hACE2轉基因小鼠模型*

趙 亞 師長宏

(空軍軍醫大學實驗動物中心，西安 710032)

2020年一月底，一場不明原因的肺炎疫情席卷全世界，2月28日已經被世界衛生組宣布為全球風險非常高級別。目前，已造成全球4 000多萬人感染，100多萬人死亡，此數據仍在不斷增長，嚴重危害到人類的健康和社會穩定。大量研究表明，此次肺炎為病毒性肺炎，是由新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SRAS-CoV-2)感染所致。相關研究表明，血管緊張素轉換酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)是新型冠狀病毒及SARS冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SRAS-CoV)的受體[1-3]，與SRAS-CoV-2親和力高于SRAS-CoV[4]， 是本次新型冠狀病毒的藥物治療及疫苗研發靶點。

ACE2是一種鋅金屬蛋白酶，結構包括一個信號肽、一個金屬蛋白酶活性位點和一個跨膜區，可降解血管緊張素Ⅰ(angiotensin Ⅰ，Ang Ⅰ)生成九肽(angiotensin 1-9， Ang1-9)，降解血管緊張素(angiotensin，angi)生成七肽(angiotensin 1-7，Ang1-7)[5-6]。ACE2位于X染色體上，是血管緊張素轉換酶(renin-angiotensin system，RAS)中的一員，在肺、消化道及大腦等組織器官中廣泛表達[7]。ACE2在肺組織中主要分布于Ⅱ型肺泡細胞(type Ⅱ alveolar cells，AT2 cells)，也有少量分布于Ⅰ型肺泡細胞(AT1 cells)及氣道上皮細胞、成纖維細胞、內皮細胞和巨噬細胞等[8-9]，冠狀病毒進入并在這些靶細胞中復制，然后，成熟的病毒粒子從感染細胞中釋放出來，再去感染新的靶細胞[10]。

我國學者最新研究發現了ACE2識別新型冠狀病毒的結構基礎，西湖大學周強教授課題組在《bioRxiv》連發兩篇文章清楚解析了新型冠狀病毒如何侵襲人體宿主細胞，相關結果為后期研究人員改進并開發新型治療藥物提供了非常重要的線索和信息[11-12]。《Science》發表了美國國立衛生研究院(NIH)和德州大學奧斯汀分校(UT Austin)的合作研究成果，通過冷凍電鏡技術解析了新冠病毒S蛋白三聚體結構，發現新冠病毒S蛋白與受體ACE2結合能力為SARS病毒的10～20倍[4]，揭示了新冠病毒傳播能力如此強悍的原因。

近期《Cell》發表了來自德國研究者的結果也證實，新冠病毒利用ACE2進入細胞，利用絲氨酸蛋白酶TMPRSS2激活S蛋白，TMPRSS2抑制劑可阻止病毒進入細胞，且來自恢復期SARS患者的血清可中和SRAS-CoV-2 S蛋白驅動的病毒進入細胞，揭示SRAS-CoV-2和SARS病毒感染之間的重要共性[13]，為疫情提供新的治療思路。

病毒相關藥物和疫苗研究均需要在特異性動物模型上進行實驗后，才能進入臨床實驗階段。小鼠是目前各類疾病研究中應用最廣泛的動物模型，也是本次研究的首選。hACE2轉基因小鼠作為SARS-CoV易感動物模型，與野生型小鼠相比，經鼻腔接種PUMC01株SARS-CoV后，動物出現典型的間質性肺炎，并伴有腦組織、肝臟、腎臟和胃腸道等肺外組織的損傷，在研究SARS發病機制和抗病毒藥物的評價具有重要作用。國內外均有成功報道的hACE2轉基因小鼠模型，但這幾種轉基因小鼠由于應用技術、整合方式及小鼠品系等方面的差異，造成遺傳背景及表型不同。本文將對現有的各種hACE2轉基因小鼠從品系、構建方式及應用領域等方面進行系統的介紹，利于研究者選擇使用。

