呼吸道合胞病毒及其感染相關TLRs的研究進展

杜海濤，孫鐵鋒，王平,3*，安豐田，胡亞楠，李娜

(1.山東中醫藥大學 藥學院，山東 濟南 250355；2.山東省中醫藥研究院，山東 濟南 250014；3.天津大學 精密測試技術及儀器國家重點實驗室，天津 300072；4.青島市市立醫院 藥學部，山東 青島 266011)

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)為副黏病毒科，肺炎病毒，屬單股負鏈RNA病毒，是每年冬春流行季引起幼兒呼吸道疾病的主要病原之一[1]。RSV目前尚無成熟的疫苗和藥物推廣使用，而其引發的肺炎造成每年約百萬名兒童死亡，相關醫療保健花費約為3.94億美元，成為全球范圍內一大醫療負擔[2-3]。

RSV入侵的最主要的靶細胞為氣道上皮細胞，侵染之后可激活人體固有免疫并釋放相關干擾素及炎癥細胞因子[4-6]。Toll樣受體 (Toll-like receptors, TLRs) 是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁，能夠以多種方式識別RSV，并通過細胞內相關信號傳導，在固有免疫過程中起主導作用，也能夠調節獲得性免疫，在機體免疫過程中發揮重要作用。本文就RSV的生物學結構和相關TLRs展開綜述，總結近年來相關領域的國內外研究進展，為臨床預防和治療RSV感染提供思路。

1 RSV的生物學結構

RSV是非節段、負鏈線性 RNA 病毒，有 A 和 B 兩個亞型。遺傳物質為單鏈RNA，基因組長度15.2 kb，含10個基因，能編碼11種蛋白質，包括9種結構蛋白和2種非結構蛋白(nonstructural protein, NS)[7]，此段RNA能編碼NS1和NS2兩種蛋白，如圖1所示。RSV結構蛋白由跨膜蛋白(黏附蛋白 G、融合蛋白F、疏水蛋白 SH)、核蛋白(L、P、N蛋白)、基質蛋白(M)構成，結構如圖2所示。近期研究表明[8]，復制性缺陷性病毒基因組(cbDVGs)是體內外抗RSV免疫應答的重要啟動子，運用生物信息學方法確定并創建的微型基因組系統具有從遺傳調控角度調節感染結果的可能性。

圖1 RSV單鏈RNA結構圖Fig.1 Single-stranded RNA structure of RSV

圖2 RSV結構示意Fig.2 Structure of RSV

RSV跨膜蛋白主要起識別、黏附、融合等作用，在病毒入侵和復制等過程中起重要作用，也是機體免疫、藥物和疫苗開發的重要靶點。G蛋白在宿主細胞附著中起作用，可刺激機體產生抗體，具有較強的變異性，也是亞型不同的體現，還可能是逃過機體特異性免疫識別的關鍵[9]。F蛋白負責融合和進入細胞，具有高度保守性，是理想的抗RSV靶標，目前國外上市的RSV疫苗如單克隆抗體帕麗珠就以F蛋白為靶標[10]。Wiegand等[11]將RSV的F蛋白作為抗原嵌入新型載體疫苗，體內實驗表明，嵌合RSV的F蛋白疫苗具有良好的抗原呈遞性能，并能大量誘導免疫應答，這也給其他感染性疾病的解決提供了思路。位于細胞表面的TLR2/6或TLR4可特異性識別RSV的F蛋白，進而激活人體免疫系統[12]。SH蛋白為一種活孢子蛋白，能夠改變細胞的通透性，允許低分子進入，主要和滲透以及后續引發的炎癥、免疫反應有關[13]。

RSV核蛋白用于調節和保護遺傳物質。L蛋白調節病毒 RNA的復制和轉錄， P蛋白為病毒在體內外復制所必需的一種蛋白，N蛋白用于保護病毒RNA免受核酸酶的影響[14]，M2-1蛋白能夠推動所有RSV基因的轉錄，M2-2蛋白介導從轉錄到RNA復制的“轉換”。

