利用cDNA-AFLP技術(shù)分析炭疽菌危害誘導(dǎo)茶樹的差異表達(dá)基因

魏日鳳，賴建東,4，彭成彬，張承康，連玲麗，劉偉,*

利用cDNA-AFLP技術(shù)分析炭疽菌危害誘導(dǎo)茶樹的差異表達(dá)基因

魏日鳳1，賴建東1,4，彭成彬1，張承康2，連玲麗3*，劉偉1,2*

1. 福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；2. 寧德師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建 寧德 352100；3. 福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；4. 湖北科技學(xué)院，湖北 咸寧 437100

應(yīng)用cDNA-AFLP技術(shù)篩選炭疽菌（sp.1）危害誘導(dǎo)茶樹毛蟹品種（cv.）的差異表達(dá)基因，為探究茶樹抗炭疽菌的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。利用256對(duì)選擇性擴(kuò)增引物組合分析病菌接種后0?h和48?h的葉片cDNA，經(jīng)篩選、測(cè)序和BLAST比對(duì)獲得136條差異表達(dá)片段（TDFs）。同源基因功能分析結(jié)果表明，128條TDFs與Nr數(shù)據(jù)庫已有基因同源，其功能以脅迫響應(yīng)、生物調(diào)控與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)為主；其中51條TDFs與TPIA數(shù)據(jù)庫中冷害、干旱、鹽堿條件下的差異表達(dá)基因高度同源。進(jìn)一步對(duì)27條TDFs進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示，有24條TDFs的表達(dá)情況與cDNA-AFLP的結(jié)果一致，WRKY轉(zhuǎn)錄因子、乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子、過氧化物酶和超氧化物歧化酶等抗逆相關(guān)基因的表達(dá)顯著上調(diào)。本試驗(yàn)通過篩選獲得差異表達(dá)的抗逆相關(guān)基因，為后續(xù)的基因功能研究奠定基礎(chǔ)。

茶樹；炭疽菌；cDNA-AFLP；差異表達(dá)基因

由刺盤孢菌引起的茶炭疽病是危害茶葉生產(chǎn)的一種重要病害，對(duì)南方茶區(qū)尤其是高濕低洼茶園造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。梅雨和秋雨時(shí)節(jié)該病害的大面積蔓延，除了導(dǎo)致茶葉的大量減產(chǎn)，更影響茶葉品質(zhì)。選育和種植抗病品種是防治這類病害最經(jīng)濟(jì)、安全、有效的措施。但現(xiàn)有許多茶樹栽培品種對(duì)炭疽病菌高度感病[3]，抗病品種資源的缺乏加大了傳統(tǒng)育種的難度。近年來，結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)挖掘植物重要抗病基因，并利用分子標(biāo)記篩選技術(shù)選育抗病品種，已成為植物抗病研究的熱點(diǎn)[4]，也為茶樹病害控制提供了一條新的研究思路。因此，基于分子技術(shù)開展茶樹抗炭疽病的機(jī)制研究對(duì)茶樹抗病品種選育及茶葉食品安全具有重要意義。

目前，對(duì)茶樹響應(yīng)炭疽病菌侵染的抗病機(jī)制研究仍然較少。楊光道[5]從生理生化角度研究了安徽省油茶主栽品種對(duì)炭疽病的抗性機(jī)制，發(fā)現(xiàn)苯丙氨酸解氨酶（PAL）和過氧化物酶（POD）活性在不同品種中均明顯增強(qiáng)。王玉春[6]檢測(cè)感病和抗病品種接種炭疽菌后葉片內(nèi)活性氧（ROX）、過敏性壞死點(diǎn)（HR）、咖啡堿含量的變化，發(fā)現(xiàn)三者均在抗病品種的抗病過程中起重要作用；同時(shí)，其針對(duì)抗病差異表達(dá)基因的分析表明，植物激素和咖啡堿合成代謝與茶樹抗炭疽病有關(guān)。賴建東等[7]在前期研究中對(duì)炭疽病菌侵染后茶樹葉片的生理指標(biāo)及基因表達(dá)變化進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明超氧化物歧化酶（SOD）、POD和過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶活性及相關(guān)基因的表達(dá)均出現(xiàn)了上調(diào)的變化，暗示了自由基清除在茶樹抗病中扮演重要角色。盡管以往的研究已從生理、生化及分子的水平上對(duì)抗病機(jī)制進(jìn)行了較為深入的探討，也得到了一些很有意義的結(jié)論，但這些研究對(duì)茶樹炭疽病菌互作機(jī)制的解析仍不夠完善。因此，有必要結(jié)合其他分析技術(shù)從不同角度反映茶樹響應(yīng)炭疽病菌侵染的分子變化，為全面探明茶樹抗病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

