骨關節炎動物模型的概述*

唐玉玲 王 進 邱業峰 袁 征

(軍事醫學研究院實驗動物中心，北京 100071)

骨關節炎(osteoarthritis,OA)是一類包括關節軟骨、軟骨下骨、韌帶、關節囊、滑膜以及關節周圍肌肉等結構發生病變所致的關節退行性疾病[1-2]。臨床表現為關節疼痛及壓痛、關節僵硬及腫脹、關節活動摩擦、關節畸形以及肌肉萎縮等，常導致患者活動障礙甚至發生殘疾[3]。世界衛生組織統計數據顯示：到2020年OA可能成為人類第四大致殘疾病[4]。隨著全球人口老齡化和肥胖的加劇，OA的發生更為普遍，不僅嚴重影響患者個人身心健康、對全球公共衛生事業及現代社會經濟也造成了嚴重負擔[5-6]。OA動物模型的研制對研究OA發生發展中的遺傳機制、預防以及治療都有著重要意義。目前OA動物模型主要包括三類：自發性OA動物模型、誘發性OA動物模型以及轉基因OA動物模型[7]。

1 自發性OA動物模型

自發性OA動物模型指不經過人為干預，在自然條件下發生OA的動物。已有的自發性OA動物模型中，Hartley豚鼠模型[8]在18～22月齡間發生中至重度的骨關節炎；C57小鼠模型中2月齡小鼠OA發生率為25%，16月齡時達80%，但缺乏人類OA的關節軟骨纖維化的表型[9]。然而，人為喂養高脂飼料或是增加運動負荷后能增加C57小鼠的OA自發率[10-11]。其次，STR/ort小鼠也是公認的自發性OA動物模型[12-14]，其膝關節、踝關節、肘關節和顳下頜關節等均是OA的好發部位。此外，來源于B6C3F1小鼠的BCBC/Y小鼠[15]也能夠自發發生OA。這一小鼠踝關節發生典型的OA損傷表型，關節腫脹畸形，關節軟骨變薄并產生裂隙及侵蝕，關節邊緣形成骨贅，并且隨著鼠齡增長小鼠常發生癱瘓。

2 誘發性OA動物模型

誘發性OA動物模型指通過人為操作對動物骨關節及周圍組織進行手術或非手術的干預從而誘導OA發生的動物。誘發性OA動物模型在大鼠、小鼠、兔、犬、豬、綿陽、馬等多個不同物種中都有報道[16]。按造模方法不同，誘發性OA動物模型可分為經典的Hulth模型[17-18]、前交叉韌帶橫斷模型[19]、半月板切除模型[20]、關節刻痕法模型[21]、切斷臀肌法模型[22]、骨內高壓模型[23]、卵巢切除術模型[24]等手術法造模模型及關節腔內注射模型[25]、關節制動法模型[26]等非手術法造模模型。

2.1 手術法造模模型

經典的Hulth模型、前交叉韌帶橫斷模型、半月板切除模型等是對半月板、韌帶等關節內單個部位或多個部位進行手術切除從而誘導OA發生。此類模型造模成功率高，可重復性高，適用于創傷后骨關節炎的研究；但手術創傷對關節損害大，且易引發術后感染導致炎癥等。關節刻痕法模型則只是在關節股骨上刻痕，創傷較小且關節炎癥輕微，適用于早期OA的研究，但此類模型造模周期稍長。切斷臀肌法模型、骨內高壓模型、卵巢切除術模型等的共同點是手術部位選擇非關節組織、避免了關節的損傷。切斷臀肌法模型是通過肌肉損傷造模，骨內高壓模型通過結扎或切斷某些靜脈干擾關節的血液循壞進而造模，而卵巢切除術模型則是通過切除卵巢來模擬絕經后的骨關節炎。這三種模型分別適用于研究肌肉損傷、血液供應以及雌激素等因素對OA發生的影響，應用面窄，不適合廣泛的OA相關研究。

