南美蟛蜞菊WtActin1基因克隆及表達穩定性分析

李紅春　肖雨沙　王小蘭　宋莉英

摘要：【目的】克隆南美蟛蜞菊肌動蛋白基因（WtActin1），并進行生物信息學及表達穩定性分析，為南美蟛蜞菊耐熱耐冷功能基因表達及調控研究提供可靠的內參基因。【方法】RACE克隆WtActin1基因，通過在線生物信息學分析軟件對其氨基酸序列進行分析，并利用實時熒光定量PCR檢測該基因在不同組織及溫度脅迫下的表達情況。【結果】克隆獲得的WtActin1基因cDNA全長1682 bp（GenBank登錄號MN485900），其中5'非編碼區（5'-UTR）170 bp，3'非編碼區（3'-UTR）378 bp，開放閱讀框（ORF）1134 bp，編碼377個氨基酸殘基。WtActin1蛋白分子量為41725.81 Da，理論等電點（pI）為5.31，不穩定性指數（II）為37.48，親水性的平均值（GRAVY）為-0.166，為穩定的親水性蛋白，無跨膜結構域和無信號肽，主要存在于細胞質中，具有Actin蛋白家族的典型特征結構，其二級結構主要由α-螺旋、β-轉角、延伸鏈和無規則卷曲組成，三級結構同源模型為嵌合肌動（3ci5.1.A），與萵苣、橡膠草和洋薊的同源蛋白三級結構高度相似。WtActin1基因與其他植物Actin基因核苷酸序列相似性在86.4%以上，其推導氨基酸序列相似性在94.0%以上。從基于Actin氨基酸序列相似性構建的系統發育進化樹可看出，WtActin1與同為菊科的萵苣LsActin7親緣關系最近，與傳統分類學相吻合，其次是菊科的橡膠草TkActin1和錦葵科的棉花GhActin。WtActin1基因在南美蟛蜞菊根、莖、葉和花中的表達量均無顯著差異（P>0.05，下同），且在高、低溫脅迫下與正常溫度處理的表達量也均無顯著差異。【結論】WtAtin1基因屬于Actin基因家族成員，在不同組織及溫度脅迫下均能穩定表達，可作為內參基因用于南美蟛蜞菊耐熱耐冷功能基因研究。

關鍵詞： 南美蟛蜞菊;肌動蛋白基因（Actin）;內參基因;基因克隆;表達穩定性;溫度脅迫

中圖分類號： S451 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）11-2626-10

Cloning and expression stability analysis of WtActin1

gene from Wedelia trilobata

LI Hong-chun， XIAO Yu-sha， WANG Xiao-lan， SONG Li-ying*

（College of Life Sciences， Guangzhou University， Guangzhou ?510006， China）

Abstract：【Objective】In this study，actin gene WtActin1 was cloned from Wedelia trilobata and its bioinformatics and expression stability were analyzed to provide an appropriate reference gene for the expression and regulation of functional genes with cold and heat resistance in W. trilobata. 【Method】The WtActin gene from W. trilobata was cloned by RACE，its amino acid sequence was analyzed by bioinformatics software，and the expression of WtActin gene in different tissues and under temperature stress was detected by real-time quantitative PCR. 【Result】The full-length cDNA of WtActin1 gene was 1682 bp（GenBank accession number：MN485900），contained a 1134 bp open reading frame encoding（ORF） 377 amino acids residues，with 170 bp in the 5' non-coding region（5'-UTR） and 378 bp in the 3'-UTR. WtActin1 protein had a molecular weight of 41725.81 Da and a theoretical isoelectric point（pI） of 5.31，instability index（II） of 37.48，average hydrophilicity（GRAVY） of -0.166. It was a stable hydrophilic protein without transmembrane domain and signal peptide. It mainly existed in cytoplasm，and had typical characteristic structure of Actin gene family. Its secondary structure was mainly composed of α-helix，β-turn，extended chain and irregular coil，the three-level structure homology model was chimeric myokinesis（3ci5.1.A），which was highly similar to that of Lactuca sativa，Taraxacum kok-saghyz and Cynara cardunculus var. scolymus. Homology comparison with other plant Actin nucleotide ?sequences showed that it shared over 86.4% nucleotide sequence identity and 94.0% amino acid sequence identity with Actin in other plants. Based on phylogenetic tree of Actin amino acid sequence similaruty， WtActin1 was closely related to L.sativa（LsActin7） of Asteraceae，which was consistent with traditional taxonomy，followed by T. kok-saghyz（TkActin1） of Asteraceae and Gossypium hirsutum（GhActin） of Malvaceae. The expression level of WtActin1 gene was stable in root， stem， leaf and flower of W. trilobata and there was no significant difference among them（P>0.05， the same below），and there was no significant difference between high or low temperature stress and normal temperature. 【Conclusion】The WtActin1 gene cloned in this study is a member of Actin gene family and could be stably expressed in different tissues and under temperature stress. It can be used as an internal reference gene for the study of heat and cold tolerance genes of W. trilobata.