cDNA-AFLP技術(shù)作為一種鑒定差異表達(dá)基因的有效工具，具有假陽性低、多態(tài)性高、不依賴于基因組數(shù)據(jù)等優(yōu)點(diǎn)，已被成功用于多種植物抗病差異基因的篩選，如小麥抗條銹病[8]、辣椒抗疫霉[9]、菜心抗小菜蛾[10]等。該技術(shù)在茶樹相關(guān)研究領(lǐng)域也有所應(yīng)用，曹士先等[11]率先利用cDNA-AFLP篩選茶樹葉片被茶尺蠖取食后的差異表達(dá)片段，從中鑒定得到4.5%直接與抗病防御相關(guān)的序列，證實(shí)了cDNA-AFLP技術(shù)在茶樹抗病機(jī)制研究中的可行性。因此，本研究將基于該技術(shù)分析炭疽病菌侵染前后茶樹葉片的差異表達(dá)基因，以期從分子水平探討茶樹響應(yīng)炭疽病菌脅迫的分子防御機(jī)制，為后續(xù)的抗病基因功能研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試茶葉為福建農(nóng)林大學(xué)南區(qū)茶山試驗(yàn)基地毛蟹茶葉品種；供試炭疽病原菌強(qiáng)致病菌株ZRG由福建農(nóng)林大學(xué)茶葉科技與經(jīng)濟(jì)研究所提供。

1.2 接種取樣與RNA提取

采用張新春等[12]的炭疽菌接種方法，選取露天茶園生長兩年以上的健康茶苗，將PDA平板上培養(yǎng)7?d的炭疽菌菌餅以菌面朝下的方式接種于茶苗的第二三葉，按采樣時(shí)間點(diǎn)分別選取8株，每株選取5個(gè)葉片進(jìn)行接種，接種期間茶樹生長溫度為20~28℃，接種后0?h和48?h摘取處理過的葉片樣品，并置于液氮中速凍，于–80℃保存?zhèn)溆?。使用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取葉片總RNA，不同時(shí)間點(diǎn)的樣品RNA分別提取3次，進(jìn)行混樣以減少誤差。用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)提取效果。

1.3 cDNA-AFLP分析

取不同樣品的等量RNA，參照cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）說明書合成cDNA。AFLP分析參照Bachem等[13]的方法對(duì)cDNA產(chǎn)物進(jìn)行酶切、預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增。所用引物和接頭參照郭朋[14]的方法，由16條EcoR I（E11—E14、E21—E24、E31—E34和E41—E44）和16條Mse I（M11—M14、M21—M24、M31—M34和M41—M44）引物組合，共256對(duì)引物用于選擇性擴(kuò)增。取7?μL選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物于95℃變性處理5?min后，加至6%聚丙烯酰胺變性凝膠上，以50?W恒功率電泳約2~3?h，直至藍(lán)色指示帶接近膠底時(shí)停止。參照文獻(xiàn)[14]的方法對(duì)凝膠進(jìn)行銀染，染色約30?min，顯影晾干后，于凝膠成像系統(tǒng)下觀察，結(jié)合成像系統(tǒng)的條帶灰度數(shù)值，將有明顯差異的條帶選出，用于后續(xù)的差異片段分析。

