骨碎補對去卵巢大鼠骨微結構的保護作用

張峻瑋，陳玲玲，李琰，李朝輝 ，聶偉志，徐展望

(1.山東省文登整骨醫(yī)院，山東 文登 260014 ； 2.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山東 濟南 250014)

隨著經濟社會的發(fā)展，人口老齡化趨勢嚴重，骨質疏松癥(osteoporosis，OP)的發(fā)病率也越來越高。骨質疏松癥是一種以骨量減低、骨細微結構退化、骨強度降低為特征的骨代謝疾病，病變廣泛，涉及全身，且常伴隨骨脆性的增加，最終導致骨折[1]等嚴重并發(fā)癥。中醫(yī)藥是治療骨質疏松常用的方法之一，具有多靶點、多渠道、多機制的特點。骨碎補則是目前常用治療骨質疏松癥的中藥之一，具有明顯的抗骨質疏松的作用，但其具體作用機制尚不完全明確。

骨質疏松癥最常用的診斷方法是雙能X射線吸收測定法(DXA)，具有操作簡單、輻射量小、花費低等優(yōu)點。然而，骨骼的機械性能是由骨骼的幾何形態(tài)、微結構特性和內在材料特性等多因素決定的。骨質疏松癥發(fā)生后，骨強度的降低，不僅僅表現(xiàn)在骨量的減少，而且與骨小梁微結構的變化、皮質骨形態(tài)改變、骨礦化的程度和分布，以及骨基質和礦物質的組成等等密切相關[2-3]。常規(guī)DXA僅僅能檢測出單位面積上的骨量即BMD(g/cm2)的變化，無法反映單位體積上骨量即BMD(g/cm3)的變化，更無法反映上述其他情況。為了更好地對骨骼微細結構進行觀察，以往多采用骨組織形態(tài)計量學分析的方法進行研究[4]，以獲得相關指標，如骨小梁體積百分比、骨小梁吸收面積百分比等，但過程復雜，且觀測對象為二維圖像，對骨小梁厚度、骨小梁空間結構等眾多參數(shù)無法有效分析。高分辨率顯微CT的發(fā)展，解決了上述部分問題，具有高分辨率、低成本、使用方便、能夠在不處死動物或損傷標本的前提下，對小動物和標本進行掃描的特點。同時利用強大的圖像處理軟件，可以立體三維多角度地觀察骨形態(tài)情況，克服了病理切片中因標本形狀或結構而限制操作或不易觀察目標區(qū)域的困難[5]。

骨組織包括皮質骨和松質骨。松質骨主要負責快速骨轉換和調節(jié)全身礦物質穩(wěn)態(tài)，而皮質骨主要起支架作用[6]。發(fā)生絕經后骨質疏松時，松質骨的骨小梁最先發(fā)生變化，出現(xiàn)密度降低、數(shù)量減少、小梁間脂肪組織增生等變化。目前，已經有研究發(fā)現(xiàn)骨髓中脂肪含量與骨密度關系密切。成年后，骨髓中脂肪含量隨著年齡及絕經時間的增加而增加，其相對量與骨組織的BMD呈負相關[6]。而在青春期前，女性骨髓中脂肪含量與BMD呈正相關，表現(xiàn)在隨著年齡增長，骨髓中脂肪含量增加，同時BMD也增加[7]。骨髓脂肪組織由脂肪細胞形成，骨髓脂肪細胞( bone marrow adiposity, BMA)呈單泡，近圓形，大小不一，平均直徑約50 μm[8]，來源于骨髓間充質干細胞。由于BMA和成骨細胞均來源于骨髓中的間充質干細胞[9]，當骨髓間充質干細胞向脂肪細胞分化增多的同時，往往伴有向成骨細胞分化的減少，因此成骨與成脂之間存在著此消彼長的關系。這個過程，受到體內激素、骨髓微環(huán)境中細胞因子及信號通路的影響。同時，BMA還可以通過釋放相關蛋白、細胞因子反向調節(jié)成骨細胞、骨髓間充質干細胞及破骨細胞，進一步影響骨代謝。以上種種研究表明，骨髓腔內的脂肪細胞及脂肪組織不僅僅是既往認為的起到填充骨髓腔、機械性支撐作用，還可能是一個新的內分泌“器官”，可以通過各種機制影響骨密度及骨代謝[10]。