Key words： Wedelia trilobata; actin gene（Actin）; internal reference gene; gene cloning; expression analysis; temperature stress

Foundation item： Guangdong Natural Science Foundation（2018A030313478）; Guangzhou Science and Techno-logy Plan Project（201707010257）

0 引言

【研究意義】南美蟛蜞菊（Wedelia trilobata）又稱三裂葉蟛蜞菊、穿地龍或地錦花，為菊科（Asteraceae）澤菊屬（Wedelia）的多年生草本植物，原產于南美洲及中美洲地區，現廣泛分布于東南亞和太平洋許多國家和地區，被世界自然保護聯盟（IUCN）列為世界最有害的100種外來入侵種之一（International Union for Conservation of Nature，2001;吳彥瓊等，2005）。據研究報道，南美蟛蜞菊對高溫、高光等逆境具有較強的適應性（宋莉英等，2009，2017），可能蘊藏著豐富的抗逆基因。開展南美蟛蜞菊抗逆基因克隆和抗逆基因表達模式研究有利于從分子水平上揭示其生物學功能及入侵機理，而研究其抗逆基因表達模式通常需要一個穩定表達的內參基因進行標定。已有研究證實，多數植物肌動蛋白基因（Actin）具有高度的保守性（劉曦等，2010），因此，克隆獲得南美蟛蜞菊Actin基因，評估其作為內參基因的可靠性，對開展南美蟛蜞菊重要功能基因挖掘及表達調控研究具有重要意義。【前人研究進展】近年來，南美蟛蜞菊的研究主要集中在繁殖特性（楊東娟和朱慧，2008;Si et al.，2014）、化感作用（Qiang et al.，2011;柯展鴻等，2014）及環境因子脅迫響應（Qi et al.，2014 ;牛雨欣等，2019）等方面，而關于南美蟛蜞菊內參基因的相關研究鮮見報道。目前，植物中較常見的內參基因包括Actin基因、18S rRNA、28S rRNA、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）基因和肽鏈延伸因子（ef1-α）基因等（Zhang et al.，2017）。根據植物材料、組織和處理條件的不同，所選的內參基因有所不同。由于Actin基因在植物不同組織器官內表達水平高且相對穩定，故被廣泛地用作植物功能基因表達分析的內參基因（陳穎等，2003）。至今，已成功從木薯（Manihot esculenta Crantz）（許娟和羅興錄，2011）、厚藤（Ipomoea pescaprae）（郭艷等，2016）、山藥（Dioscorea oppositifolia）（龔明霞等，2016）、番杏（Tetragonia tetragonioides）（葉玉妍等，2018）等多種植物中克隆獲得Actin基因，且研究證實不同植物Actin基因編碼的氨基酸具有高度保守性（劉曦等，2010）。燕麥（Avena sativa）Actin蛋白與其他植物Actin蛋白的氨基酸序列相似性在93%以上（琚澤亮等，2016）;馬纓杜鵑（Rhododendron delavayi）Actin蛋白與其他植物Actin蛋白的氨基酸序列相似性在97%以上（孫威等，2018）。【本研究切入點】Actin是許多植物功能基因表達檢測的理想內參基因，但至今鮮見有關南美蟛蜞菊Actin基因克隆及表達分析的研究報道。【擬解決的關鍵問題】利用RACE克隆南美蟛蜞菊Actin基因（WtActin1），對其進行生物信息學分析，并利用實時熒光定量PCR檢測其在不同組織及溫度脅迫下的表達穩定性，為南美蟛蜞菊耐熱耐冷功能基因表達及調控研究提供可靠內參基因。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

南美蟛蜞菊采自廣州大學校園。總RNA提取試劑盒（MiniBEST Plant RNA Extraction Kit）、反轉錄試劑盒（PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser和PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit）、質粒提取試劑盒（MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0）、TB Green? Premix Ex TaqTM II熒光定量PCR試劑盒、克隆載體pMD19-T、TDT酶、PrimeSTAR Max高保真DNA聚合酶及DNA凝膠回收試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）。大腸桿菌DH5α感受態細胞為廣州大學生命科學學院實驗室制備保存。主要儀器設備：人工氣候箱（RXZ-500E-LED智能型，寧波江南儀器廠）、PCR儀（Bio-Rad，美國）、電泳儀（北京君意東方電泳設備有限公司）、分光光度計（Biotek，美國）、凝膠成像分析系統（上海比朗儀器制造有限公司）、實時熒光定量PCR儀（ABI 7000，美國）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 樣品采集及脅迫處理 對自然生長的南美蟛蜞菊帶芽莖段進行扦插繁殖，采集成熟期植株的根、莖、葉和花等4種組織。此外，選取生長健康、長勢一致的植株分別進行低溫（4 ℃）和高溫（42 ℃）脅迫處理，并于脅迫0、1、3、6、12和24 h時采集其葉片，以正常溫度下生長的植株為對照。以上樣品均設3次重復，采集后立即用液氮處理，于-80 ℃冰箱保存備用。

