菊苣酸脂質體制備工藝研究

王玉真，高爽，孫越，張麗，薄福民，封安杰，李凌軍

(山東中醫藥大學 藥學院，山東 濟南 250355)

菊苣酸(chicoric acid ，CA)是一種咖啡酸衍生物，主要存在于紫錐菊、菊苣、白頭翁、蒲公英等天然植物中[1-4]。“免疫植物”紫錐菊作為免疫促進劑和調節劑，受到國內外的極大關注，菊苣酸就是其有效活性成分之一[5-6]。現代藥理學研究表明，菊苣酸具有抗氧化、保護心血管、抗動脈粥樣硬化、抗炎、抗HIV病毒、抗乙型肝炎病毒、降血糖、治療脂肪肝、降尿酸等作用[7]。

菊苣酸化學性質不穩定，受熱見光易分解，膜滲透性差，口服生物利用度較低，容易在胃內發生降解，且腸道吸收較差[8-9]。脂質體作為一種新型藥物載體，具有生物相容性好、生物利用度高、提高藥物穩定性、促進吸收等優點[10]。因此，為了提高菊苣酸穩定性及生物利用度，將其制備成脂質體。目前常用pH梯度、薄膜分散、乙醇注入、逆向蒸發法來制備脂質體，具體選擇何種方法由藥物的性質決定[10]。可以通過透析[11]、高速離心[12]、微柱離心[13]、凝膠柱色譜[14]、超濾離心[15]等方法測定脂質體包封率，每種測定方法都有其優勢和不足，需根據藥物性質及實際情況選擇合適的測定方法。通過前期實驗篩選，確定薄膜分散法為菊苣酸脂質體的制備方法，透析法為菊苣酸脂質體包封率測定方法，在此基礎上，本實驗通過單因素及Box-Behnken design(BBD)響應面法，以菊苣酸的包封率為評價指標，考察菊苣酸脂質體的最佳制備工藝。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Technologies 1260 Series高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；IKA RV8旋轉蒸發儀(艾卡(廣州)儀器設備有限公司)；BLON-650Y超聲波細胞粉碎機(鄭州比朗儀器有限公司)。

1.2 材料

菊苣酸(純度98%，批號171225A，南京道斯夫生物科技有限公司)；菊苣酸對照品(純度97.6% ，批號111752-201703，中國食品藥品檢定研究院)；大豆卵磷脂(w(PC)≥90%，批號T27D9F77974)、膽固醇(純度95%，批號L27J9F66501)、透析袋(截留分子量8000～14 000 D ，批號R27F10J81596)均購自上海源葉生物科技有限公司；水為蒸餾水(山東中醫藥大學制造)；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 方法學考察

2.1.1 色譜條件

Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm , 5 μm)；流動相為乙腈-0.2%磷酸溶液(體積比22:78)；流速為1 mL·min-1；檢測波長為326 nm。

2.1.2 對照品儲備液

精密稱取菊苣酸對照品適量，加甲醇溶解得到濃度為0.476 0 mg·mL-1的菊苣酸對照品儲備液。

2.1.3 供試品溶液

精密量取菊苣酸脂質體溶液1.0 mL，置于10 mL棕色容量瓶中，甲醇溶解定容至刻度，搖勻，用0.22 μm濾膜過濾，即得菊苣酸供試品溶液。

2.1.4 專屬性考察

分別精密移取對照品溶液、空白脂質體溶液和菊苣酸脂質體溶液適量，進樣測定，記錄色譜圖，結果見圖1。

2.1.5 標準曲線的繪制

分別精密移取對照品儲備液0.20，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50 mL于10 mL棕色容量瓶中，甲醇稀釋定容，得濃度分別為0.009 52，0.023 8，0.047 6，0.071 4，0.095 2，0.119 0 mg·mL-1的菊苣酸對照品溶液。進行HPLC測定，記錄峰面積。以菊苣酸對照品溶液濃度為橫坐標X，以峰面積為縱坐標Y，得菊苣酸回歸方程為Y=22 305X-140.14(R2=0.999 7 ，n=6)。結果表明，菊苣酸在0.009 52～0.119 00 mg·mL-1范圍內與峰面積的積分值線性關系良好。