除結構蛋白外，RSV 編碼有兩種非結構蛋白：NS1 和 NS2，這兩種蛋白是RSV抵御宿主細胞天然免疫反應的機制，可通過阻斷JAK-STAT通路抑制Ⅰ型和Ⅲ型干擾素(IFN)的合成和信號轉導[15-16]。Bossert等[17]報道，敲除RSV的NS基因能顯著影響其在含IFN環境中的復制，但在缺少IFN環境中，RSV可正常復制。這表明NS蛋白，即NS1 和 NS2蛋白可能不參與RSV復制過程，但參與干擾機體抗病毒IFN合成的相關過程。汪旻旻等[18]使用干擾小RNA (small interfering RNA，siRNA)干擾RSV的NS2蛋白表達，將其感染A549細胞后發現，NS2在病毒侵染過程可通過影響TLR7進而干擾機體干擾素的表達過程。

從上文可以看出，機體固有免疫在識別病毒靶蛋白和抑制復制等過程中起到重要作用，適當提高免疫可有效阻止部分病毒侵染過程。TLRs是最相關，也是研究最廣泛的固有免疫系統之一，因此在抗RSV藥物和疫苗研發過程中具有深入研究的價值和良好的發展。

2 TLRs研究進程

人體有多種固有免疫細胞與分子參與對RSV的識別、保護及清除過程，包括不同的細胞免疫(上皮細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、單核細胞和粒細胞等)、模式識別受體(PRRs)及大量的細胞因子和趨化因子、細胞應激和細胞凋亡過程等[19]。 TLRs屬于模式識別受體(PRRs)的一種，人體TLRs 由TLR 1～ 10組成，可對多種微生物產生反應，與 RSV 感染過程相關的主要有TLR2、TLR3、TLR4、TLR6、TLR7等，TLR4、TLR2、TLR6位于質膜上，TLR7和TLR3位于內體膜上，可識別RSV的ssRNA、dsRNA或病毒包膜蛋白，并通過MyD88或TRIF傳導信號[20]。TLRs可感知RSV，在RSV疾病的適應性免疫方面和疫苗開發中非常重要，可通過識別不同的病原體相關分子模式(PAMPs)招募被髓樣分化因子(MyD88)、含TIR結構域誘導β干擾素的接頭蛋白 (TIR-domain-containing adaptor inducing interferon-β, TRIF)等，使轉錄因子NF-κB或干擾素調節因子(IRF)入核，進而調節促炎細胞因子和Ⅰ型、Ⅲ型IFN的表達[21-22]。促使細胞因子生成和釋放，引起被感染的細胞生成白介素類、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等，從而產生相應炎癥免疫應答過程。Ⅰ型、Ⅲ型IFN是典型的抗病毒細胞因子，以旁分泌或自分泌的方式作用于其受體，激活酪氨酸蛋白激酶/信號傳導與轉錄活化因子(JAK/STAT)通路，導致干擾素刺激基因(ISG)的表達，這些ISG直接或間接干擾病毒復制并促進病毒清除[23]，其過程如圖3所示。

圖3 主要TLRs抗RSV過程Fig.3 Anti-RSV process of TLRs

2.1 TLR2和TLR 6的研究進展

TLR2和TLR6多以二聚體形式位于細胞表面，可識別肽聚糖或脂蛋白，通過MyD88介導的途徑激活隨后的先天免疫過程。Segovia等[24]驗證了TLR2/MyD88/NF-κB信號通路是RSV感染過程中Toll/IL-1受體超家族(IL-1β)前體基因和NOD(nucleotide binding oligomerization domain)樣受體家族3(NOD-like receptors,NLRP3)基因表達的必要通路，并作為巨噬細胞產生IL-1β的“第一信號”從而在RSV相關炎癥調節反應中發揮重要作用。Murawski等[25]利用基因敲除小鼠，證明白細胞TLR2和TLR6信號通路通過促進TNF-α、IL-6、CCL2 (monocyte chemoattractant protein 1)和CCL5(RANTES)而激活針對RSV的天然免疫，另外，TLR2與RSV的相互作用促進了中性粒細胞的遷移和肺內樹突狀細胞的激活。