1 C57BL/6 J × SJL/J背景K18-hACE2轉基因小鼠

2007年，愛荷華大學的McCray等[14]成功構建K18-hACE2轉基因小鼠，由人類細胞角蛋白18(cytokeratin 18，K18)啟動子調控的hACE2轉基因小鼠。將攜帶有人ACE2編碼基因的載體引入到野生型(c57BL/6 J 與SJL/J雜交品系的F2)小鼠中構建。ACE2的表達由人細胞角蛋白18(K18)啟動子調控在上皮細胞中表達，K18啟動子可在氣道上皮細胞(但不在肺泡上皮細胞)以及其他內臟(包括肝、腎和胃腸道)的上皮細胞中高效表達外源轉基因[15]。

McCray等研究發現，在最初感染的氣道上皮細胞中便觀察到hACE2表達。該K18-hACE2轉基因小鼠鼻內接種人源SARS-CoV毒株后會迅速感染并死亡，但野生型小鼠感染SARS-CoV病毒后，其肺泡中并未檢測到病毒抗原。該研究中，病毒感染開始于氣道上皮，隨后擴散到肺泡，最終蔓延至大腦。感染導致肺部巨噬細胞和淋巴細胞浸潤，并引起肺部和腦部的促炎細胞因子和趨化因子上調。感染3～5 d后，K18-hACE2小鼠出現體質量減輕，并伴有呼吸困難和精神萎靡，7 d內全部死亡。雖然，SARS-CoV可以感染K18-hACE2轉基因小鼠的氣道和肺泡，引起的肺部病理變化卻有限，且最后受感染的K18-hACE2轉基因小鼠死亡的主要原因是中樞神經系統感染后導致神經元死亡[14-16]，而新冠病毒感染患者死亡主要原因是感染后的肺臟炎癥[17]。

2 C3H × C57BL/6 背景HFH4-hACE2轉基因小鼠

美國病毒學家北卡羅納大學的Sheahan等[18]構建的(C3H×C57BL/6)F1 背景hACE2轉基因小鼠，命名為HFH4-hACE2轉基因小鼠。該小鼠使用肺纖毛上皮細胞啟動子HFH4啟動人源ACE2基因在小鼠肺中的轉基因小鼠表達，該HFH4-hACE2轉基因小鼠肺中雖觀察到人ACE2的有效表達，但沒有表現出預期的肺部特異表達，在腦、肝、腎和胃腸道中也檢測到不同程度的人ACE2表達。同時，在HFH4-hACE2轉基因雜合子小鼠中偶爾檢測不到人類ACE2基因的表達。在HFH4-hACE2轉基因小鼠10～20周齡時，感染SARS-CoV Urbani株并觀察7 d后發現，感染小鼠體質量平均下降了20%以上，并且病毒在肺和腦保持了強勁復制，研究者預測hACE2轉基因小鼠死亡的主要原因為致命性腦炎。

3 C57BL/6 J×C3H/HeJ背景的hACE2轉基因小鼠

美國德克薩斯大學加爾維斯敦社區學院構建了5個轉基因譜系的(C57BL/6 J×C3H/HeJ)F1背景的hACE2轉基因小鼠，分別命名為AC-12、AC-22、AC-50、AC-63和AC-70，主要應用其中的AC-22、AC-63及AC-70轉基因譜系進行相關實驗。該hACE2轉基因小鼠使用外源性的復合啟動子CAG(帶有CMV-IE增強子的雞β-肌動蛋白啟動子)啟動人ACE2基因表達[19]。該團隊研究顯示，此類hACE2轉基因小鼠在肺、腦、心及肌肉等組織中均有hACE2mRNA表達，對SARS-CoV感染高度易感，可導致不同嚴重程度的疾病發生，部分家系甚至死亡；在5個轉基因譜系中，AC-70轉基因譜系小鼠病毒感染能力最強，免疫抵制最劇烈，但在研究中未發現彌散性肺泡損傷，Yoshikawa等[20]推測該譜系轉基小鼠最終死亡可能是因感染導致的致命性腦炎。