2.1.6 精密度實驗

低濃度、中濃度、高濃度的菊苣酸對照品溶液，每個樣品連續進樣6次，記錄峰面積。測得低濃度、中濃度、高濃度菊苣酸峰面積相對標準偏差分別為 0.60%，0.08%，0.06%(n=6)，表明該方法精密度良好。

圖1 空白脂質體、菊苣酸脂質體、菊苣酸對照品的HPLC圖Fig.1 HPLC diagram of blank liposome, chicoric acid liposome, chicoric acid, and reference substance

2.1.7 穩定性實驗

精密移取一定量的菊苣酸供試品溶液，在室溫下分別放置0，2，4，6，12，24 h后進行測定。測得菊苣酸峰面積相對標準偏差為 0.23%(n=6)，表明供試品在24 h內穩定性良好。

2.1.8重復性實驗

精密移取同一樣品6份，按照2.1.3項下方法制備供試品溶液，進行測定。測得菊苣酸峰面積相對標準偏差為 0.45%(n=6)，表明該方法重復性良好。

2.1.9 加樣回收實驗

精密移取同一已知濃度供試品6份，分別精密加入適量菊苣酸對照品溶液，測定其峰面積，計算加樣回收率，得菊苣酸的平均加樣回收率為103.19%,表明該方法可靠性較高。

2.2 菊苣酸脂質體制備及包封率測定

2.2.1 菊苣酸脂質體的制備

稱取適量的磷脂、膽固醇，加入氯仿振蕩使之溶解，菊苣酸用無水乙醇溶解后，將兩者混勻，在旋轉蒸發器上減壓旋轉蒸發成膜(45 ℃)，繼續抽真空15 min，再加入水合介質，水化一定時間后，冰浴條件下用超聲波細胞粉碎機超聲一定時間(超聲3 s，間隔3 s)，即得菊苣酸脂質體混懸液[16-17]。

2.2.2 菊苣酸脂質體包封率的測定

精密量取適量菊苣酸脂質體，甲醇溶解，過濾，進行HPLC測定，通過計算可得菊苣酸的質量濃度(C0)。另取等量脂質體于透析袋內，以蒸餾水為透析介質，透析8 h，透析后的脂質體用甲醇破乳，過濾，進行HPLC測定，得菊苣酸的質量濃度(C1)，根據式(1)計算菊苣酸的包封率。

包封率=包封的藥量/系統中包封與未包封藥物總量×100%。

(1)

2.3 菊苣酸脂質體的單因素考察

2.3.1 磷脂與膽固醇的質量比篩選

固定卵磷脂與菊苣酸的質量比為10:1，以5 mL蒸餾水作為水合介質，水合時間為30 min，超聲時間為3 min，分別以卵磷脂與膽固醇的質量比為3:1，4:1，6:1，8:1，10:1制備脂質體，測得包封率分別為49.69%，51.07%，43.06%，38.91%，39.10%。結果表明，當卵磷脂與膽固醇的質量比為4:1時包封率最大，且隨著卵磷脂與膽固醇的質量比的逐漸增加包封率先增后減。

2.3.2 磷脂與藥物的質量比篩選

固定卵磷脂與膽固醇的質量比為4:1，以5 mL蒸餾水作為水合介質，水合時間為30 min，超聲時間為3 min，選取卵磷脂與藥物的質量比為8:1，10:1，12:1，14:1，16:1制備脂質體，測得包封率分別為43.20%，51.07%，53.03%，51.48%，45.67%。結果表明，當卵磷脂與菊苣酸的質量比為12:1時包封率最大，比例增大或減小包封率均降低。