1. 2. 2 總RNA提取 采用植物總RNA提取試劑盒提取南美蟛蜞菊總RNA。使用核酸蛋白分析儀測定總RNA濃度和純度，并利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其提取質量和降解情況，將符合要求的總RNA保存于-80 ℃冰箱備用。

1. 2. 3 引物設計及合成 根據前期南美蟛蜞菊轉錄組數據，篩選出Actin基因的部分序列，設計中間片段引物（WAIF/WAIR）進行擴增，并進行序列比對，以確定目的基因的中間片段。根據基因中間片段序列，設計3條5'-RACE特異性引物和2條3'-RACE特異性引物（表1）用于基因克隆和實時熒光定量PCR檢測。引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2. 4 WtActin1蛋白亞細胞定位和磷酸化位點預測結果

TargetP 1.1 Server預測結果顯示，WtActin1蛋白主要分布于細胞質中，與PSORT Ⅱ預測結果一致，推測其定位于細胞質中。磷酸化位點預測結果顯示，WtActin1蛋白共有35個磷酸化位點，包括17個絲氨酸激酶磷酸化位點、10個蘇氨酸激酶磷酸化位點和8個酪氨酸激酶酸磷酸化位點（圖4），磷酸化位點主要以絲氨酸的形式存在，故推測WtActin1蛋白是以絲氨酸為主、蘇氨酸為輔的磷酸化修飾參與信號轉導調控。

2. 5 WtActin1蛋白結構預測結果

WtActin1蛋白含有多個Actin保守區域，且含有Actin家族典型的結構域NBD_sugar-kinase_HSP70_ actin（圖5），說明其為Actin蛋白家族成員。WtActin1蛋白二級結構主要由α-螺旋、β-轉角、延伸鏈和無規則卷曲組成，分別占36.07%、22.55%、6.90%和34.48%（圖6）。WtActin1蛋白二級結構預測結果與其三級結構預測結果相互印證。該蛋白三級結構同源模型（圖7）為嵌合肌動（3ci5.1.A），氨基酸序列相似性達90.9%，且與萵苣（Lactuca sativa）、橡膠草（Taraxacum kok-saghyz）和洋薊（Cynara cardunculus）的同源蛋白三級結構高度相似。

2. 6 WtActin1基因序列同源性分析及系統發育進化樹

將WtActin1基因核苷酸序列及其推導氨基酸序列在NCBI上進行同源比對分析，結果顯示，WtActin1基因核苷酸序列與萵苣LsActin7基因相似性最高，為92.8%;其次是甜葉菊（Stevia rebaudiana）SrActin基因和向日葵（Helianthus annuus）HaActin基因，均達91.0%;與其他植物Actin基因核苷酸序列的相似性也在86.4%以上。WtActin1蛋白與萵苣Actin蛋白的氨基酸序列相似性最高，達100.0%;其次是洋薊和薇甘菊（Mikania micrantha），分別為99.7%和99.4%;與其他植物Actin氨基酸序列的相似性也在94.0%以上。氨基酸序列多重比對分析結果顯示，9種植物的Actin均有366個氨基酸位于保守區域，非保守氨基酸僅有11個（圖8），說明植物Actin在進化過程中十分保守。

基于Actin氨基酸序列相似性構建的系統發育進化樹（圖9）顯示，WtActin1與同為菊科的萵苣LsActin7親緣關系最近，與傳統分類學相吻合，其次是菊科的橡膠草TkActin1和錦葵科的棉花（Gossy-pium hirsutum）GhActin，親緣關系最遠的是茄科的番茄（Solanum lycopersicum）SlActin7和豆科的木豆（Cajanus cajan）CcActin7。

2. 7 WtActin1基因表達分析結果

從實時熒光定量PCR熔解曲線（圖10-A～圖10-C）可看出，WtActin1基因在正常溫度、低溫和高溫處理下，實時熒光定量PCR熔解曲線均為單一的信號峰，無引物二聚體和非特異性擴增，表明引物設計特異性強。制作的標準曲線回歸系數（R2）為0.99557（圖10-D），表明稀釋倍數與Ct值呈良好的線性關系，擴增效率為94.04%，說明引物設計合理，符合實時熒光定量PCR的要求，試驗結果可靠。