可以看出，TLR2/6雖然不參與直接的抗病毒過程，但因其在病毒識別以及輔助激活免疫過程中的作用仍然值得國內外學者進一步研究。中醫認為“肺與大腸相表里”，而腸道菌群是調控固有免疫的重要因素。近年來，多個研究表明從中藥或天然藥物中提取分離的多糖類成分能夠通過TLR2影響免疫，如從酸漿果實中提取的均質多糖[26]、從孔雀草中分離的巖藻依聚糖[27]等。采用基因測序分析經清絡通痹湯灌胃的類風濕性關節炎大鼠腸道菌群，發現Staphylococcus和Candidatus_Saccharimonas等與TLR2/6表達上調密切相關，為我們通過抗炎緩解RSV所致肺炎提供了思路。而通過觀察RSV感染后大鼠血清中膽汁酸的變化已經間接證明了其腸道菌群的變化[28]，在此方向繼續研究應有可觀的進展。

2.2 TLR4的研究進展

TLR4是PRR中第一個已知的RSV受體，也是與RSV感染最為密切的TLRs之一，因此相關研究較廣泛。TLR4 主要識別RSV 的融合蛋白F和細胞結構表面的脂多糖(LPS)，通過TRIF或MyD88介導傳遞信號[29]，作用于TLR4/NF-κB信號通路。RSV影響此過程并激活NF-κB誘導前炎性因子基因轉錄進而引發TNF-α、IL-6、IL-8等的過量表達最終對肺組織造成病理損傷。

李萌等[30]發現RSV感染后TLR4/NF-κB信號通路表達上調，可通過抑制此通路使得NF-κB調控的TNF-α等炎性因子表達受阻，達到遏制由TLR4引發的不斷擴大的炎性反應。黃艷嫻[31]給予RSV感染小鼠重組人干擾素α1B，檢測發現外源性干擾素可抑制TLR4/NF-κB通路的過表達，且給予劑量越大，通路信號變化越明顯，肺組織炎性損傷越小。

李濤[32]發現TLR4與TAK1的蛋白表達呈現正相關關系，同時也呈現平行抑制關系，而金欣口服液能同時抑制信號通路中TLR4、轉化生長因子β激活激酶1(TAK1)蛋白的表達。證明金欣口服液可通過TLR4/MyD88/TAK1/NF-κB/TNF-α系列途徑發揮抗RSV作用。

近期研究表明，RSV能夠感染人神經系統，引起嗜睡、驚厥和癲癇等癥狀。Yuan等[33]發現RSV能夠感染N2a神經細胞，并影響TLR4和核仁素C23，提高TLR3和TLR7及下游炎癥因子的表達。此過程中RSV的 F蛋白和TLR4、C23共定位，推測其可能在感染過程中起重要作用。

也有學者對RSV的基因多態性進行研究，Zhu等[34]通過將196例呼吸道合胞病毒感染住院患兒和311例健康對照者作為研究對象，采用聚合酶鏈反應(PCR)和測序分析發現TLR4基因存在14個不同的遺傳多態性，發現在14個多態性位點中，TLR4基因3‘非編碼區rs41426344(G/C)與RSV感染風險和疾病嚴重程度有關，推測其與中國地區嬰幼兒RSV感染程度密切相關。

TLR4是研究較多炎癥反應的受體，其過量表達會造成肺部組織損傷。目前抑制TLR4/NF-κB信號通路已成為開發藥物抗RSV的重要方法。已有單克隆抗體藥物在免疫調控靶向治療方面體現優勢，針對TLR4信號阻斷的單克隆抗體研究取得了進展，成功構建了鼠抗人抗TLR4單克隆抗體，并通過實驗證明可顯著抑制TNF-α等炎癥因子的釋放[35]。干擾素已在臨床規模使用，具有良好的抗RSV效果，若能通過實驗驗證并解釋其抗RSV機制，對于推動抗病毒藥物的發展將有良好的指導作用。

