基于網絡藥理學的五苓散多成分-多靶點-多通路作用機制研究

曹銘晨，于振英，辛兆洋，徐龍，楊智威 ，任煒，邢曉敏，荊凡波

(青島大學附屬醫院，山東 青島 266000)

中藥復方具有多成分、多靶點、多途徑協同作用的特點,采用傳統“一個藥物，一個靶標，一種疾病”的理念模式難以全面闡述其復雜的作用機制。系統生物學、網絡藥理學、計算機輔助藥物設計等新技術的發展，為從系統水平闡明中藥及復方的作用機制、篩選活性成分、經方優化和新復方配伍的研究提供了理論依據和技術支撐[1-2]。網絡藥理學是以系統生物學為基礎，整合各種藥物、生物學數據庫，利用生物信息學手段分析和構建藥物-基因-靶點蛋白-疾病的網絡預測模型，預測藥物作用靶點，并從生物網絡平衡的系統水平觀察藥物作用機制，具有整體性、系統性的特點，與中醫藥整體觀、辨證論治、組方配伍的原則以及中藥多成分、多靶點調控機體不謀而合[3]。

五苓散出自漢代張仲景《傷寒論》，由白術、澤瀉、豬苓、茯苓、桂枝組成，方中諸藥配伍，共奏淡滲利濕、健脾助運、溫陽化氣、解表散邪之功，主治太陽蓄水證(水飲內停)，由表證未解、陽氣被遏、膀胱氣化不利、脾不輸精所致。因五苓散利水、利尿作用顯著，不少學者將其視為中醫的“利尿劑”[4]。然而，五苓散的藥理作用具有綜合性、非單一性的特點，認為五苓散專治蓄水證或用于表證的思想是片面的[5]。五苓散的臨床應用廣泛，涉及水腫、泌尿系統、關節病、眩暈、頭痛、癲癇、心血管系統、消化系統等[4-6]。

現代藥理學已在細胞層面和基因轉錄水平上對五苓散開展相關研究，但動物實驗篩選的周期長、成本高且工作量大，其分子層面機制尚不完全明確。目前尚無應用網絡藥理學方法從系統層面探討五苓散分子作用機制的相關文獻，本研究系統納入五苓散的活性成分預測、靶點預測和藥物-靶點網絡分析，從分子水平預測并探討五苓散多成分、多靶點的整體調控作用，為深入開展五苓散的基礎實驗研究及臨床合理應用提供參考。

1 研究工具

基于中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)[7]、DrugBank數據庫[8]獲取五苓散主要成分信息，基于PharmMapper數據庫[9]、全球蛋白質資源(universal protein resource，UniProt)[10]、Pubchem數據庫[11]預測可能存在的相互關系、靶點和基因信息；Cytoscape 3.5.1軟件[12]構建化合物-靶點相互作用網絡；基于DAVID數據庫[13]、京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)[14]、STRING數據庫[15]、R語言包3.5.1(R version 3.5.1)[16]進行通路富集分析。

2 研究方法

2.1 中藥化學成分收集與篩選

TCMSP數據庫是整合藥物化學、藥物代謝動力學和藥物-靶點蛋白網絡-疾病網絡的數據平臺，通過數學和計算模型對中藥化學成分進行毒藥物動力學(ADME)的預測，其關鍵參數為口服生物利用度 (oral bioavailability, OB)、半衰期(half-life，HL)和藥物相似性評價(drug-likeness，DL)。一般認為OB大的化學成分口服生物利用度好，IDL≥0.15的分子類藥性較高。通過檢索TCMSP、Pubchem數據庫，結合文獻篩選五苓散中已知活性成分中滿足XOB≥20%、IDL≥0.18和THL≥4 h的化合物為候選活性成分。

2.2 分子反向對接技術預測五苓散活性成分的潛在靶點

PharmMapper是基于反向藥效團匹配法的化學小分子潛在靶點和生物活性預測的服務器。將五苓散中篩選得到的活性成分以成分名作為關鍵詞輸入Pubchem數據庫中進行檢索,查找并保存各活性成分的三維化學結構數據結構式為.sdf格式, 提交到PharmMapper進行靶點預測, 相關參數選擇: Generate Conformers=Yes；Maximum Generated Conformations=100；Select Targets Set=Human Protein Targets Only; Number of Reserved Matched Targets=100, 預測得到與各化合物相關的target name、gene、Uniprot ID、fit score等參數。剔除相同靶點后將靶點名輸入Uniprot數據庫中統一命名為基因名。