實時熒光定量PCR檢測結果（圖11-A）顯示，WtActin1基因在根、莖、葉和花中均有表達，且表達量均無顯著差異（P>0.05，下同），說明該基因表達不具有組織特異性。在高溫和低溫脅迫處理下，WtActin1基因在葉片中的表達量略有波動，但均無顯著差異（圖11-B），表明WtActin1基因的表達受溫度影響較小，可用作溫度應答功能基因研究的內參基因。

3 討論

Actin是真核細胞中普遍存在的一種古老蛋白，是細胞骨架微絲的主要成分，參與真核細胞內許多重要的生理化學活動，如細胞分裂、運動、遷移、形態維持、信號傳導和物質運輸等（Wen et al.，2014）。本研究從南美蟛蜞菊中克隆得到1個Actin家族基因（WtActin1），其cDNA全長為1682 bp，包含1個1134 bp的ORF，編碼377個氨基酸殘基，與GenBank已公布的其他植物Actin基因核苷酸序列相似性均在86.4%以上，推導氨基酸序列相似性均在94.0%以上，表明植物Actin基因無論核苷酸序列還是其推導氨基酸序列均具有高度的保守性（陳鵬飛等，2009;王舟等，2010）。此外，WtActin1蛋白含有Actin家族典型的結構域，且與萵苣、橡膠樹和洋薊Actin蛋白三級結構高度相似，進一步證明本研究克隆獲得的WtActin1基因是Actin基因家族成員。從基于Actin氨基酸序列相似性構建的系統發育進化樹也可看出，WtActin1與同為菊科的萵苣LsActin7親緣關系最近，與傳統分類學相吻合，其次是菊科的橡膠草TkActin1和錦葵科的棉花GhActin，故推測這些蛋白生物學功能相似。

南美蟛蜞菊作為一種外來入侵植物，短期內在我國華南地區泛濫成災，可能蘊含著豐富的抗逆基因，在研究其抗逆基因的表達模式及調控機制時，選擇合適的內參基因是實時熒光定量PCR檢測數據準確性的必要條件。Actin基因同源性和保守性均較高，在高等植物中常被作為標準基因研究未知基因（Mccurdy et al.，2001）。雖然植物Actin基因在核苷酸序列上高度保守，但在不同組織中的表達存在一定差異。擬南芥（Arabidopsis thaliana）AtACT1基因在成熟花粉、生長中的的花粉管、胚珠等不同組織中的表達水平具有顯著差異（Kandasamy et al.，2002）。本研究結果顯示，WtActin1基因在南美蟛蜞菊的根、莖、葉和花中均能穩定表達，且表達水平基本一致，無明顯變化，與太子參（Pseudostellaria heterophylla）PhACT2基因在不同組織中穩定表達的結果（丁鈴等，2017）一致。基于本研究實時熒光定量PCR檢測結果推測WtActin1為組成型表達基因，可作為南美蟛蜞菊功能基因組織特異性表達研究的可靠內參基因。大量研究表明，不同植物的Actin基因在不同脅迫條件下表達穩定性也不同。景寧木蘭（Magnolia sinostellata）Actin基因在熱脅迫下表達不穩定（王倩穎等，2019），但狗尾草（Setaria viridis）Actin基因在干旱和鹽脅迫下表達均十分穩定（張麗麗等，2019）。本研究對不同溫度脅迫條件下WtActin1基因的表達穩定性進行檢測，結果顯示，WtActin1基因表達受溫度影響較小，表達較穩定，與花椰菜（Brassica oleracea）BobACT基因在溫度脅迫下表達較穩定的研究結果（林琿等，2019）一致。可見，WtActin1基因在不同組織及溫度脅迫下均能穩定表達，適合作為內參基因用于南美蟛蜞菊耐熱耐冷功能基因功能研究。該結論填補了南美蟛蜞菊內參基因研究領域的空白，豐富了高等植物Actin基因數據庫，為進一步研究南美蟛蜞菊對溫度耐受性相關基因的表達模式及調控機理的研究提供可靠內參基因。今后還應深入研究南美蟛蜞菊GAPDH、ef1-α和18S RNA等內參基因在不同脅迫處理下的表達穩定性，以豐富南美蟛蜞菊的內參基因庫，提高重要功能基因表達的穩定性、重復性和準確性。

4 結論

WtAtin1基因是Actin基因家族成員，在不同組織及受溫度脅迫下均能穩定表達，可作為內參基因用于南美蟛蜞菊耐熱耐冷功能基因研究。

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（責任編輯 陳 燕）

收稿日期：2020-04-26

基金項目：廣東省自然科學基金項目（2018A030313478）;廣州市科技計劃項目（201707010257）

作者簡介：*為通訊作者，宋莉英（1978-），博士，副研究員，主要從事入侵植物生理生態學研究工作，E-mail：liying_song@126.com。李紅春（1995-），研究方向為植物資源保護，E-mail：18054216733@sina.cn