同源區域大小設計為19 bp。

1.2.2 SLiCE提取物的制備及反應 參考Okegawa等［14］的方法制備SLiCE提取物：從LB平板上挑取JM109單菌落于LB培養基（1 mL）中，放置搖床37℃、200 r/min過夜培養。然后轉到裝有50 mL 2×YT培養基的搖瓶中，37℃，200 r/min培養至OD600到3.0（對數生長后期，約3.5 h），隨后在4℃及5 000×g條件下離心10 min，棄去上清液，加入50 mL預冷的無菌水洗滌，再一次在4℃及5 000×g條件下離心5 min，棄去上清液。加入1.2 mL 裂解緩沖液輕輕的重懸，室溫放置10 min。細胞裂解產物在16 000×g，4℃離心2 min，上清液轉移到1.5 mL管與等體積的冰浴的80%（V/V）甘油混合。以上制備所得的SLiCE提取物以40 μL每管裝到0.2 mL PCR管，干冰速凍后放置于-80℃冰箱長期保存，如3個月內使用也可放置在-20℃冰箱。

SLiCE反應溶液由以下成分組成：線性化載體DNA，適量的插入DNA片段，1 μL 10×SLiCE buffer，1 μL SLiCE提取物，加入無菌水使反應體系達到10 μL。將SLiCE反應混合物放于金屬浴恒溫儀在37℃反應30 min，隨后進行轉化。

1.2.3 SLiCE反應產物的轉化 選用了兩種方式制備感受態細胞，并用1 μL 濃度為1 ng/μL的pUC19質粒測定了感受態細胞的轉化效率。采用Inoue法［19］制備感受態細胞，測得轉化效率約為1×107CFU/μg；采用傳統的CaCl2法制備感受態細胞，測得轉化效率為 1×105-1×106CFU/μg。

SLiCE反應產物化學轉化方法：將100 μL感受態細胞放置冰上解凍，加入10 μL的SLiCE反應產物，輕輕混勻，置于冰水浴放置30 min，然后放置在42℃水浴鍋中90 s后，迅速放回冰上停留2 min，隨后加入預熱至37℃的890 μL SOC培養基，混勻，轉移到10 mL離心管，于37℃、200 r/min的搖床中培養1 h。將菌液于離心機12 000 r/min室溫離心1 min，棄去上清800 μL，用剩余的上清液重懸沉淀，全部涂布于含100 μg/mL 氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養12-16 h。

1.2.4 克隆子驗證 挑取轉化子作為模板，采用Taq聚合酶和驗證引物V-pUC-udhA-F和V-pUC-udhA-R（表1）進行菌落PCR。PCR條件為95℃預變性5 min；95℃變性10 s，53℃退火10 s，72℃延伸1 min，共30個循環；最后72℃延伸10 min。采用0.8%瓊脂糖凝膠在100 V電壓下對PCR產物進行電泳分析，如果條帶大小為1 982 bp表明該轉化子為克隆子，若條帶大小為552 bp，則為未被酶切的質粒形成的轉化子，判定為假陽性。根據電泳結果統計克隆子數，根據公式計算重組效率：

1.2.5 SLiCE反應優化實驗

1.2.5.1 DNA濃度對SLiCE反應的影響 在Okega-wa等［14］的研究結果發現，當插入DNA片段與載體的摩爾比在10∶1時，SLiCE反應后克隆效率最高?；诖宋覀冊趯NA濃度進行優化前先將插入DNA片段與載體的摩爾比確定為10∶1。

為明確DNA濃度對SLiCE反應效率的影響，在確定插入DNA與線性化載體摩爾比為10∶1的條件下，設定線性化載體濃度為10 ng、50 ng和100 ng，考察線性化載體濃度對SLiCE反應的影響。將插入DNA片段（基因片段）和線性化載體在37℃下進行SLiCE反應30 min，隨后將SLiCE反應產物全部轉化至感受態細胞（轉化pUC19質粒效率為1.16×107CFU/μg），進行克隆子驗證并計算重組效率。

1.2.5.2 退火方式對SLiCE反應的影響 采用兩種不同退火方式考察退火方式對SLiCE反應的影響：

（1）先退火處理，再進行SLiCE反應：在DNA片段混合液（含50 ng線性化載體，插入DNA與線性化載體摩爾比為10∶1）中加入1 μL 10×退火緩沖液，用超純水補充至總體積為8 μL，進行以下退火程序：75℃ 10 min，每1 min降低1℃，至37℃。隨后加入 1 μL 10×SLiCE buffer與 1 μL SLiCE 提取液在37℃下反應30 min；