2.2 非手術法造模模型

非手術法造模模型主要包括關節腔內注射模型、關節制動法模型兩類。關節腔內注射模型是通過向關節腔內注射能夠損害關節的藥物，如木瓜蛋白酶、膠原酶、透明質酸酶、菲律賓菌素、碘醋酸鹽、碘乙酸鹽等進而誘發OA的發生。關節腔注射造模具有微創、易于操作的優點，但藥物的劑量難以掌控易造成誤差。關節制動法模型是采用固定或牽引的方式對動物的關節進行機械性制動從而造成關節損傷。這種造模方式同樣避免了手術創傷，且模型與人類缺乏運動所致OA有一定相似性；但目前缺乏完美的固定設施及材料且制動操作復雜，難以控制。此外，寒冷刺激、飲食誘導、運動性損傷等方式也可以誘發OA模型，此類模型也屬于非手術法造模模型，但模型成因較為特殊、造模耗時長且應用不廣泛[16]。

3 轉基因OA動物模型

轉基因OA動物模型指利用轉基因技術結合基因編輯技術等將外源基因插入動物基因組或對動物自身基因進行突變、敲除等改變而導致OA發生的動物。已報道的轉基因OA動物模型幾乎全是利用小鼠造模[27]。根據不同的基因改造策略及改造結果，可將轉基因OA小鼠模型分為三類：基因突變小鼠模型、全身性敲除小鼠模型以及條件性敲除小鼠模型。下面對不同轉基因OA小鼠模型逐一進行介紹。

3.1 基因突變小鼠模型

Col2a1點突變轉基因小鼠：Arita等[28]向FVB/N小鼠外源導入了突變(第519位精氨酸更替為半胱氨酸)的人類Col2a1基因從而構建了Col2a1基因點突變的轉基因小鼠。這一突變策略模擬了臨床家族性OA病人中Col2a1基因第519位精氨酸更替為半胱氨酸的這一突變[29]。Col2a1基因點突變轉基因小鼠呈現骨骼發育延遲、II型膠原纖維密度減少，軟骨發育異常等OA樣表型[28]。

3.2 全身性基因敲除小鼠模型

3.2.1Blotchy轉基因小鼠模型：早在1977年，Silberberg等[30]報道了Blotchy轉基因小鼠模型，其X染色體上“Mottled”基因位點攜帶了導致膠原蛋白和彈性蛋白交聯缺陷的基因[31-32]。他們發現Blotchy轉基因半合子雄性小鼠除了發生肺氣腫和主動脈瘤，還有典型的骨關節炎表征。1996年，Glasson等[33]利用同一小鼠模型的雜合子雌性小鼠展開研究，發現Blotchy雌鼠也呈現軟骨損傷、蛋白聚糖嚴重缺失等OA表型。

3.2.2Col2a1相關的轉基因小鼠：1992年，Metsaranta等[34]在B6D2F1小鼠中敲除Ⅱ型膠原基因的第7外顯子，小鼠出生即死亡，關節軟骨基質及膠原纖維減少，生長板結構紊亂、四肢、胸腔、顱骨等畸形。

1993年，Helminen等[35]發現Col2a1缺陷基因轉基因小鼠也具有OA特征，Vandenberg等[36]向FVB/N小鼠外源導入了一段刪除12個外顯子的人COL2A1基因，這一缺陷基因編碼一條缺失291個氨基酸的短肽鏈，它與小鼠內源性表達的全長肽鏈同時存在導致前膠原纖維無法形成穩定的結構進而被降解，從而導致Col2a1的全身刪除。Col2a1缺陷基因轉基因小鼠的表型呈現多樣化：15%的小鼠發生腭裂后死亡；存活的小鼠在1 d到3月齡間發生不同程度的軟骨基質膠原纖維變少、軟骨細胞粗面內質網擴張等軟骨發育異常現象，小鼠的質量及骨密度都減少；15月齡小鼠則發生典型的OA樣軟骨退行性病變[35]。

1995年，Li等[37]通過破壞Col2a1基因的第35外顯子構建了Col2a1基因敲除的轉基因小鼠模型。純合小鼠出生前后致死，關節軟骨細胞缺乏細胞外基質及膠原纖維，長骨缺失軟骨內骨及骨骺生長板，但顱骨及肋骨正常。利用這一模型，Lapvetelainen等[38]進一步發現雜合小鼠更易發生膝關節骨關節炎。