2.3.3 水合介質種類篩選

固定卵磷脂與膽固醇的質量比為4:1，卵磷脂與藥物的質量比為12:1，水合介質用量為5 mL，水合時間為30 min，超聲時間為3 min，水合介質分別為水和pH6.4,pH6.8,pH7.2的PBS(磷酸鹽)緩沖液制備脂質體，測得包封率分別為52.31%，51.56%，47.82%，54.47%。結果表明，pH7.2的PBS緩沖液作為水合介質時包封率最大。

2.3.4 水合介質用量篩選

固定卵磷脂與膽固醇的質量比為4:1，卵磷脂與藥物的質量比為12:1，水合介質為pH7.2的PBS緩沖液，水合時間為30 min，超聲時間為3 min，水合介質用量分別為5，10，15，20 mL，測得包封率分別為53.25%，63.01%，62.19%，63.42%。結果表明，當水合介質用量為10 mL或更多時，包封率變化不大，因此水合介質用量固定為10 mL。

2.3.5 水合時間篩選

固定卵磷脂與膽固醇的質量比為4:1，卵磷脂與藥物的質量比為12:1，水合介質為pH7.2的PBS緩沖液10 mL，超聲時間為3 min，水合時間分別為30，60，90，120 min，測得包封率分別為64.43%，66.23%，62.38%，58.44%。結果表明，當水合時間為60 min時，包封率最大。

2.3.6 超聲時間篩選

固定卵磷脂與膽固醇的質量比為4:1，卵磷脂與藥物的質量比為12:1，水合介質為pH7.2的PBS緩沖液10 mL，水合時間分別為60 min，超聲時間分別2，4，6，8，10 min，測得包封率分別為63.72%，69.65%，72.38%，68.06%，61.80%。可知隨著超聲時間的逐漸增加，包封率先增大后減小，在超聲時間為6 min時包封率最大。

2.4 Box-Behnken design響應面法優化脂質體處方

2.4.1 實驗設計及結果

以單因素試驗為基礎，選擇了卵磷脂與膽固醇質量比(X1)、卵磷脂與菊苣酸質量比(X2)、超聲時間(X3)這三個對脂質體包封率影響較大的因素作為實驗因素，采用響應面法(BBD)進行分析，以包封率(Y)為評價指標。實驗設計及結果見表1、2。

表1 Box-Behnken試驗設計因素和水平

表2 Box-Behnken試驗設計及結果

2.4.2 模型擬合

本實驗通過Design Expert軟件對實驗數據(表2)進行了分析及模型擬合，結果見表3，并對得到的擬合模型進行了評價，得到回歸方程：

Y=74.97+0.29X1-2.53X2+1.60X3-1.75X1X2+0.41X1X3-0.21X2X3-2.20X12-5.24X22-3.20X32(R2=0.981 8，P< 0.000 1，F=41.95，失擬度檢驗P=0.055 5> 0.05、F=6.17 )。

由擬合結果可知，模型F=41.95，P< 0.000 1，說明該擬合模型具有高度顯著性；失擬值F=6.17，P>0.05，說明失擬值不顯著性，模型無失擬情況且擬合良好，因此，可以用該模型對實驗結果進行統計分析。方程的決定系數R2=0.981 8>0.95，說明該模型能準確地預測實際情況[18]。

表3 方差分析結果

續表3

2.4.3 響應面工藝優化分析

根據擬合得到的結果，保持一個因素水平不變，繪制出Y與其他2個因素的等高線圖和3D效應曲面圖，從而預測出菊苣酸脂質體的最優制備工藝，見圖2。由圖2和表3數據可知，X2，X3，X1X2，X12，X22，X32的P值均小于0.05，對包封率影響顯著，且各因素之間存在交互影響。

圖2 Y與(X1，X2，1)、(X1，X3，2)、(X2，X3，3)三因素的三維效應曲面圖和等高線圖Fig.2 Three-dimensional effect surface diagram and contour map of Y and three factors(X1, X2, 1),(X1，X3, 2), and (X2，X3, 3)