1.4 基因差異片段回收、克隆及測(cè)序分析

基因差異片段割下后，置于30?μL ddH2O中煮沸10?min，12?000?r·min-1離心10?min，取上清液作為第二次PCR擴(kuò)增的模板。吸取8?μL回收的cDNA模板，加入2?μL EXX引物（10?pmol·μL-1）、2.5?μL MXX引物（10?pmol·μL-1）、0.5?μL Taq酶（5?U·μL-1）、2.5?μL Taq Buffer、2?μL dNTP（2.5?mmol·L-1）和7.5?μL ddH2O，混勻后，置于伯樂T100 PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：94℃ 3?min；94℃ 30?s，55℃ 45?s，72℃ 2?min，40個(gè)循環(huán)；72℃ 7?min最終延伸。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖檢測(cè)后，用瓊脂糖膠回收試劑盒（天根生化科技有限公司）回收；連接pMD 18-T Vector（TaKaRa）轉(zhuǎn)化，選取陽性質(zhì)粒送由鉑尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫的BLAST比對(duì)工具確定相似序列，并結(jié)合TPIA數(shù)據(jù)庫（Tea Plant Information Archive，http://tpia.teaplant. org/ index.html）表達(dá)譜數(shù)據(jù)[15]計(jì)算這些茶樹同源序列在其他逆境條件下的差異表達(dá)倍數(shù)，取logFC≥1的差異基因用于了解同源序列的表達(dá)情況。

1.5 差異基因的qRT-PCR驗(yàn)證

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA提取及cDNA合成

對(duì)提取的總RNA進(jìn)行電泳分析，由圖1-A可以看出，總RNA樣品中有兩條清晰的條帶，分別為28?S和18?S條帶。經(jīng)核酸定量儀檢測(cè)后得到RNA的A260/A280和A260/A230數(shù)值均在2.1左右，表明其質(zhì)量和純度較好。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA為300~2?000?bp的彌散條帶（圖1-B），說明cDNA質(zhì)量良好，適合用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 cDNA-AFLP分析

通過對(duì)cDNA進(jìn)行AFLP分析，獲得的預(yù)擴(kuò)增片段在250~2?000?bp之間（圖2-A），且彌散均勻，適合用于后續(xù)的選擇性擴(kuò)增。以16條EcoR I和16條Mse I引物組合，共256對(duì)引物組合對(duì)接種0?h和接種48?h的茶樹葉片樣本的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。以E14和M組合的16對(duì)引物擴(kuò)增結(jié)果為例（圖2-B和圖2-C），可知擴(kuò)增產(chǎn)物具有良好的多態(tài)性。

表1 熒光定量PCR所用引物

圖1 不同接種時(shí)間樣品的RNA和cDNA電泳圖

采用6%聚丙烯酰氨凝膠電泳分離選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物，每對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物大致包括50個(gè)條帶，片段大小在100~1?000?bp。不同引物的擴(kuò)增結(jié)果總體上較為一致，具有良好的平行性，適合用于樣品間的比較。以E14和M組合的16對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物為例（圖3），兩個(gè)處理時(shí)間段（0?h和48?h）的樣品擴(kuò)增產(chǎn)物中的多數(shù)條帶的亮度相近，部分條帶的亮度差別明顯（如圖3矩形框所示），表明炭疽病菌侵染引起了茶樹葉片基因表達(dá)量的變化。將這些差異條帶切取回收，共獲得197條差異條帶，其中上調(diào)表達(dá)148條，下調(diào)表達(dá)49條。

注：M：Marker。（A）預(yù)擴(kuò)增電泳結(jié)果，（B）接種后0?h的選擇性擴(kuò)增電泳結(jié)果，（C）接種后48?h的選擇性擴(kuò)增電泳結(jié)果

圖3 E14和M組合的16對(duì)引物擴(kuò)增聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果

2.3 差異條帶的序列分析

對(duì)選取的197條差異條帶（TDFs）進(jìn)行克隆測(cè)序和BLAST比對(duì)分析，除去比對(duì)結(jié)果中E值小于10-6的條帶和重復(fù)條帶，得到136條TDFs，其中100條表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)（Up-TDFs），分別將其命名為U1—U100；36條表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)（Down-TDFs），分別命名為D1—D36。