骨代謝指標包括骨代謝調節(jié)激素、細胞與體液因子、骨吸收、骨形成標志物等，雖不能作為骨質疏松診斷的金標準，但通過檢測相關指標，可以了解骨組織代謝情況，對骨質疏松的診斷與分型、預測骨折風險等均有較大幫助[11]。TRAP、CTX-1、MMP-9均為骨吸收標記物。骨吸收時, 破骨細胞分泌酸和蛋白酶，在骨基質與破骨細胞之間形成空隙,而位于破骨細胞微粒體中的TRAP ,隨即通過破骨細胞進入此空隙, 與其他酶一起參與骨基質的降解。因此測定血清中TRAP的濃度，有助于了解生理和病理條件下的骨代謝狀況，在絕經后骨質疏松癥中，血清TRAP含量增加。CTX也是反應骨吸收的有效標志物，在骨質疏松狀態(tài)下，破骨細胞活性增強，Ⅰ型膠原大量降解，形成C-末端肽，進一步降解為CTX-1，CTX-1增多是以破骨細胞活性顯著增強為特點的[12]。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase ,MMPs)則是一族鋅離子依賴性內肽酶, 廣泛存在于各種結締組織中,MMP-9 屬Ⅳ型膠原酶，是破骨細胞的關鍵酶, 代表破骨細胞的活性, 在破骨細胞中呈特異表達, 可降解細胞外基質, 在破骨性骨吸收中發(fā)揮著重要作用[13]。

本文利用Micro-CT(micro computed tomography)及骨組織切片對實驗大鼠骨組織形態(tài)進行觀察，利用酶聯(lián)免疫吸附測定法 (enzyme-linked immuno sorbent assay , ELISA)對其血清骨代謝指標進行檢測，探討其在絕經后骨質疏松癥中的骨保護作用及可能作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物及飼養(yǎng)環(huán)境

36只健康雌性SD大鼠(SPF級)，周齡24周，體重(315.84±7.38)g，飼養(yǎng)環(huán)境清潔，通風良好，自由飲水進食，實驗動物由濟南朋悅公司提供，合格證號為SCXK(魯)20140007。

1.2 主要儀器設備

骨密度儀(法國MEDILINK公司)；Micro-CT(瑞士Scanco Medical公司)；研究用萬能級顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；酶聯(lián)免疫儀(美國Biotek公司)；MMP-9、TRAP、CTX-1 ELISA試劑盒(武漢基因美公司)；低溫離心機(德國Eppendorf公司)。

2 實驗方法

2.1 動物分組及模型建立

實驗動物適應性飼養(yǎng)7 d，隨機分為實驗組(OVXDF)、模型組(OVX)、假手術組(SHAM)，每組12只。OVXDF、OVX組術前禁飲食12 h，腹腔注射戊巴比妥鈉(10 g/L)麻醉，手術切除雙側卵巢[14]，假手術組(SHAM)僅摘除卵巢周圍少量脂肪組織。手術后適應性飼養(yǎng)8周。

2.2 骨碎補水煎液的提取及實驗動物灌胃

取100 g骨碎補(購于山東省文登整骨醫(yī)院)放入鍋中，水浸泡1 h，大火煮沸后再繼續(xù)煮30 min，濾出藥液，再次加水，二煎20 min后，再次濾出藥液，將一煎、二煎濾出藥液混合，倒入燒杯中，溫火蒸餾至100 mL，即獲得實驗用骨碎補水煎液(濃度為1 g/mL)。

骨密度檢測造模成功后，實驗組(OVXDF)參考本課題組前期實驗研究，按照4.8 g/只劑量(相當于人體公斤體重每日用藥的10倍)給予骨碎補水煎液灌胃[15]，模型組(OVX)及假手術組(SHAM)給予0.9% 生理鹽水灌胃每日兩次,每次3.0 mL/只，連續(xù)12周。造模、灌胃期間無實驗動物死亡。

