基于MS2噬菌體病毒樣顆粒的RT-PCR檢測豬流行性腹瀉病毒質控品的制備

王國強，馬紅芳，曾華輝，賈 媛，蘇運芳，毛夢迪，劉保光，尚立芝*，張振強*

(1.河南中醫藥大學中醫藥科學院，河南 鄭州 450046；2.河南省農業科學院，河南 鄭州 450002；3.河南中醫藥大學藥學院，河南 鄭州 450046；4.河南中醫藥大學基礎醫學院，河南 鄭州 450046)

【研究意義】豬流行性腹瀉(Porcine Epidemic Diarrhea，PED)，由豬流行性腹瀉病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV)引起仔豬和育肥豬的一種以嘔吐和水樣腹瀉為特征的高度接觸性腸道傳染病，其可感染各年齡段的豬，導致較高的發病率和死亡率，3 日齡以內的哺乳仔豬感染后死亡率最高可達100 %，臨床變化和癥狀與豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible Gastroenteritis Virus，TGEV)、豬血凝性腦脊髓炎病毒(Porcine hemmagglutinatipg Encephalomyelitis Virus，PHEV) 及豬丁型冠狀病毒(Porcine Deltacorona Virus，PDCo V)極為相似[1]。該病于1971年在英格蘭首次被發現和報道，在比利時流行期間被確認其病原為PEDV[2-4]。PEDV屬于尼多病毒目(Nidovirales)冠狀病毒科(Coronaviridae)冠狀病毒屬(Coronavirus)的Ⅰ型成員，其基因組為約28 kb大小的單鏈正義RNA，可編碼4個結構蛋白(S，E，M和N)和非結構蛋白(1a，1ab和ORF3)[5]。從2010年下半年開始，我國全國范圍內爆發PEDV，給我國養豬業造成了嚴重的經濟損失。在形態學、臨床變化和癥狀上，PEDV和TGEV、PHEV以及PDCo V極為相似，又很難做到鑒別區分。因此，實驗室快速、準確診斷PEDV對防控尤為重要，逆轉錄-聚合酶鏈反應(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)可以用來檢測組織和糞便的病料，其便捷、快速、準確，靈敏性高、特異性強、重復性好等特點，成為PEDV檢測的首選。【前人研究進展】自1990年代初以來，聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction ，PCR)被廣泛用作診斷工具，改變了微生物診斷方法，尤其是RT-PCR的使用徹底改變了RNA病毒的診斷檢測方法，可對各種樣品中的RNA進行快速，特異和靈敏的檢測。隨著RT-PCR分子診斷技術的迅猛發展，擁有出色的質量控制或標準對于確保精確和排除不正確的結果顯得尤其重要，對具有特異性強、穩定性好、以及可以全程監控整個檢測過程的質控品的需求日益增長，要求越來越高。相較于僅感染人或者人畜共患的病毒核酸標準物質，僅感染動物的病毒類核酸標準物質研究明顯滯后[6]。用來作為RNA病毒檢測的質控品目前主要有三類，一是全病毒顆粒(活病毒、滅活病毒或陽性動物病料血清或組織)，其雖可以全程監控病毒核酸裂解、提取和擴增檢測的全過程，但成本高，稀缺陽性材料難以大量獲取，存在生物安全等問題[7]；二是裸露的RNA，其制備簡單，可以精確定值，安全性好，但是環境中到處都是RNase，極易降解；三是包封目標RNA的假病毒顆粒，其在形態和結構上與天然病毒類似，但不具有感染性，高度穩定，可實現RNA病毒核酸檢測的全程監控，是一種理想的質控品[8]。MS2噬菌體具有在體外利用自身基因組中成熟酶蛋白基因(A)、衣殼蛋白基因(CP)和包裝位點基因(PAC)，將插入其下游的外源RNA 的cDNA序列組裝形成病毒樣顆粒(Virus-like Particle, VLPs)，也被稱為裝甲RNA(Armored RNA)[9-10]。通過基因工程手段構建含MS2外殼蛋白基因、PAC位點基因以及外源待測核酸序列的原核表達載體，很容易在大腸桿菌中大量表達，在體外形成包封待測RNA的VLPs作為質控品。【本研究切入點】本研究選取PEDV基因組中保守的N蛋白基因(155 bp)作為靶檢測序列，采用分子克隆方法將該保守序列插入原核載體pET28a/CP(前期構建，包含MS2噬菌體外殼蛋白CP基因和PAC位點基因)，構建重組質粒pET28a/CP/PEDV，重組質粒在大腸桿菌誘導表達，純化，得到了CP 蛋白，其經過透射電鏡進行物理表征，顯示在體外自組裝形成了VLPs。純化的VLPs用核酸酶充分消化殘留的DNA和RNA后，提取RNA，通過熒光定量PCR檢測，證明VLPs包封了外源的PEDV靶序列，形成了盔甲RNA?？識NA耐RNase，具有良好的穩定性?！緮M解決的關鍵問題】制備的盔甲RNA可以作為PEDV RT-PCR檢測的質控品，其安全無污染，可以做到從核酸提取到擴增檢測的全程監控，為PEDV的準確快速診斷和防控提供支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株、重組質粒和主要試劑 克隆菌株DH5α，表達菌株BL(DE3)，重組質粒pET28a(+)/CP(包含噬菌體MS2衣殼蛋白CP基因和PAC位點基因)為本實驗室前期構建和保存；限制性內切酶BamH I-HF和HindΙΙΙ-HF、T4 DNA連接酶購自NEB(北京)，Protein Marker購自北京索萊寶科技有限公司；RNAiso Plus核酸提取試劑、PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time)反轉錄試劑、Probe qPCR Mix熒光探針PCR檢測試劑購自寶日醫生物技術(北京)有限公司；Benzonase核酸酶購自Sigma公司；氯仿，異丙醇等其它化學試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 引物 根據NCBI上PEDV/MEX/MICH/01/2013株(GenBank:MH006957.1)，選取N蛋白基因保守區序列，通過引物設計軟件Primer Premier 5和https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/設計引物和探針序列，探針5’用熒光報告基團FAM修飾，3’用淬滅基團BHQ1修飾，上游和下游引物分別加上BamH I和HindΙΙΙ酶切位點。引物和探針序列見表1，引物、探針和pUC57載體(攜帶有PEDV N蛋白基因中155 bp靶序列)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成和構建。