通過編碼區(qū)注釋和同源基因功能分析，去除8條僅含UTR區(qū)域的序列，將剩余的128條TDFs分為10類，列于表2。這些TDFs同源基因的功能涉及脅迫響應(yīng)、生物調(diào)控、碳水化合物和能量代謝、蛋白質(zhì)代謝、核酸代謝等，其中以脅迫響應(yīng)、生物調(diào)控與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因最多，分別占總數(shù)的25.0%和19.5%。與此同時(shí)，絕大多數(shù)功能類別的上調(diào)TDFs在數(shù)量上明顯多于下調(diào)TDFs，如脅迫響應(yīng)、蛋白代謝等，表明炭疽菌危害對(duì)茶樹組織中這些功能類別的基因調(diào)控以激活為主；某些功能類別如糖類與能量代謝的情況則相反，表明病菌危害可能抑制了相關(guān)的代謝過程。

表2 TDFs的同源性比對(duì)分析及功能分類

注：*表達(dá)譜數(shù)據(jù)顯示的是TIPA數(shù)據(jù)庫不同逆境條件下基因上調(diào)或下調(diào)的情況，其中drought、cold、salt和MeJA分別代表干旱、冷害、鹽堿和茉莉酸甲脂等誘導(dǎo)條件，括號(hào)內(nèi)的數(shù)字代表上調(diào)或下調(diào)的logFC倍數(shù)值，正值代表上調(diào)，負(fù)值代表下調(diào)

Note: The expression profile exhibited the expression levels of differential expressed genes under different conditions compared with normal condition based on data in TIPA database. Drought, cold, salt and MeJA represent 4 different conditions. The figures between brackets represent logFC values, and positive and negative values represent up and down-regulated

續(xù)表2

續(xù)表2

續(xù)表2

將差異表達(dá)TDFs與茶樹信息檢索TIPA數(shù)據(jù)庫的基因進(jìn)行相似性比對(duì)，結(jié)果表明（表2），110條TDFs與茶樹基因組的序列具有較高的相似性（E值≤10-3），其中51條TDFs的相似基因序列在鹽堿、干旱、冷害等逆境脅迫或茉莉酸甲脂誘導(dǎo)條件下出現(xiàn)表達(dá)量的顯著變化，表明這些TDFs可能在茶樹對(duì)抗生物脅迫和非生物脅迫中起重要作用。

2.4 部分差異條帶qRT-PCR驗(yàn)證分析

隨機(jī)選取27條TDFs進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示24條TDFs在病菌接種后48?h的表達(dá)情況與cDNA-AFLP圖譜的結(jié)果一致，另外3條TDFs的表達(dá)情況不一致（U5、U13和U67），一致率為88.9%?？梢奵DNA-AFLP獲取的基因表達(dá)結(jié)果較為可靠。

在qRT-PCR驗(yàn)證為上調(diào)表達(dá)TDFs中，U20、U25、U31、U38、U46、U67、U70、U75、U79、U80、U81、U84等12條TDFs的相對(duì)表達(dá)量值幾乎都處于0~10之間，上調(diào)幅度相對(duì)較小（圖4-A）。其中，多數(shù)TDFs的相對(duì)表達(dá)量在病菌接種后24?h達(dá)到最大值，而U25（編碼超氧化物歧化酶）和U81（編碼水通道蛋白）的相對(duì)表達(dá)量在病菌接種后48?h達(dá)到最大值，表明兩者可能在茶樹抗病中發(fā)揮更持久的作用。結(jié)合表2中這些TDFs的茶樹同源基因在非生物逆境下的表達(dá)情況來看，U46（編碼漆酶）的同源基因TEA027461.1在鹽堿、干旱和冷害條件下均上調(diào)表達(dá)，表明其可能是生物與非生物脅迫下茶樹通用的抗性基因，而U20（編碼G-box結(jié)合因子）的同源基因TEA013552.1在干旱和冷害條件下，及U25（編碼超氧化物歧化酶）的同源基因TEA004714.1在干旱條件下卻是下調(diào)表達(dá)，與本試驗(yàn)的結(jié)果相反，說明它們有可能在生物與非生物脅迫情況下發(fā)揮不同功能。