根據Box-Behnken響應面試驗設計結果，得到菊苣酸脂質體最優工藝條件：磷脂與膽固醇的質量比為4.20:1，磷脂與藥物的質量比為11.44:1，超聲時間為6.54 min。在實際實驗過程中為了操作便捷，僅保留小數點后一位，即磷脂與膽固醇的質量比為4.2:1，磷脂與藥物的質量比為11.4:1，超聲時間為6.5 min。為檢驗結果的可靠性，根據上述調整后條件進行3批驗證實驗，測得包封率的平均值為75.18%，相對標準偏差為2.1%，與理論預測值(75.57%)相差不大，相對偏差低于3%，表明該模型可靠，菊苣酸脂質體制備采用響應面法具有可行性[19]。

2.5 脂質體的載藥量、粒徑和Zeta電位

測定最優工藝所得菊苣酸脂質體的載藥量，并采用納米激光粒徑分析儀分別測定脂質體的平均粒徑、多分散指數(PDI)和Zeta電位。實驗結果表明 ，其載藥量為5.15%、平均粒徑為150.73 mm、PDI為0.244、Zeta電位為-12.82 mV，粒徑分布及Zeta電位圖見圖3。

圖3 菊苣酸脂質體的粒徑分布與Zeta電位Fig. 3 Particle size distribution and zeta potential of chicoric acid liposome

3 結論與討論

在前期實驗中，分別用高速離心法、透析法和葡聚糖凝膠微柱離心法來測定菊苣酸脂質體的包封率，在高速離心的過程中，規定時間內脂質體無法在離心管中有效沉積，后來又延長離心時間，脂質體與游離藥物也無法有效分離，因此該方法不能用來測定菊苣酸脂質體包封率。葡聚糖凝膠微柱離心法測定脂質體包封率時，利用分子篩的原理分離脂質體及游離藥物，實驗結果表明空白脂質體可以有效地洗脫下來，但凝膠微柱對游離藥物保留率不高，從而導致脂質體與游離藥物也無法有效分離，因此該方法無法有效分離脂質體與游離藥物。透析法測定包封率時，透析8 h后透析袋內外游離藥物濃度即可達到平衡，脂質體被有效截留在透析袋內，且菊苣酸在該時間段內保持穩定。因高速離心法和葡聚糖凝膠微柱離心法無法將脂質體與游離藥物有效分離，最終選擇透析法作為菊苣酸脂質體包封率測定方法。

本實驗也分別考察了薄膜分散法、乙醇注入法、逆向蒸發法制備菊苣酸脂質體，實驗結果顯示，采用薄膜分散-超聲法制得菊苣酸脂質體時包封率較高，因此確定菊苣酸脂質體制備方法為薄膜分散-超聲法。采用單因素試驗，考察了卵磷脂與膽固醇的質量比、卵磷脂與藥物的質量比、水合介質種類、水合介質用量、水合時間和超聲時間，確定了水合介質為pH7.2的PBS緩沖液、用量為10 mL、水合時間為60 min，又通過Box-Behnken試驗設計得到了Y與X1，X2，X3三者之間關系的回歸模型，充分考慮了各因素的交互作用[20]，得到優化后制備工藝條件：磷脂與膽固醇的質量比為4.20:1、磷脂與藥物的質量比為11.44:1、超聲時間為6.54 min，在此條件下制備得到的脂質體包封率為75.18%，驗證實驗結果表明，該制備工藝穩定可行。

目前，脂質體制備用到的水化介質多為水或磷酸鹽緩沖液(具體選擇何種水化介質需根據藥物性質確定)，因此制備得到的大多數載藥脂質體均處于水系環境中，存在脂質體融合、藥物滲漏、磷脂水解等問題，不適合長時間貯存。冷凍干燥法被證實是可以有效改善脂質體長期穩定性的方法之一，因此下一步可將制備好的菊苣酸脂質體混懸液制備為菊苣酸脂質體凍干制劑，以提高制劑的穩定性。