4 ICR背景hACE2轉基因小鼠

中國醫學科學院醫學實驗動物研究所秦川教授團隊制作的hACE2轉基因小鼠為ICR背景hACE2轉基因小鼠。該團隊考慮到外源性hACE2導入可能會造成小鼠心血管系統功能失常，采用內源性啟動子，使導入的hACE2基因更接近于自然表達，導入的hACE2基因為單拷貝，臨床觀察該轉基因小鼠無心血管系統副作用，ICR背景的hACE2轉基因小鼠SARS-CoV易感性明顯高于野生型小鼠。研究表明，經鼻腔接種PUMC01株SARS-CoV后，該轉基因小鼠在接種后第3天及第7天的肺組織上清的病毒載量和病毒滴度均顯著高于野生型小鼠，出現典型的間質性肺炎，并伴有腎臟、心臟、肝臟、腦組織和胃腸道等肺外組織的損傷；在感染1周內，該轉基因小鼠雖活動減少、嗜睡，未出現死亡，推測這可能是由于感染的病毒滴度較低或者轉基因的表達較低[21-24]。

在疫情發生期間，科技部啟動了新型冠狀病毒科技攻關的第1批應急項目，中國醫學科學院實驗動物研究所主持動物模型構建課題，同時與中國疾控中心病毒病預防控制所等院內外單位密切合作，根據前期的工作基礎和經驗，結合生物信息學分析，從病原易感動物資源庫中篩選了潛在的易感動物，分別是SARS入侵人細胞的受體—hACE2轉基因小鼠，以及曾成功用于SARS動物模型研制的恒河猴。并率先建立了轉基因小鼠模型和恒河猴新冠肺炎(SRAS-CoV-2)的疾病模型，豐富了對COVID-19病因學和病理學的認識，為進一步研究感染與發病機制、傳播途徑、藥物和疫苗評價等提供了不可缺少的關鍵支撐。上述hACE2轉基因小鼠模型已經應用于致病機制和傳播途徑研究、應急藥物篩選和疫苗評價，在科技部和中國醫學科學院的安排下，完成了5種成藥的評價，正在進行6種疫苗和4種成藥的動物實驗評價。值得一提的是， SARS和MERS疫情期間，該研究所均率先建立了動物模型，應用于致病機制研究、疫苗研發和藥物篩選[25-26]。

5 KM背景hACE2轉基因小鼠

中國人民解放軍軍事科學院在KM小鼠上采用同源重組的方式進行轉基因小鼠制備，利用PCAGGS表達載體，采用外源性啟動子。該啟動子為包含CMV增強子和雞的β-actin啟動子組成的CAG雜合啟動子，載體還包括雞β-actin的外顯子及兔β球蛋白的部分外顯子3，雞β-actin的部分內含子1和兔β球蛋白的部分內含子2，以及兔β球蛋白的轉錄終止子。其中，在雞的β-actin外顯子3中存在轉錄拼接位點，在雞的β-actin內含子中存在轉錄增強子序列，有利于增強下游基因的表達；該團隊在目的基因hACE2的起始密碼子前加入了CCACC的Kozak序列，有文獻表明在該啟動子前加入該序列能夠增強目的基因表達[27]。該團隊通過Western blot 及組織免疫熒光檢測了轉基因小鼠肺組織中的hACE2蛋白表達和分布，并通過體外蛋白結合實驗證明小鼠肺組織中穩定表達的hACE2蛋白能很好的與SARS病毒的S蛋白結合[28]。該轉基因小鼠也存在感染后小鼠腦組織中病毒含量過高，最終導致小鼠因病毒在腦中廣泛傳播繼而因出現致命性腦炎死亡[29]。