在qRT-PCR驗(yàn)證為上調(diào)表達(dá)TDFs中，U2、U26、U43、U56、U65、U68、U77和U95這8條TDFs的相對(duì)表達(dá)量最大值均高于10，上調(diào)幅度較大（如圖4-B所示）。其中，U65（編碼乙烯反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子）、U68（編碼過氧化物酶）、U77（編碼WRKY轉(zhuǎn)錄因子）和U95（超氧化物歧化酶）表達(dá)上調(diào)幅度顯著，它們分別在病菌接種后24?h時(shí)上調(diào)56.3倍、81.5倍、212.8倍和17.7倍。結(jié)合表2的茶樹同源基因表達(dá)數(shù)據(jù)可知，U43（編碼受體蛋白激酶）、U56（編碼WRKY轉(zhuǎn)錄因子）、U65、U68和U77的同源基因（TEA024197.1、TEA011154.1、TEA031293.1、TEA028180.1和TEA005142.1）在冷害脅迫下均為上調(diào)表達(dá)，表明這些TDFs可能是茶樹病害和冷害脅迫響應(yīng)中均起關(guān)鍵作用。

在qRT-PCR驗(yàn)證為下調(diào)表達(dá)的7條TDFs（圖4-C）中，U5（編碼假定耐鹽性蛋白）和D25（編碼脫水應(yīng)答蛋白）的下調(diào)幅度最大，分別在病菌接種后24?h時(shí)下調(diào)6.3倍和病菌接種后48?h時(shí)下調(diào)12.4倍，表明兩者的表達(dá)均受到明顯的抑制。從7條TDFs的同源基因來看，D25、D11和D23的茶樹同源基因（TEA032499.1、TEA021973.1和TEA026009.1）在冷害脅迫下也表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)；D25和U5的同源基因（TEA032499.1和TEA007942.1）在干旱脅迫時(shí)下調(diào)表達(dá)。

注：（A）表達(dá)量上調(diào)幅度較小的TDFs，（B）表達(dá)量上調(diào)幅度較大的TDFs，（C）表達(dá)量下調(diào)的TDFs

3 討論

從轉(zhuǎn)錄組水平分析差異表達(dá)基因的研究技術(shù)很多，包括消減雜交、mRNA差異顯示PCR、基因芯片技術(shù)、cDNA-AFLP、基因表達(dá)系列分析（SAGE）及基于新一代測(cè)序技術(shù)的RNA-Seq技術(shù)等。其中cDNA-AFLP、芯片技術(shù)、SAGE和RNA-Seq技術(shù)均可對(duì)生物轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行大規(guī)模的系統(tǒng)分析。相比之下，cDNA-AFLP出現(xiàn)較早，具有操作簡單、不依賴于特殊儀器、實(shí)驗(yàn)成本低、靈敏度較高、特異性好等特點(diǎn)[17]，被廣泛應(yīng)用于真核生物的特異表達(dá)基因分離研究中[18]；而后續(xù)出現(xiàn)的芯片技術(shù)和RNA-Seq技術(shù)在覆蓋度、靈敏度和精確性等方面明顯優(yōu)于cDNA-AFLP技術(shù)，它們?cè)诓町惢蜓芯恐邪l(fā)揮著越來越重要的作用。然而，芯片技術(shù)和RNA-Seq技術(shù)同樣存在一些問題，如較高的假陽性、數(shù)據(jù)量大及非模式物種注釋信息有限影響數(shù)據(jù)有效分析、實(shí)驗(yàn)費(fèi)用昂貴等[19]。因此，本試驗(yàn)在綜合考慮實(shí)驗(yàn)成本、茶樹基因組信息較少等具體情況的基礎(chǔ)上，選擇cDNA-AFLP技術(shù)挖掘炭疽菌脅迫下茶樹的差異表達(dá)基因。在具體實(shí)施過程中，經(jīng)過多次擴(kuò)增篩選，獲得穩(wěn)定性較好的差異表達(dá)基因片段用于測(cè)序分析。從分析結(jié)果來看，差異表達(dá)基因涉及8類主要的生物過程，其中脅迫響應(yīng)、生物調(diào)控和信號(hào)傳導(dǎo)、蛋白代謝等生物過程的上調(diào)表達(dá)基因最多，表明炭疽菌危害激活了茶樹組織中防御相關(guān)的代謝過程。這與Wang等[20]利用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)挖掘果生炭疽菌（）危害誘導(dǎo)茶樹的差異基因主要富集于糖類代謝、植物激素、活性氧反應(yīng)、生物刺激和信號(hào)傳導(dǎo)等生物過程的試驗(yàn)結(jié)果較為一致。