2.3 化合物-靶點網絡的構建

將候選活性成分、相關靶點信息導入Cytoscape軟件，構建化合物-靶點網絡，其中節點(node)代表化合物、基因、蛋白質等靶點，節點與節點之間的連接(edge)代表相互作用，節點度值(Degree)表示網絡中和節點連接的路線數。

2.4 PPI網絡的構建

STRING數據庫是儲存已知和預測的蛋白質之間直接、間接相互作用信息的數據庫，對每個蛋白相互作用程度都有一個P值，值高則蛋白相互作用的置信度高。五苓散活性成分的相關靶點基因上傳至在線STRING數據庫，獲取蛋白相互作用信息，選取打分值大于0.9的最高置信度的數據，導入Cytoscape軟件構建PPI網絡，探索五苓散靶點蛋白在系統水平上的相互作用。

2.5 GO富集分析

David數據庫整合多種數據庫信息，采用改進的Fisher精確檢驗算法對基因集進行富集分析，采用David v6.8數據庫對PPI網絡中的蛋白進行基因本體GO(gene ontology)富集分析，探索五苓散活性成分的靶點蛋白在基因功能中的作用，獲取分析結果的P值，應用R軟件繪制GO富集分析結果的條形圖。

2.6 KEGG通路富集分析

利用Cytoscape軟件對KEGG通路富集分析中的信號通路構建靶點-通路網絡，應用David V6.8數據庫對PPI網絡中的蛋白進行KEGG生物通路富集分析，探索五苓散活性成分的靶點蛋白在信號通路中的作用。將活性成分的相關靶點基因列表導入DAVID數據庫，勾選OFFICIAL_GENE_SYMBOL、Gene list、Submit list，選擇基因功能分類工具，修改背景為人類，選擇Pathway，篩選P<0.01的通路確定為可靠通路，結合KEGG數據庫進行通路注釋和分析。利用R語言對主要代謝通路、生物過程進行繪圖分析。

3 結果與分析

3.1 五苓散活性化合物的篩選

根據藥學參數篩選出五苓散中50種潛在的活性化合物，表1列出主要活性化合物的參數如分子量(molecular weight，M)、脂水分配系數(Lipid-water partition coefficient，ALogP)、生物利用度 (Oral bioavailability, OB)、腸上皮通透性(Caco-2)、血腦屏障(Blood brain barrier，BBB)、半衰期(Half-life，HL)和藥物相似性評價(drug-likeness，DL)。

表1 五苓散組分活性成分及其藥動學參數

續表1

3.2 五苓散化合物-靶點網絡的構建

將五苓散中活性成分看作整體，構建的化合物-靶點網絡中(圖1)共含459個節點( 50個化合物節點和409個靶點節點)，該網絡通過化合物-靶點的相互作用，揭示了五苓散的潛在相互作用關系。根據拓撲學性質分析網絡中度值較大的潛在關鍵靶點，五苓散化合物-靶點網絡平均度值為5.4，每個靶點平均度值為3.02，其中50個靶點能與大于等于20個化合物發生相互作用，證明了五苓散多成分與多靶點共同作用的特點。化合物-靶點網絡中度值≥20 的關鍵靶點包括RNA冷休克域結合蛋白E1(CSDE1)、磷酸核糖焦磷酸合成酶1(PRPS1)、17β-雌二醇脫氫酶IV(HSD17B4)、酪蛋白水解蛋白酶P(CLPP)、含酰基Coa結合結構域的蛋白7(ACBD7)、鋅-α2糖蛋白(AZGP1)、鈣調蛋白依賴的蛋白激酶IV(Camk4)、Glu/Asp豐富羧基端域Cbp/p300相互作用反式激活因子2(CITED2)、G蛋白信號調節因子6(RGS6)、轉錄起始因子TFIID亞基13(TAF13)等。其中，度值較高的CSDE1、PRPS1和HSD17B4分別能與46、44和42個化合物發生相互作用。