（2）先進行SLiCE反應，后退火處理：DNA片段混合液先加入 1 μL 10×SLiCE buffer與 1 μL SLiCE提取物并用ddH2O補充至總體積9 μL，37℃下進行SLiCE反應30 min，隨后加入1 μL 10×退火緩沖液進行退火程序。將SLiCE反應產物全部轉化至感受態細胞（轉化pUC19質粒效率為1.16×107CFU/μg），進行克隆子驗證并計算重組效率。

1.2.5.3 電轉化法對SLiCE反應的影響 相對于化學轉化法，電轉化法轉化效率更高，但是用于無縫克隆效果并不理想。我們認為其原因可能是未將無縫克隆反應后的溶液進行純化。

（1）SLiCE反應產物的純化 將DNA片段混合液（含50 ng線性化載體，插入DNA與線性化載體摩爾比為10∶1）在37℃下進行SLiCE反應30 min，隨后加入退火緩沖液進行退火程序，再利用硅藻土懸濁液將SLiCE反應產物進行純化［20］：將SLiCE反應后的溶液先用3倍體積的6 mol/L NaI混合室溫放置2-5 min，加入到約20 μL硅藻土懸濁液中，混勻，冰上放置15 min，期間每分鐘混勻1次。12 000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀用70%乙醇懸浮。再次12 000 r/min離心5 min，棄上清。沉淀在室溫條件下自然干燥數分鐘后，加入經70℃預熱的30 μL的超純水，室溫靜置2-5 min，期間每分鐘混勻1次。最后12 000 r/min離心5 min，在盡量不要吸到硅藻土條件下取上清液，于-20℃保存備用。

（2）電轉化感受態細胞制備及電轉化 從LB平板上挑取E.coliDH5α單菌落于2 mL 的LB培養基中，放置搖床37℃、200 r/min過夜培養后，取1 mL菌液接種到50 mL LB培養基中，一共接種兩瓶，放置搖床37℃、200 r/min培養至OD600到0.3-0.4。菌液放置冰上預冷30 min，隨后在4℃、6 000 r/min離心5 min，棄上清，用40 mL預冷的滅菌后的超純水重懸，再次離心，收集兩管的菌體合并后重懸至一管，然后離心棄上清，用預冷的滅菌后的超純水重懸至總體積約為 240 μL。取 80 μL 菌液與 10 μL 純化后的SLiCE反應液于冰上預混，轉移至電極杯，放至電轉化儀（Bio-Rad）調電壓為2.5 kv進行電擊，電擊時間約4.9 ms，立即加入200 μL 預熱至37℃的SOC培養基，使用移液器輕輕吹打混合。轉移所有菌液到10 mL離心管，補加SOC培養基至1 mL，37℃，200 r/min復蘇1 h。所有菌液涂布于含100 μg/mL 氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養12-16 h后進行克隆子驗證并計算重組效率。

1.2.5.4 感受態細胞的轉化效率對SLiCE的影響 分別采用 1×105、1×106和 1×107CFU/μg 轉化效率的感受態細胞轉化SLiCE反應，以確定感受態細胞轉化效率對SLiCE的影響。SLiCE反應采用10 ng的線性化載體，插入DNA與線性化載體摩爾比為10∶1，于37℃反應30 min，隨后化轉到相應轉化效率的感受態細胞中，隨后進行克隆子驗證并計算重組效率。

2 結果

2.1 DNA濃度對SLiCE反應的影響

我們將插入DNA片段的濃度確定為載體摩爾濃度的10倍，對SLiCE反應所需的線性化載體的量進行了優化，結果如表2所示。

當線性化載體的量從10 ng提升到50 ng時，轉化子數目有了很大幅度的提升，提高了近4倍，當線性化載體的量從50 ng提升到100 ng后，轉化子數目變化不大。挑取轉化子進行PCR驗證實驗發現，提高線性化載體的量后重組效率仍保持在很高的水平（圖1）。

表2 不同DNA濃度對SLiCE反應的影響

圖1 菌落PCR驗證SLiCE克隆結果

2.2 退火程序對SLiCE反應的影響

在線性化載體為50 ng，插入DNA與線性化載體摩爾比為10∶1的條件下，SLiCE優化實驗中設置了不同的退火方式，結果如表3所示。

表3 退火方式對SLiCE無縫克隆的影響

相對于對照，先進行SLiCE反應，后退火處理，轉化子數目提高了2倍，重組效率也達到了100%。而先退火處理，再進行SLiCE反應，僅產生3個轉化子，且經過菌落PCR驗證沒有發現克隆子，表明先進行SLiCE反應，后退火處理的方式能夠提高SLiCE的克隆效率。