2.3 大鼠骨密度測量

分別于術后及灌胃12周后將大鼠麻醉，利用雙能X光全身骨密度儀測量大鼠L4-5、雙側股骨骨密度。

2.4 脛骨干骺端骨結構參數(shù)檢測

灌胃12周后，每組分別隨機抽取5只大鼠，放置于Micro-CT機，相同條件下(源電壓70 kV，源電流85 μA，1000投影/180度，積分時間350 ms，層厚6 μm)進行骨掃描，掃描后相關數(shù)據(jù)上傳至Micro-CT工作站。檢測骨結構參數(shù)，包括骨礦物質密度BMD(g/cm3)、骨礦含量BMC(g)、反映松質骨骨小梁骨量的BV/TV(%)、骨小梁厚度Tb.Th(μm)、骨小梁數(shù)量Tb.N(mm-1)、骨小梁分離度Tb.sp(mm)、結構模型指數(shù)SMI，利用Micro-CT自帶軟件進行分析。

2.5 大鼠外周血中TRAP、MMP-9、CTX-1含量檢測

取大鼠外周血，靜置20 min，離心后取上清液，分別按照TRAP、MMP-9、CTX-1的ELISA試劑盒說明書操作，于450 nm波長檢測各孔的光密度值并代入標準曲線計算蛋白質表達水平。

2.6 骨組織形態(tài)學觀察及分析

處死實驗大鼠，每組取5只大鼠左側股骨，洗凈后放入10%的甲醛溶液中固定48 h，流水沖洗、蒸餾水浸泡24 h后，將標本脫鈣，3～4 h后停止脫鈣。堿性溶液中和、流水洗滌12 h后，再分別進行脫水、透明和浸蠟，完成后以石蠟包埋、切片，切片厚度5.0～7.0 μm，烘片時間約10～15 min。常規(guī)HE染色，光鏡下進行組織形態(tài)學觀察。

2.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)以(均數(shù)±標準差)表示，各組間比較采用完全隨機設計的方差分析，P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結果

3.1 骨密度

手術后OVXDF及OVX組大鼠雙側股骨及腰椎骨密度明顯小于SHAM組，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，OVXDF及OVX組之間比較差異無明顯統(tǒng)計學意義(P>0.05)，表明骨質疏松模型造模成功,見圖1。

圖1 術后大鼠腰椎及雙側股骨骨密度Fig.1 Postoperative density of lumbar spine and bilateral femurs

灌胃后，OVXDF組大鼠雙側股骨及腰椎骨密度較OVX組明顯升高，但仍低于SHAM組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),表明骨碎補灌胃后，可以提高去卵巢大鼠骨密度，防止骨質疏松的進一步發(fā)展,見圖2。

圖2 灌胃后大鼠腰椎及雙側股骨骨密度Fig.2 Density of lumbar spine and bilateral femurs after intragastric administration in rats

3.2 骨結構參數(shù)

OVX組大鼠脛骨干骺端骨結構參數(shù)BMD、BMC、BV/TV、Tb.Th、Tb.N較SHAM組明顯降低， Tb.sp、SMI較SHAM組明顯升高。灌胃后，即OVXDF組大鼠脛骨干骺端骨結構參數(shù)BMD、BMC、BV/TV、Tb.Th、Tb.N 指標明顯升高，Tb.sp、SMI明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義。表明經骨碎補灌胃后大鼠骨量、骨礦物質含量升高，骨小梁數(shù)量及厚度增加，骨小梁之間的髓腔平均寬度減少，說明骨碎補可以提高骨量，減少骨吸收，如圖3、4所示。

虛線范圍內為松質骨骨小梁區(qū)域 圖3 灌胃后大鼠脛骨近端Micro-CT掃描Fig.3 Micro-CT scan of proximal tibia of rats after intragastric administration

圖4 灌胃后大鼠骨結構參數(shù)Fig.4 Bone structure parameters of rats after intragastric administration