圖1 五苓散化合物-靶點網絡Fig.1 Compound-target network of Wulingsan

3.3 PPI相互作用網絡

基于蛋白質-蛋白質相互作用關系，構建了五苓散的在靶點的蛋白質-蛋白質相互作用網絡(圖2) 。PPI網絡包含155個節點和527條相互作用關系(連線)。根據網絡拓撲學性質，其中介數(betweenness centrality，BC)和度值大于均值(介數=0.0255，度值=6.8)的關鍵節點，包括CSDE1、CITED2、RANBP2、HSD17B4、TAF13、SOD2、ARHGAP11、ARHGEF12、CAMK4、TP53等，其中，度值最高的CSDE1能與45個蛋白發生相互作用，度值緊隨其后的CITED2和RANBP2分別能與42和39個蛋白發生相互作用。

圖2 PPI蛋白互作網絡圖Fig.2 Protein-protein interaction network of Wulingsan

3.4 GO功能富集分析

根據調整的P值(Padjust<0.005)列出前20條GO途徑(圖3)，說明五苓散在細胞組成相關條目主要涉及細胞溶質；生物過程相關條目主要涉及細胞對有機物質的反應、細胞對化學刺激的反應、上調代謝進程、含氮物質代謝、有機物循環代謝進程等方面；分子功能相關條目主要涉及催化活性、蛋白結合、有機物循環結合、小分子結合、離子結合及轉運活性等方面。

圖3 GO通路富集分析條形圖Fig.3 Bar graph of the GO pathway enrichment analysis

3.5 KEGG分析

KEGG通道分析主要涉及膀胱癌、前列腺癌、內分泌抵抗等途徑，通路富集基因ID見表2。根據調整的P值(Padjust<0.05)列出前10條通路(圖4)。

表2 KEGG通路富集分析靶點基因ID

圖4 KEGG通路富集分析點狀圖Fig.4 Dot plot of the KEGG pathway enrichment analysis

4 討論與結論

本研究應用網絡藥理學的方法確證了五苓散在人體水液代謝平衡中的調節作用。五苓散的活性成分通過影響細胞溶質、有機物質和刺激的反應、上調代謝、小分子物質、離子、蛋白的結合、轉運活性等途徑，調控人體內水液代謝及電解質的平衡。五苓散幾乎參與了水液代謝的全過程，其主病證也大多與水液代謝障礙有關，不局限在“利小便”。研究表明五苓散具有根據機體的狀態及時雙向調節水液代謝的作用，機體脫水狀態時呈抗利尿作用，而水腫狀態時則產生利尿作用，使水液輸布有道[17]。此外，KEGG富集分析提示膀胱癌、前列腺癌代謝通路與五苓散存在高度相關性，這兩個靶器官與人體的水液代謝密切相關，從另一方面反映了五苓散作為“中醫利尿劑”的高度選擇性。目前尚未有五苓散應用于泌尿系統腫瘤治療的研究，已有研究表明HSD17B4在前列腺癌、膀胱癌、肝癌組織和細胞中表達明顯增加，而五苓散與HSD17B4[18]存在高度親和性，HSD17B4通過氧化較高生物活性的雌二醇為低活性的雌酮，調節細胞內雌二醇的分泌量而影響腫瘤進展[19]。五苓散是否通過影響類固醇激素代謝過程從而影響泌尿系統腫瘤的發展進程，有待進一步研究。

痛風是人體嘌呤代謝紊亂和(或)血尿酸增高的疾病，其生化標志是高尿酸血癥，主要與機體長期嘌呤代謝紊亂、尿酸排泄障礙有關。中醫認為痛風性疾病屬“熱痹”、“痛痹”范疇，治療以“活血止痛、利水滲濕”為原則[20]。五苓散的病機為津液運化失常、水濕停聚，從其病機出發辨證運用治療痛風亦有顯效。本研究發現五苓散的活性成分與有機物質的代謝、循環及含氮物質的代謝途徑密切相關。研究表明磷酸核糖焦磷酸合成酶1(PRPS1)、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HPRT)及黃嘌呤氧化酶(XO)的基因多態性與嘌呤代謝異常密切相關，已有7個超活性的PRPS1單堿基突變被證明與尿酸生成增多和遺傳性痛風有關[21]。反向分子對接技術顯示五苓散活性成分與PRPS1存在高度親和性，提示其除通過促進水液排泄的作用加速尿酸排出外，還可能通過影響PRPS1的活性而發揮調節嘌呤代謝的作用。目前研究藥物抑制尿酸生成機制的靶點主要集中在XO，五苓散是否通過PRPS1靶點調控嘌呤代謝值得深入地研究。

