高效液相色譜法測(cè)定6個(gè)不同產(chǎn)地的牡丹葉中丹皮酚和芍藥苷含量

孫晶, 魏永利，李克明，梁昆

(1. 新泰市中醫(yī)醫(yī)院，山東 新泰 271200； 2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014; 3.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南 250014; 4.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京 100102)

牡丹為芍藥科芍藥屬多年生落葉灌木，栽培品種以河南洛陽(yáng)、山東菏澤、甘肅等地為主[1]。牡丹干燥根皮作為傳統(tǒng)中藥丹皮入藥，始載于東漢 《神農(nóng)本草經(jīng)》，其味苦微寒，具有清熱涼血、活血化瘀的功效[2]，適用于熱入營(yíng)血、吐衄發(fā)斑、無(wú)汗骨蒸、痛經(jīng)閉經(jīng)、跌撲損傷、瘡癰腫毒等癥[3]。

現(xiàn)代藥理研究表明，牡丹具有降血糖、抗炎、鎮(zhèn)痛、抑菌、調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)、抗腫瘤、清除自由基、抗氧化等作用[4-6]。除根皮外，其葉、花瓣、花粉、種子及籽粕均可入藥[7]，目前對(duì)于牡丹的研究主要以牡丹皮、牡丹花為主，而對(duì)于牡丹葉的研究則較為少見(jiàn)。我們前期研究認(rèn)為牡丹葉對(duì)于原發(fā)性痛經(jīng)[8]、慢性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎[9-10]等疾病具有很好的療效。本研究通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定6個(gè)不同產(chǎn)地來(lái)源的牡丹葉中丹皮酚、芍藥苷的含量，以期對(duì)牡丹葉的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

Waters H-Class UPLC(美國(guó)沃特世公司)；KQE-400B型超聲清洗機(jī)(昆山超聲儀器有限公司)； Metter Toledo EL2401電子天平(瑞士梅特勒公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑

牡丹葉(產(chǎn)地分別為山東菏澤、安徽亳州、安徽銅陵、甘肅武威、四川墊江、山西運(yùn)城)；丹皮酚對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)B20266，純度98%以上)；芍藥苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)107D021，純度95%以上)；甲醇為色譜純；乙腈為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.1.1 丹皮酚測(cè)定色譜條件

色譜柱Waters Xbridge shield RP18 (5 μm, 4.6 mm×150.0 mm)；流動(dòng)相為甲醇-水(體積比45:55)，檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

2.1.2 芍藥苷測(cè)定色譜條件

色譜柱Waters Xbridge shield RP18 (5 μm, 4.6 mm×150.0 mm)；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液(體積比15:85)，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

2.2.1 丹皮酚對(duì)照品溶液的制備

精密稱取丹皮酚對(duì)照品8 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含有丹皮酚800 μg的對(duì)照品溶液。

2.2.2 芍藥苷對(duì)照品溶液的制備

精密稱取芍藥苷對(duì)照品20 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含有芍藥苷800 μg的對(duì)照品溶液。

2.3 樣品溶液的制備

2.3.1 測(cè)定丹皮酚的樣品溶液制備

取牡丹葉樣品，粉碎后，取約0.5 g，精密稱定后，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2 測(cè)定芍藥苷的樣品溶液制備

取牡丹葉樣品，粉碎后，取約0.1 g，精密稱定后，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察

分別配置濃度為12.5，25.0，50.0，200.0和400.0 μg/mL的丹皮酚對(duì)照品溶液，精密吸取10 μL注入液相色譜儀。以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到丹皮酚的回歸方程y=56 403x+84 446(R2=0.999 9)，結(jié)果表明丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)品在濃度12.5～400.0 μg/mL內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(圖1)。

分別配置濃度為50.0，100.0，200.0，400.0和800.0 μg/mL的芍藥苷對(duì)照品溶液，精密吸取10 μL注入液相色譜儀。以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到芍藥苷的回歸方程y= 6 805.6x-102 292，R2=0.999 5，結(jié)果表明芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品在濃度50.0～800.0 μg/mL內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(圖2)。