MAPK級(jí)聯(lián)途徑作為重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與植物的抗病反應(yīng)。在Wang等[20]的研究中發(fā)現(xiàn)了7個(gè)MAPK基因受果生炭疽菌誘導(dǎo)，說明MAPK在茶樹對(duì)抗炭疽菌侵染的過程中起重要作用。在本試驗(yàn)的脅迫響應(yīng)相關(guān)TDFs中也存在不少表達(dá)量上調(diào)的MAPK基因片段，如非活性受體激酶（U18）、類受體蛋白激酶（U19）、受體蛋白激酶TMK1（U43）和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶類BLUS1（U79）等。其中，U43基因片段表達(dá)量的上調(diào)幅度最大，在病菌侵染后24?h上調(diào)了11.4倍。對(duì)U43的同源基因TEA024197.1的表達(dá)情況進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)其在冷害和干旱條件下分別呈現(xiàn)上調(diào)和下調(diào)兩種不同的表達(dá)模式，推測(cè)U43可能在茶樹對(duì)抗生物與非生物脅迫中發(fā)揮多向調(diào)節(jié)作用。

以往的研究表明，茶樹受輪斑病菌和果生炭疽病菌侵染時(shí)，與過敏性反應(yīng)和活性氧產(chǎn)生有關(guān)的基因呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)[20-21]。在本試驗(yàn)的脅迫響應(yīng)類TDFs中也出現(xiàn)了編碼熱激蛋白（U55和U74）、過氧化物酶類和超氧化物歧化酶的相關(guān)基因片段。不同的是，前人的研究報(bào)道中與活性氧產(chǎn)生有關(guān)的基因主要是過氧化氫酶[20]和過氧化物酶[21]基因，而本試驗(yàn)中檢測(cè)到的則是過氧化物酶（U68）、谷胱甘肽過氧化物酶（U27）、抗壞血酸鹽過氧化物酶（U85）及超氧化物歧化酶（U25和U95）的基因。這種差別是否與不同試驗(yàn)選擇的病菌菌株、寄主品種不同有關(guān)，有待進(jìn)一步探討。

研究報(bào)道，ERF、MYB、bHLH和WRKY等抗逆相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在茶樹響應(yīng)低溫和茶尺蠖脅迫中發(fā)揮著重要作用[22-23]。在本試驗(yàn)的生物調(diào)控和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)類TDFs中，編碼抗逆相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的基因均上調(diào)表達(dá)，其中，轉(zhuǎn)錄因子WRKY（U56、U77）和ERF（U65）基因的表達(dá)量上調(diào)幅度顯著，表明相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子參與了茶樹響應(yīng)炭疽菌脅迫的生物調(diào)控。在后續(xù)的分析中，我們將基因片段U56和U77分別與擬南芥WRKY基因進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)U56與AtWRKY40、AtWRKY18和AtWRKY60聚在同一分支，而U77則與AtWRKY6、AtWRKY31和AtWRKY42聚在同一分支內(nèi)。研究證實(shí)AtWRKY40、AtWRKY18和AtWRKY60協(xié)同參與擬南芥對(duì)丁香假單胞菌和灰霉病菌的防御響應(yīng)調(diào)控[24]；而AtWRKY6在擬南芥衰老調(diào)控及抗病防御響應(yīng)中起關(guān)鍵作用[25]。因此，U56和U77基因片段對(duì)應(yīng)的WRKY基因在茶樹抗炭疽病中的調(diào)控功能值得進(jìn)一步研究。

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陳宗懋院士團(tuán)隊(duì)科研成果榮獲國家科學(xué)技術(shù)進(jìn)步獎(jiǎng)二等獎(jiǎng)