2.3 TLR3的研究進展

TLR3為Ⅰ型跨膜蛋白，位于內體區室，TLR3可識別dsRNA(或dsRNA的合成類似物)和聚胞苷-聚胞苷酸(poly IC)，通過TRIF介導誘導先天免疫應答。雖然RSV屬于ssRNA病毒，但其在細胞質復制過程中會產生dsRNA中間體，從而被內體吸收，使TLR3感知RSV病毒做出相關免疫反應，促使Ⅰ型IFN和促炎細胞因子生成。

何漢文[36]通過干擾A549細胞的TLR3、TLR7基因表達，觀察RSV感染后mRNA轉錄水平及蛋白表達水平，發現RSV感染后能夠活化TLR3、TLR7 和mRNA，并通過促進相應IRF3、IRF7誘導Ⅰ型IFN產生。TLR3沉默組的炎癥因子TNF-α、IL-1β升高趨勢更加明顯，說明TLR3相較于TLR7可能在抗RSV免疫過程中更占主導地位。

TLR3信號傳導途徑可能與Ⅰ型IFN的產生相互作用。Song等[37]研究表明，RSV在HEK293細胞中通過poly IC刺激影響Ⅰ型IFN的產生，并提出RSV的G蛋白或可溶性G蛋白通過阻斷TRIF/TICAM-1途徑抑制TLR3、TLR 4介導的Ⅰ型IFN產生。

肺中血小板也是宿主免疫應答的重要組成部分，人外周血單核細胞(PBMC)中的血小板能顯著降低RSV感染程度。研究表明，經TLR3識別RSV后，血小板與PBMC直接接觸并調節免疫應答，導致Ⅰ型IFN增加，并通過內化RSV，減少被感染單核細胞中病毒顆粒的量。

可見TLR3于多途徑多方面發揮抗RSV作用，激活后通過多種途徑促使Ⅰ型IFN釋放，最新研究發現TLR3在激活IRF3的同時，共同促進了胞內蛋白(例如ISG49，ISG54)和分泌蛋白(例如IFN-β，IP-10，IL-15)的表達[38]。在巨噬細胞中，某些dsRNA[39]、聚胞苷酸誘導[40]、干擾素調節因子[38]等可通過各種途徑影響干擾素應答，因此TLR3缺陷患者易致嚴重肺炎[41]。但當前研究仍未全面涵蓋其免疫反應過程，基因、數個蛋白、眾多代謝物間的靶點和網絡相關性尚不明確。若能構建病癥整體網絡，通過網絡藥理學方法整合相關數據庫信息、預測，再通過預測結果進行推斷、驗證，是我們進一步工作的重點方向。

2.4 TLR7的研究進展

TLR7位于細胞內體區室，能夠識別經內吞作用吞噬的RSV粒子和RSV復制產生的ssRNA，被激活后通過MyD88介導的途徑傳遞信號。誘導Ⅰ型IFN，活化NF-κB，從而激活免疫炎癥反應。何漢文等[36,42]通過使用RSV感染A549細胞誘導產生Ⅰ型IFN，探討了TLR7在相關免疫反應中的作用，A549細胞在感染之后可活化上調TLR7、IRF7、Ⅰ型IFN的mRNA和TLR7的蛋白表達，沉默TLR7之后，IRF7的表達下調，IFN產生減少，抗病毒作用降低。

研究表明，TLR7可能與RSV感染之后導致的氧化應激有關[43-44]。RSV感染后，氣道上皮細胞氧化酶(AOE)表達明顯降低，氧化應激明顯提高，而氧化應激調節過程可能揭示一種改善RSV誘導的急性肺部炎癥的潛在治療方法。朱童娜等[45]通過觀察RSV感染人肺上皮細胞(A549細胞)引起的氧化應激對TLR7活化及信號分子的作用，發現加入抗氧化劑處理可明顯減輕TLR7及下游主要信號分子的表達與細胞抑制率，做出RSV感染活化TLR7及引發的細胞損傷可能是通過氧化應激途徑引起。SUN等[46]發現RSV感染A549細胞后，TLR7及其下游炎性細胞因子的表達增加，而氧化應激也促進了TLR7及其下游炎性細胞因子的表達。Nrf2/ARE通路在RSV感染過程中對TLR7的表達起著重要的調節作用。