3.2.3Col9al敲除小鼠:1994年，Fassler等[39]構建了Col9al基因敲除小鼠。IX型膠原是由α1、α2及α3三條肽鏈組成的三聚體，研究者們通過破環α1鏈的第8外顯子得到Col9al基因敲除小鼠，小鼠發生人OA樣退行性關節疾病[39]。隨后，Kimura等[40]發現這一突變小鼠的脊椎也發生類似的退行性病變。Hu等[41]進一步發現Col9al基因敲除小鼠的膝關節及顳下頜關節也發生年齡依賴性的OA樣病變。Col9al基因敲除小鼠3月齡時開始出現表型，6月齡小鼠關節軟骨蛋白聚糖及IX型膠原降解嚴重，基質金屬蛋白酶及盤狀蛋白域受體2表達增加，此外股骨和脛骨的關節軟骨力學結構特性及滲透性也發生改變。

3.2.4Del1敲除小鼠:2000年，Saamanen等[42]報道了Del1位點插入6個拷貝的突變Col2轉基因的小鼠模型，Del1雜合小鼠發生軟骨關節退化及侵蝕、半月板退化、關節結構礦化、囊腫、軟骨下骨暴露等OA樣病變。

2016年，王振等[43]發現Del1基因敲除小鼠更易引發嚴重的OA。利用的小鼠模型是Hidai等[44]于1998年構建的Del1-LacZ敲入小鼠，其構建策略是在小鼠的Del1位點插入LacZ基因，導致Del1遭到破壞而發生敲除以及LacZ的表達。這一小鼠的骨骼密度和形態正常，耳朵和膝關節的軟骨變薄，在損傷壓力下更易導致OA的發生[43]。

3.2.5雙鏈蛋白多糖/纖調蛋白聚糖敲除小鼠:2003年，Young等[45]發現雙鏈蛋白多糖基因敲除小鼠、纖調蛋白聚糖基因敲除小鼠以及雙糖鏈蛋白多糖/纖調蛋白聚糖的雙基因敲除小鼠都會發生早發性OA，雙基因敲除小鼠的OA表型發生更早且更嚴重。

3.3 條件性基因敲除小鼠模型

3.3.1β-catenin條件性敲除小鼠：2009年，朱梅等[46]特異性敲除關節軟骨細胞β-catenin的第3外顯子的一個拷貝，導致小鼠發生人OA樣表型。研究者們將Col2a1-CreERT2轉基因小鼠[47-48]與β-cateninfx(Ex3)/fx(Ex3)基因打靶小鼠[49]交配得到Col2a1-CreERT2;β-cateninfx(Ex3)/wt小鼠，經tamoxifen誘導后β-catenin第3外顯子被敲除。小鼠5月齡時關節軟骨減少，8月齡時觀察到關節表面纖維性顫動、裂陷、軟骨骨贅形成等現象。同時，小鼠關節軟骨中Aggrecan、Mmp-9、Mmp-13、Alp、Oc、ColX等多種軟骨細胞標志物以及Bmp2的表達都顯著上升[46]。

3.3.2EFNB2條件性敲除小鼠：2016年，Valverde-Franco等[50]將Col2a1-Cre轉基因小鼠與EFNB2fx/fx基因打靶小鼠交配得到軟骨特異性EFNB2純合敲除小鼠(Col2a1-Cre;EFNB2fx/fx)，小鼠軟骨細胞EFNB2的第1外顯子被敲除。研究者們分析EFNB2敲除小鼠發現：剛出生時小鼠生長板X型膠原蛋白表達增加、肥大區紊亂、礦化減少；15日齡小鼠軟骨-骨連接處VEGF和TRAP的表達顯著下降、骨體積和骨小梁厚度減少導致第二骨化中心形成延遲；21日齡及8周齡小鼠骨密度下降；12月齡小鼠膝關節和髖關節均表現出OA的表型。

3.3.3DOT1L條件性敲除小鼠：2017年，Monteagudo等[51]發現DOT1L具有維持軟骨組織穩態及預防OA發生的作用。研究者們抑制DOT1L活性后野生小鼠發生骨關節炎，利用軟骨細胞表達的Col2a1-Cre敲除DOT1L第2外顯子后，小鼠關節軟骨X型膠原和MMP13表達增加，關節軟骨穩態受到影響。同時，小鼠還出現骨骼生長停滯，生長板前肥大區發生紊亂等表型。