表1 RT-PCR中用到的引物和探針序列

1.2 試驗方法

1.2.1 重組載體構建 以pUC57為模板，PEDV-F和PEDV-R為引物，擴增PEDV N蛋白基因靶序列。用BamHⅠ和HindΙΙΙ 分別雙酶切質粒pET28a(+)/CP(攜帶有MS2噬菌體外殼蛋白CP基因和PAC位點基因)和PCR擴增的N蛋白基因靶序列，回收、連接，轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中。提取質粒，通過雙酶切和測序進行鑒定，結果正確的重組質粒命為pET28a(+)/CP-PEDV(表1)。

1.2.2 重組蛋白的表達與純化 測序正確的重組質粒pET28a(+)/CP-PEDV轉化大腸桿菌表達菌株BL(DE3)感受態細胞，37 ℃培養至OD600 nm值為0.5～0.7，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度0.1 mM，18 ℃振蕩誘導表達20 h。用0.01M PBS緩沖液重懸菌體，超聲破碎，離心收集上清。上清加入30 %的飽和硫酸銨，4 ℃攪拌30 min，離心收集沉淀，PBS重懸沉淀后用2 L PBS緩沖液攪拌透析除去硫酸銨。透析后樣品過濾后用Sephacryl s-1000凝膠過濾層析柱純化。

1.2.3 純化蛋白的物理表征 硫酸銨沉淀和凝膠過濾層析純化的目的蛋白，在2 %磷鎢酸復染，100 kV 加速電壓條件下，通過JEM-1400(日本)透射電子顯微鏡，觀察顆粒粒徑和均一度。