線性化載體片段制備有兩種方式，除了上述酶切方式制備線性化載體片段外，通過PCR方式制備線性化載體片段具有不依賴限制性內切酶位點的特點也廣泛采用。我們對50 ng的PCR線性化載體，插入DNA與線性化載體摩爾比為10∶1，采用先進行SLiCE反應，后退火處理的方式進行了反應，結果發現，轉化子數目為52，挑取克隆子進行PCR驗證，重組成功率為100%。相比酶切方式制備線性化載體片段，獲得克隆子數目更多。因此，PCR法制備線性化載體不僅適用于優化后的SLiCE方案，且能夠提升SLiCE的克隆效率。

2.3 電轉化對于SLiCE反應的影響

先對SLiCE反應產物進行純化，再采用電轉化法轉化至效率為3.26×109CFU/μg的電轉化感受態細胞，獲得761個的轉化子，但對挑取的20個單菌落進行PCR驗證后僅有一個為克隆子（圖2）。結果表明電轉化法雖然可以提高轉化DNA片段轉化到胞內的能力，但不管是酶切方式還是PCR方式獲得線性化載體的方法都會殘留一些完整的質粒，這些也帶有氨芐抗性的質粒也會高效轉化到菌體中形成轉化子，產生假陽性，這樣就加大了后續的篩選的工作量。在轉化前加入DpnⅠ酶有可能減少假陽性，但會增加額外成本和步驟，對于SLiCE無縫克隆的經濟性有一定影響，因此也不建議電轉化方式用于SLiCE無縫克隆。

圖2 菌落PCR驗證電轉化方式下的SLiCE克隆結果

2.4 不同效率的感受態細胞SLiCE的影響

為克服對感受態細胞的依賴，首先測試了不同轉化效率的感受態細胞對SLiCE的影響，結果如表4所示。

當采用10 ng線性化載體，插入DNA與線性化載體摩爾比為10∶1時進行SLiCE反應，轉化到化轉效率為2×105CFU/μg的感受態細胞沒有菌落長出，轉化到化轉效率為1.32×106CFU/μg的感受態細胞時產生2個轉化子，經PCR驗證并非為克隆子。而當轉化到化轉效率為1.16×107CFU/μg的感受態細胞時，雖然只產生7個轉化子，但經菌落PCR驗證重組效率高達100%。表明在本實驗中感受態細胞效率達到1.16×107CFU/μg時，SLiCE便可成功構建出重組質粒。

表4 不同轉化效率的感受態細胞對SLiCE克隆的影響

但是采用Inoue法制備化轉效率為1.16×107CFU/μg的感受態細胞仍較為繁瑣。為此我們采取了本實驗優化的SLiCE方案：采用線性化載體濃度為50 ng，插入DNA與線性化載體摩爾比為10∶1，先進行SLiCE反應，后退火處理。再將SLiCE反應產物轉化至CaCl2法制備的化轉效率為1.7×106CFU/μg感受態細胞，也產生2個轉化子，且經過PCR驗證后均為克隆子。本實驗優化的SLiCE方案，即使用CaCl2法制備得到的感受態細胞也能實現無縫克隆。

雖然經過一系列的優化后可以在較低感受態效率的條件下實現SLiCE無縫克隆，但是產生的克隆子過少。我們推測SLiCE克隆中的一些鹽，如SLiCE buffer和退火緩沖液都含有一定濃度的鹽類，都會一起隨插入片段和線性化載體轉化，而一些鹽往往會降低感受態細胞的轉化效率。本研究檢測了退火緩沖液對感受態細胞轉化效率的影響，感受態細胞轉化pUC19質粒的效率為3.6×107CFU/μg，而在轉化中加入退火緩沖液的化轉效率降低到6×106CFU/μg，表明退火緩沖液雖然促進了線性化載體和插入DNA同源區域退火形成連接，但也有可能影響到了轉化效率。

為進一步提升轉化效率，采用硅藻土純化的方式對最終的SLiCE反應產物進行純化，再化轉到轉化效率為1.7×106CFU/μg感受態細胞中。雖然相比未經純化的處理的SLiCE反應產物多產生了一倍的轉化子，但PCR驗證轉化效率僅為50%（圖3）。

圖3 SLiCE反應產物的純化對克隆的影響

3 討論

Zhang等［7］所建立的SLiCE（Seamless ligation cloning extract）無縫克隆方法在同源臂長度為15-19 bp條件下就能很好的完成質粒構建。Motohashi［13］和 Okegawa［14，17］對這一方法進行了進一步優化，改用E.coliJM109進行細胞裂解液的制備，且采用更便宜的非離子表面活性劑來對細胞進行裂解，大大降低了每次反應的成本，使SLiCE成為最便宜的無縫克隆方法之一［14］。但是該無縫克隆技術需要轉化效率約為1×108CFU/μg的感受態細胞，購買高感受態細胞使得整個實驗成本居高不下，而自己制備高感受態細胞轉化效率往往不穩定。