3.3.4Pten條件性敲除小鼠：2019年，謝婧等[52]發現關節軟骨中持續激活Akt信號導致小鼠發生骨關節炎。研究中同時使用組成型Col2a1-Cre轉基因小鼠及誘導型Col2a1-CreERT2轉基因小鼠分別與第4、5外顯子被錨定的Ptenfl/fl小鼠交配得到軟骨細胞特異性Pten敲除小鼠。Col2a1-Cre；Ptenfl/fl小鼠5月齡時蛋白聚糖減少，關節軟骨厚度減少、關節軟骨結構破損；8月齡時關節表面變粗糙并發生侵蝕；10月齡時小鼠軟骨嚴重缺損；隨著鼠齡增加，關節軟骨缺損嚴重，軟骨下骨和滑膜皆發生病變并形成骨贅。為排除Col2a1-Cre；Ptenfl/fl小鼠中生長板缺損造成的影響，研究者們進一步在Col2a1-CreERT2；Ptenfl/fl小鼠中進行分析，發現誘導性Ptenfl/fl敲除小鼠8月齡也出現了明顯的OA的表型。

目前轉基因OA動物模型多為全身性的突變或敲除小鼠，條件性基因敲除小鼠模型仍然缺乏。全身性的突變或敲除的OA小鼠模型除了有部分類似OA的病理表型外，多數還同時發生其他器官或組織的缺陷，這對研究OA的治病機制或是治療方法等具有一定的影響。條件性基因敲除小鼠模型在軟骨細胞中特異性敲除特定基因進而研究其功能，這對探索OA發生發展的過程及機制有很好的促進作用，但目前這類模型的數量有限，OA的致病機理及治療機制等相關研究仍有很大的空白，研制新的條件性轉基因OA小鼠模型具有重要意義。

4 小結

人類OA的發病原因復雜，與年齡、肥胖、炎癥、創傷及遺傳因素等都有重要聯系[53-54]。OA動物模型的應用及研究對探究人類OA的致病機理、預防及治療等具有不可替代的作用。任何動物模型的研制都需要符合相似性、重復性、可靠性、適用性和可控性、易行性和經濟性、符合動物實驗倫理和3Rs理論等多項原則。理想的OA模型最重要的標準是能夠最大程度模擬人類OA的發生發展過程，即組織病理、細胞狀態、相關信號通路及分子標志物等多方面的變化都與人類OA相一致。此外，還需要符合周期短、費用低、操作便利、表型穩定可重復、動物福利倫理等多種要求。然而，目前大部分OA動物模型只能模擬臨床OA的部分癥狀，不同的OA動物模型都有自己獨特的優勢，也存在局限性。自發性OA動物模型避免了人為損傷，但造模周期長、費用高。誘發性OA動物模型中，手術法會對動物造成創傷，穩定性難以維持；非手術法藥物種類及劑量、操作方式及時間都難以控制；多數誘發性OA動物模型適用領域都比較窄[55]。相對自發性誘發性造模來說，轉基因造模不僅能夠避免手術創傷，減輕模型動物的痛苦，還能彌補其他方法造模的不穩定性，具有其他造模方法無法比擬的特點和優勢。目前多種轉基因OA模型被成功研制并在OA的致病機理、藥物篩選、預防及治療等相關研究發揮作用，也是未來OA模型研制的主要方向。

除了運用單一的造模方法，很多OA的相關研究中結合使用了多種造模方法，如多部位手術誘發造模[56]、轉基因模型結合誘發性干預[43]、多基因敲除造模等[45]。鑒于目前的OA動物模型無法模擬人類OA的所有特征，研究者需要根據自己的研究領域及研究目的選擇合適的造模策略，轉基因OA模型因其獨特的優越性而具備很重要的發展潛力。此外，為最大程度模擬人類臨床OA病理特征，OA動物模型的研制必然走向以轉基因造模為主、同時結合其他造模方法綜合運用的趨勢。