圖1 丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard curve of paeonol

圖2 芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 2 Standard curve of paeoniflorin

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

按照2.3.1的方法，取丹皮酚對(duì)照品溶液，進(jìn)樣量10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積；按照2.3.2的方法，取芍藥苷對(duì)照品溶液，進(jìn)樣量10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果丹皮酚、芍藥苷峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.62%、1.15%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取牡丹葉適量，按照2.3.1的方法，分別于0.0，1.0，2.0，4.0，6.0，12.0 h進(jìn)行進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積；取牡丹葉適量，按照2.3.2的方法，分別于0.0，0.5，1.0，2.0，18.0，24.0 h進(jìn)行進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果可知，丹皮酚的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.54%，芍藥苷的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.89%。表明供試品溶液在室溫下24 h穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取6份樣品，按照2.4、2.5的方法，進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果可知，丹皮酚的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.25%，芍藥苷的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.91%，總黃酮吸光度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.56%，總多糖吸光度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.56%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱定已知含量的樣品粉末0.5 g，共6份，分別加入適量丹皮酚對(duì)照品，按照既定方法制備供試品溶液，記錄峰面積，計(jì)算回收率。

精密稱定已知含量的樣品粉末0.1 g，共6份，分別加入適量芍藥苷對(duì)照品，按照既定方法制備供試品溶液，記錄峰面積，計(jì)算回收率。

結(jié)果可知，丹皮酚、芍藥苷的平均回收率分別為99.96%、101.66%，回收率相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.34%、2.01%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.9 樣品含量測(cè)定

采用 2.3的方法制備樣品溶液，采用2.1色譜條件分別進(jìn)樣分析，得出丹皮酚和芍藥苷的相應(yīng)峰面積，根據(jù)2.4方法中回歸方程算出各化合物的含量，平行 3次取平均值，對(duì)6個(gè)不同產(chǎn)地的牡丹葉進(jìn)行了含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1和圖3、圖4。

表1 6個(gè)不同產(chǎn)地牡丹葉中丹皮酚、芍藥苷的含量

圖3 丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)品和牡丹葉樣品色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of paeonol standard and Paeonia suffruticosa leaf sample

圖4 芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品和牡丹葉樣品色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of paeoniflorin standard and Paeonia suffruticosa leaf sample

3 討論與結(jié)論

本研究通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定6種牡丹葉中丹皮酚、芍藥苷的含量，關(guān)于色譜條件，參照《中國(guó)藥典》2015版一部[11]。在測(cè)定丹皮酚含量時(shí)確定了甲醇-水(體積比45:55)作為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL；在測(cè)定芍藥苷含量時(shí)確定了乙腈-0.1%磷酸水溶液(體積比15:85)作為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL。

供試品的制備方法直接影響含量測(cè)定的準(zhǔn)確性，因此本研究對(duì)提取溶劑進(jìn)行了篩選，根據(jù)《中國(guó)藥典》2015版一部，牡丹皮中丹皮酚的含量測(cè)定方法和白芍中芍藥苷中的測(cè)定方法，分別選擇甲醇和稀乙醇作為丹皮酚和芍藥苷測(cè)定的提取溶劑。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，目標(biāo)峰峰面積與濃度呈良好的正相關(guān)線性關(guān)系，實(shí)驗(yàn)的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和回收率的測(cè)定均符合實(shí)驗(yàn)要求。

經(jīng)測(cè)定，6個(gè)產(chǎn)地牡丹葉中均含有丹皮酚及芍藥苷成分，不同產(chǎn)地來(lái)源的牡丹葉化學(xué)成分含量有所差別。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可用于牡丹葉中丹皮酚及芍藥苷等化學(xué)成分含量的測(cè)定，為質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)及藥效的科學(xué)解釋提供了準(zhǔn)確、快速的定量分析方法，為合理的藥物來(lái)源選擇提供了證據(jù)支持，也為其質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。