2020年1月10日，2019年度國家科學(xué)技術(shù)獎(jiǎng)勵(lì)大會(huì)在人民大會(huì)堂隆重舉行，由《茶葉科學(xué)》編輯委員會(huì)主任主持完成的研究成果——

陳院士科研團(tuán)隊(duì)在國際上首次提出以茶湯中的殘留量作為制定茶葉中MRLs（最大殘留限量）的原則，并被國際食品法典農(nóng)藥殘留委員會(huì)、歐洲食品安全局等國際官方機(jī)構(gòu)認(rèn)可，重構(gòu)了茶葉中MRLs制訂的國際規(guī)范。依據(jù)該原則，制修訂了6項(xiàng)國際標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)現(xiàn)了我國制定農(nóng)產(chǎn)品國際MRLs標(biāo)準(zhǔn)零的突破，避免了在歐盟和美國市場20%~30%的茶葉貿(mào)易損失。

項(xiàng)目成果在全球得到應(yīng)用，提升了我國標(biāo)準(zhǔn)制定的國際話語權(quán)，推動(dòng)了我國茶產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展的科技進(jìn)步。MRLs制定規(guī)范已應(yīng)用于國際權(quán)威制標(biāo)機(jī)構(gòu)，制修訂的標(biāo)準(zhǔn)被印度、斯里蘭卡、肯尼亞等產(chǎn)茶國應(yīng)用。茶園農(nóng)藥合理選用使用、污染物控制技術(shù)已在我國全國18個(gè)產(chǎn)茶省推廣應(yīng)用，近3年累計(jì)推廣超2712萬畝，為我國茶葉質(zhì)量合格率實(shí)現(xiàn)從80年代的60%到2018年97.2%的跨越式提升提供了重要保障。

cDNA-AFLP Reveals Differential Gene Expression Profiles of Tea Plant (cv.) Induced bysp.1 Infection

WEI Rifeng1, LAI Jiandong1,4, PENG Chengbin1, ZHANG Chengkang2, LIAN Lingli3*, LIU Wei1,2*

1. College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China；2. Ningde Normal University, Ningde 352100, China; 3. College of Life Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 4. Hubei University of Science and Technology, Xianning 437100, China

Differentially expressed genes related tocv.againstsp.1 infection were screened by cDNA-AFLP (cDNA-amplified fragment length polymorphism) to provide reference for further illustrating the molecular mechanism underlying tea resistance to anthracnose. A total of 256 pairs of selective primers were applied to amplify the cDNA of leaves collected at 0?h and 48?h afterinfection, and 136 differentially expressed transcript-derived fragments (TDFs) were obtained via screening, sequencing and BLAST analysis. The analysis of the homologous genes revealed that 128 TDFs were homologous with the known genes in Nr database. Most of them were related to stress responses, biological regulation and signal transduction, and 51 TDFs were highly homologous to differential expressed genes of tea plant under cold, drought or salt conditions in TPIA database. Further qRT-PCR analysis of 27 TDFs showed that the expression profiles of 24 TDFs were consistent with those of cDNA-AFLP results, among which several resistance-related genes including WRKY transcription factor, ethylene-responsive transcription factor, peroxidase and superoxide dismutase were significantly up-regulated. The differential expressed genes found in this study would lay a foundation for further analysis of their functions.

sp.1, cDNA-AFLP, differential expression genes

S571.1；S435.711

A

1000-369X(2020)01-026-13

2019-04-02

2019-06-04

福建省“2011協(xié)同創(chuàng)新中心”中國烏龍茶產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心專項(xiàng)（閩教科[2015]75號(hào)）、福建省科技廳高校產(chǎn)學(xué)項(xiàng)目（2016N5010）、寧德師范學(xué)院科研發(fā)展資金項(xiàng)目（2016FZ30）、寧德師范學(xué)院協(xié)同創(chuàng)新中心資金項(xiàng)目（2017Z02）

魏日鳳，女，實(shí)驗(yàn)師，主要從事茶葉品質(zhì)與提升方面的研究。

lianll2002@163.com，liuwei0591@126.com