盡管TLR7在氣道上皮細胞中的表達比較低，但其在RSV感染中的作用已被證實，TLR7可能在RSV檢測和隨后的先天免疫啟動中起關鍵作用。氧化應激調節作為一種抗RSV潛在治療方法，近年來備受關注，活化TLR7通路可以上調抗氧化酶的表達，進而保護巨噬細胞免受RSV引起的巨噬細胞氧化應激損傷。而氧化應激是否對TLR7具有反饋調節作用和具體通過何種通路調節還未見確切報道，需要結合生物信息學與網絡藥理學等進一步探究并驗證。

3 總結與展望

RSV是世界范圍內嬰幼兒因肺炎住院的主要原因，被感染者會出現細支氣管炎、肺炎、哮喘，嚴重者甚至會引起腦炎、心臟病等[47]。目前對RSV感染后原理過程尚不明確，多數看法為氣道局部的炎癥反應和抗炎介質的失衡，因此由TLR通路引發的大量炎癥介質及固有免疫和細胞免疫可能是引發和控制疾病的重要因素。隨著人們對TLRs研究的不斷深入，并通過基因敲除實驗，發現TLR3和TLR4在針對RSV免疫過程中扮演著重要的角色，目前檢測二者相關蛋白表達以判斷藥物是否起到抗RSV作用已越來越被科研工作者接受，并借此發現了諸多抗RSV有效藥物，如發現霧化吸入重組人干擾素α1B可通過調節TLR4/NF-κB信號通路發揮抗RSV作用，且效果優于腹腔注射，提示我們可以通過將合適的藥物通過霧化吸入，直接將其送入病變部位進行高效有針對性的靶向治療。

目前，常用抗RSV西藥利巴韋林因副作用過多，臨床使用存在爭議，已不推薦用于患兒治療[48]。RSV肺炎的發生發展涉及到多環節、多系統，針對一個或者幾個靶點的藥物已經越來越不能滿足臨床標本兼治的需求。而中藥及天然藥物因有中醫整體觀的指導，在復方新藥開發過程中扮演著重要角色，中藥復方定喘湯[49]、銀翹散[50]、中成藥制劑金欣口服液[51]、中藥單味藥金銀花[52]、中藥提取成分黃芩苷[53]等能通過部分TLRs通路發揮抗病毒功效，運用新的方法如網絡藥理學、代謝組學等對其作進一步深入研究是其發展方向。如汪授傳教授團隊前期研究已證明金欣口服液具有顯著的抗RSV功效，并通過系列研究發現金欣口服液能夠調控TLR3、TLR7、TLR4等激發IRF和NF-κB相關通路，進而調節機體免疫過程，體現了中藥復方通過多靶點發揮治療作用[32, 51, 54-55]。

基于當前研究，我們總結基于病毒對應TLRs，篩選抗RSV的新藥模式大致思路如下：

(1)采集臨床患者的血清、尿液等樣品，開展相關代謝組學研究，確定相關靶點與信號通路等信息。

(2)運用網絡藥理學搜尋、評價、預測候選新藥，并結合臨床數據信息、生物信息學指標、病毒結構等，以TLRs通路為主，篩選并聚焦得到的藥物配伍配比。

(3)建立動物模型，通過生物學實驗驗證，進行傳統藥理、藥效、安全性評價等。

然而國內針對抗RSV免疫過程研究多集中在體外細胞實驗，研究中醫藥對RSV感染誘導的TLRs通路的體內調控過程研究比較少見，中藥有效成分物質群與機體免疫系統之間聯系較少，沒有結合中醫基本理念探究，強調“多成分，多靶點”的同時卻沒能做出主次靶點和配伍之間的關系，物質基礎及作用機理交代不明。關于TLRs調控RSV感染所致的疾病的機制研究多集中于國外，我們尚不能全面細致揭示中藥的抗病毒機制，仍需要大量的、深高層次的研究去解決這一問題。