6 展望

早期在CRISPR/Cas9技術還未成熟時，轉基因小鼠的構建主要通過受精卵DNA顯微注射技術制作，因重組效率及啟動子的不同，其表達效果間存在差異，使得這些轉基因小鼠不能完全模擬生理狀況下的ACE2表達水平。在感染SARS-CoV后外源性與內源性的啟動子啟動的hACE2轉基因小鼠模型均出現氣道上皮感染癥狀，但這些轉基因小鼠腦內都有高水平的hACE2表達，相應的在感染后小鼠腦組織中病毒含量過高，最終可能導致小鼠因病毒在腦中廣泛傳播繼而出現致命性腦炎[16, 18, 20, 23]。無論現已報道的SARS-CoV hACE2轉基因小鼠模型在研究發病機制和治療干預方面多有效，但其小鼠適應性的改變人類冠狀病毒易感性及致病機制這些缺點依然存在[30]。

國家衛生健康委員會3月3日最新修訂的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》中對病理改變進行了總結，新型冠狀病毒肺炎導致的病理改變以肺臟及免疫系統損傷為主，其他臟器因基礎病不同而不同，多為繼發性損害；肺臟呈不同程度的實變，各類上皮細胞發生病理性變化，支氣管黏膜上皮和Ⅱ型肺泡上皮細胞胞質內可見冠狀病毒顆粒，部分肺泡上皮和巨噬細胞呈新型冠狀病毒抗原陽性、核酸陽性；其他器官的病理改變，包括腦組織充血、水腫及部分神經元變性，腎上腺見灶性壞死，食管、胃和腸管黏膜上皮不同程度變性、壞死、脫落[31]。相應的動物模型感染新冠病毒后其病理學變化應盡可能接近人的臨床特征。但目前所有的SARS-CoV-2感染的動物模型均只能重現人類疾病的部分方面，也不能完全模擬病毒攻擊時人體生理狀況下的反應。因此，應積極開發不同類型的SARS-CoV-2感染動物模型，加速研究SARS-CoV-2發病機理，加快開發COVID-19對應策略。

因此，各國研究者均積極的開發新的SARS-CoV-2感染小鼠模型。CRISPR/Cas9技術是理想的轉基因小鼠模型構建手段，能夠將hACE2序列定點插入小鼠內源ACE2基因ATG位置，使人源ACE2能夠在內源ACE2調控信號的調控下進行表達，其表達將更貼近于小鼠生理狀態下的表達情況，可以更好地為藥物治療及疫苗研發提供夯實的動物基礎。已有研究者利用CRISPR/Cas9介導的基因工程技術在小鼠上實現人ACE2替換鼠ACE2。

耶魯大學醫學院的Iwasaki教授課題組開發了一種新的SARS-CoV-2感染小鼠模型，首先使用攜帶hACE2基因的無害病毒感染小鼠，感染后小鼠產生人ACE2蛋白，進而該小鼠感染SARS-CoV-2發現，SARS-CoV-2可以在這些小鼠中復制并誘導類似于在COVID-19患者中觀察到的炎癥反應，在該模型中，多種免疫細胞被激活并募集到肺中[32]。

各類hACE2轉基因小鼠對新型冠狀病毒機理研究、藥物治療及疫苗研發均有至關重要的作用，通過hACE2轉基因小鼠進行不同藥物的篩選，不僅可以提高臨床前藥物驗證的有效性，也提高可以臨床實驗的成功率。目前，我國多家企業及單位已經著手開發利用CRISPR/Cas9技術開發新的hACE2轉基因小鼠模型，相信不久之后就會有大量不同敲入位點及修飾方法的hACE2轉基因小鼠模型用于后續的藥物研發及疫苗制備工作中。研究者可根據自身需求選用不同種類的hACE2轉基因小鼠進行相關實驗。