類風濕性關節炎(RA)是一種以慢性、對稱性多滑膜關節炎和關節外病變為主的慢性自身免疫性疾病，中醫認為屬于“痹癥”范疇，其病因病機主要為濕濁留滯體內不化，循經竄絡，流注關節。RA治療應以化氣利水、健脾祛濕為原則，五苓散應用于RA治療取得良好效果。本文推測五苓散可能通過調節骨骼間隙液的狀態來影響流體剪切力(fluid shear stress，FSS)，從而在骨關節炎癥的治療上發揮重要作用。研究指出FSS是骨骼細胞在體內受到的主要受力形式，骨骼的應力通過骨骼組織間隙液流動，FSS作用于骨骼細胞，調控成骨細胞代謝，通過影響骨細胞的發育、增殖、分化等過程參與骨骼系統改建[22]。Lim等[23]研究發現，下頜骨間充質干細胞經過FSS作用后，骨唾液酸蛋白、Ⅰ型膠原、堿性磷酸酶和骨橋蛋白等表達增強，說明FSS促進間充質干細胞成骨相關基因的表達。FSS還通過細胞外信號調節激酶5途徑(ERK5)誘導環氧合酶2(COX-2)基因的表達，在骨關節炎癥進程中發揮重要作用[24]。此外，Ezrin、Radixin、Moesin蛋白影響成纖維樣滑膜細胞增殖而在RA進程中發揮重要作用，五苓散可能通過調控此通路影響RA進程[25]。

五苓散活性成分與心血管系統疾病的某些靶點如鋅-α2糖蛋白(Zinc-alpha-2-glycoprotein, AZGP1)、FSS等也存在高度親和性。研究表明FSS在動脈粥樣硬化的進展上發揮重要的作用，體外培養的血管內皮細胞在不同FSS作用下，其micro RNAs表達水平出現顯著差異，進而調控內皮細胞的生長周期和凋亡以及調節炎癥反應[26-27]。Kohlstedt等[28]發現FSS通過抑制內皮細胞AMPKα2途徑，上調p53的磷酸化和miR-143/145的表達，抑制內皮血管緊張素轉換酶表達；CHEN等[29]的研究表明FSS通過上調miR-101的表達，抑制雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的表達和內皮細胞增殖。此外，慢性心力衰竭患者尿液中的AZGP1水平升高[30]，五苓散是否能降低慢性心衰患者的AZGP1水平還有待研究。

此外，五苓散可能在神經系統調控方面發揮作用。《金匱要略》指出五苓散可用于癲眩之水氣病，凡辯證屬水氣濕濁泛濫所致癲癇、頭痛、眩暈病者，用本方可獲良效，有報道指出五苓散治療偏頭痛、頑固性偏頭痛、癲癇效果良好[4-6]。反向分子對接分析提示五苓散活性成分可能與CSDE1、CAMK4、AZGP1、ACBD7存在高度親和性，這些靶點與神經系統存在密不可分的聯系。如CSDE1可能是自閉癥的風險基因，通過影響STX1A來影響神經系統功能[31]；ACBD7是一種強效的厭食性神經肽，通過黑皮質素系統的瘦素來發揮厭食或產熱作用，以調節機體的能量代謝平衡[32]；CAMK4參與小鼠小腦組織的長時程抑制信號途徑，其在基因和蛋白水平的表達程度將影響小鼠小腦的學習和記憶功能。還有研究發現AZGP1可能是治療癲癇的潛在新靶點，通過抑制TGF-β介導的ERK磷酸化以及TNF-α和IL-6介導的神經炎癥從而抑制癲癇發作[33]，臨床辨證應用五苓散治療癲癇取得了較好效果，是否通過此靶點發揮抗癲癇作用尚不明確。五苓散在神經系統疾病方面的應用和研究并不多見，值得深入研究。

本研究基于網絡藥理學的方法對五苓散的活性成分和作用機制進行了探討，對可能的作用靶點和代謝通路展開分析，為深入研究五苓散的分子作用機制提供了新方向。