降低無縫克隆對高感受態細胞的依賴性，需要繼續提高無縫克隆的克隆效率。王廣珺等［15］通過添加退火緩沖液進行退火處理，將依賴T4聚合酶外切酶活性的無縫克隆的重組效率提高了10倍之多，方法簡單且有效?？紤]現有的無縫克隆技術及其涉及的相關商品化試劑盒大多也是基于外切酶的應用，如核酸外切酶 III［21］、T4 DNA 聚合酶［22］、T5 DNA聚合酶［6］、λ核酸外切酶［23-24］、ExoVIII［25］等，它們共同的特點是將插入DNA片段和載體兩端外切，形成單鏈的同源重組臂，從而實現無縫克隆。因此，添加退火緩沖液進行退火處理，對這些基于核酸外切酶的無縫克隆技術來說都有提高克隆效率的可能。

最近Nozaki［16］的研究表明大腸桿菌體內具有3'-5'外切酶活性的酶如XthA，該酶也能促進核酸片段重組，據此我們推測E.coliJM109細胞裂解液中也可能含有核酸外切酶。因此，本研究也采用添加退火緩沖液進行退火處理的方式來優化SLiCE技術（圖4）來進一步提高SLiCE技術的克隆效率。

圖4 優化的SLiCE流程圖

在引入變性和復性的步驟之前，我們首先對線性化載體的最佳濃度進行了探索。傳統的酶連接多采用20-100 ng線性化載體進行反應。Zhang等［7］認為SLiCE反應中加入10-200 ng的線性化載體和1-10倍線性化載體摩爾濃度的插入DNA的量較為合適。我們的研究發現當參與SLiCE反應的線性化載體的量從10 ng升高到50 ng時，克隆效率提高了近4倍（表5），但是隨著濃度進一步提高，克隆子的數量并沒有明顯的提高，這可能受限于細胞裂解液中的相關外切酶的酶活。在盡可能減少線性化載體用量且保障克隆效率的原則下，本研究選用50 ng線性化載體進行實驗發現，先進行SLiCE反應，再進行退火程序的方式有利于增強SLiCE克隆效率。推測可能原因，先進行SLiCE反應，可通過外切酶作用將插入DNA片段或者載體兩端形成單鏈懸突，此時再進行退火程序，在退火緩沖液和緩慢降溫過程的共同作用下，單鏈DNA（ssDNA）中可能形成的二級結構全部打開，可更準確地使插入DNA片段和載體同源區域的堿基產生氫鍵互補配對，重組形成新的質粒，進而提高重組效率。而先退火處理，再進行SLiCE反應這種方式，退火程序使線性片段和插入DNA片段的雙鏈都打開，所生成的ssDNA在同源區域也不會形成二級結構，但此時除了線性化載體和插入DNA同源區域產生堿基互補配對外，還有線性化載體的兩條ssDNA之間、插入DNA的兩條ssDNA之間的競爭性堿基互補配對，這可能導致了重組效率的降低。

即使通過DNA片段純化，電轉化也不能滿足SLiCE克隆的要求。電轉化相對于化學轉化，往往具有更高的轉化效率，且制作感受態細胞的過程更為簡單。更高的轉化效率意味更多的DNA片段或者質粒能進入細胞，產生更多的克隆子，但以往的無縫克隆研究中發現，電轉化取得的效果并不理想［6］。有研究者認為，電轉化過程中產生大量熱量會導致DNA片段形成錯誤的二級結構［26］，也有人認為電轉化不同于化轉，只會形成少數孔洞，不像化學轉化那樣保證充足DNA片段轉化到每個細胞。我們認為，影響電轉化效率最重要的原因是沒有去除反應體系中離子，造成了最終轉化效率的下降。實驗也進一步驗證了我們的結果，當SLiCE反應后我們加入了退火緩沖液進行了退火處理，這種SLiCE反應產物直接去實施電轉化，沒有任何克隆子的產生，而純化后，產生了761個轉化子，雖然最終的重組效率僅為6.25%，但獲得克隆子的數目還是不少于化學轉化方法的。只是電轉化方法產生的假陽性克隆太多，增加了篩選壓力，因此不建議在SLiCE克隆中使用電轉化。

表5 不同的處理方法對SLiCE的影響

4 結論

本實驗對SLiCE反應所需DNA濃度進行優化后，發現當線性化載體量從10 ng升高到50 ng，插入DNA片段與載體的摩爾比為10∶1時，SLiCE的克隆效率提高了近4倍。在SLiCE反應之后加入退火緩沖液并進行退火程序，不僅能夠提高SLiCE的克隆效率，而且使得SLiCE能利用CaCl2法制備的轉化效率僅為1.7×106CFU/μg的感受態細胞完成重組轉化，克服了SLiCE對高感受態細胞的依賴性，進一步降低了SLiCE克隆的成本。