3.3 血清骨代謝指標檢測

三組大鼠血清骨代謝指標MMP-9、TRAP及CTX-1比較，結果為OVX大于OVXDF大于SHAM，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明去卵巢大鼠存在骨高吸收狀態(tài)，骨碎補灌胃后可有效抑制去卵巢大鼠的骨吸收，如圖5所示。

圖5 灌胃后三組大鼠血清骨代謝指標 Fig.5 Serum bone metabolism markers in the three groups after intragastric administration

3.4 骨組織切片觀察

灌胃后，SHAM組大鼠骨組織切片(圖6)顯示其骨皮質較厚，髓腔較小，骨小梁粗壯、飽滿、結構清晰，縱橫交錯呈網狀，排列整齊，骨組織之間存在少量脂肪顆粒且顆粒較小。OVX大鼠切片顯示其骨皮質變薄，髓腔寬大，骨小梁稀疏、纖細、數(shù)量減少，間距變寬，結構紊亂，骨小梁周圍可見脂肪顆粒增生，數(shù)量增多，顆粒較大。OVXDF組骨組織形態(tài)介于兩者之間。說明去卵巢大鼠骨量減少同時伴有髓腔內脂肪組織增生，經骨碎補灌胃后，骨量增加，脂肪組織形成減少。

藍色箭頭為脂肪細胞 圖6 灌胃后三組骨組織形態(tài)學觀察 Fig.6 Morphological observation of bone in the three groups after intragastric administration

4 結果與討論

(1)大鼠去卵巢后，脛骨干骺端出現(xiàn)總體骨量及骨礦物質減少，骨小梁變薄、稀疏。而灌胃12周后，骨碎補升高了OVXDF組大鼠的BV/TV、Tb.Th、Tb.N、BMD、BMC，降低其Tb.sp及SMI，表明骨碎補可以調高去卵巢大鼠骨密度、骨礦物質含量，增加骨小梁數(shù)量及厚度，減少骨小梁之間的髓腔平均寬度，對去卵巢骨質疏松大鼠具有骨保護作用。其作用機制可能與抑制骨吸收有關。

(2)與SHAM組相比，OVX組大鼠骨組織切片中骨小梁稀疏、纖細，數(shù)量減少，間距變寬，結構紊亂，髓腔內骨小梁周圍可見脂肪顆粒增生，數(shù)量增多，顆粒較大。而經骨碎補灌胃后，骨小梁密度增加，結構更加清晰，形態(tài)粗壯，同時髓腔內的脂肪顆粒組織數(shù)量減少，顆粒變小。與Micro-CT及DXA數(shù)據(jù)相比較后，也可以發(fā)現(xiàn)，OVX組大鼠在骨密度降低同時伴有脂肪組織的增生，而骨碎補可以有效增加骨密度，抑制因骨質疏松引起的骨小梁變化，減少脂肪細胞及組織的增生。表明骨碎補對去卵巢骨質疏松大鼠的骨保護作用可能與減少其脂肪組織的形成有關。

(3)OVX組大鼠MMP-9、CTX-1及TRAP血清含量大大增加，表明絕經后骨質疏松大鼠破骨細胞數(shù)量及活性增加，骨吸收增強。經灌胃后，OVXDF組大鼠MMP-9、CTX-1及TRAP血清含量大大降低，表明骨碎補灌胃可以降低去卵巢大鼠破骨細胞活性及數(shù)量，減少骨吸收，從而達到防治骨質疏松的作用。

(4)大鼠去卵巢后，不僅僅表現(xiàn)為骨量的降低，同時出現(xiàn)骨微細結構的變化，主要表現(xiàn)在骨小梁數(shù)量減少，厚度變薄，密度降低，板狀骨小梁減少，桿狀骨小梁相對增多，同時骨小梁間脂肪細胞增生。骨碎補灌胃后可以有效地對抗去卵巢大鼠的骨密度降低及骨微細結構的變化，其作用機制可能與其抑制骨髓脂肪細胞生成，抑制破骨細胞活性及數(shù)量有關聯(lián)。