1.2.4 病毒樣顆粒核酸酶消化和殘余核酸檢測 0.01M PB緩沖液透析凝膠過濾層析純化的病毒樣顆粒，取1 mL透析后得病毒樣顆粒加入終濃度為2 mM的Mg2+，同時加入300 U的Benzonase全能核酸酶，在37 ℃條件下消化8 h。取消化后的病毒樣顆粒100 μl，用RNAiso Plus裂解提取RNA，按照PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time)說明書反轉錄得到CDNA。用Probe qPCR Mix熒光探針PCR檢測試劑檢測Benzonase核酸酶消化后病毒樣顆粒和病毒樣顆粒裂解反轉錄的CDNA。

1.2.5 熒光定量PCR標準曲線建立和病毒樣顆粒核酸拷貝數確定 用NanoDrop2000超微量分光光度計測量重組質粒pET28a(+)/CP-PEDV的濃度，按照公式：樣品Copies/μl = 阿伏伽德羅常數(6.02×1023)拷貝數×濃度(ng/μl×10-9)/重組質粒平均分子量(DNA length×660)，計算重組質粒pET28a(+)/CP-PEDV原始拷貝數。對重組質粒進行10倍系列稀釋，然后分別以各個稀釋度為模板，建立標準曲線。同時，用標準曲線檢測以Benzonase核酸酶消化后病毒樣顆粒裂解反轉錄的CDNA，確定病毒樣顆粒核酸拷貝數。

1.2.6 病毒樣顆粒耐核糖核酸酶(Ribonuclease, RNase)攻擊檢測 將600 μl Benzonase核酸酶消化后的病毒樣顆粒，分為2組，每組3份，每份100 μl。其中一組(3份)直接進行裂解和反轉錄，另一組(3份)在樣品裂解前加入10 μl 1mg/L的RNase，37 ℃條件下放置60 min后，再進行裂解和反轉錄。最后，2份CDNA進行 PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測，比較檢測結果。

1.2.7 病毒樣顆粒穩定性檢測 取2 mL Benzonase核酸酶消化后的病毒樣顆粒，用0.22 μm針頭濾器無菌過濾，分為4份，每份500 μl。1份4 ℃放置，剩余3份37 ℃分別放置5、10、15 和20 d，然后進行樣品裂解、反轉錄和熒光定量PCR檢測，比較其Ct值變化。

2 結果與分析

2.1 載體構建和目的蛋白的表達、純化

PCR擴增的PEDV N蛋白基因靶序列，通過雙酶切插入到質粒pET28a(+)/CP中MS2噬菌體CP基因和PAC位點基因的下游，雙酶切和測序結果均正確。重組質粒pET28a(+)/CP-PEDV在大腸桿菌表達菌株中誘導表達，目的蛋白經過硫酸銨和分子篩進行純化，SDS-PAGE顯示純度達85 %以上(圖1-b)。

a：箭頭所指為目的蛋白峰；b：M，蛋白分子量標準；1：超聲破碎后上清；2：硫酸銨沉淀后重懸上清；3：凝膠過濾層析第一個流出峰濃縮后 a: The peak pointed by the arrow is the target protein; b: M, protein marker; Lane 1: Supernatant after sonication; Lane 2: Resuspension after precipitation of ammonium sulfate; Lane 3: The first peak of gel filtration chromatography

2.2 透射電鏡觀察病毒樣顆粒

純化的目的蛋白經磷鎢酸染色，通過透射電鏡(150 000×)進行觀察，目的蛋白在體外自組裝形成了大小均一，直徑約為23～28 nm的病毒樣顆粒(圖2)，符合MS2噬菌體直徑大小。

圖2 電鏡觀察病毒樣顆粒(盔甲RNA)的形狀及粒徑 Fig.2 Observation of the shape and size of virus-like particles (Armor RNA) by electron microscope

2.3 病毒樣顆粒核酸酶消化和殘余核酸檢測

為了完全除去純化的病毒樣顆粒含有的殘余核酸(重組質粒pET28a(+)/CP-PEDV和大腸桿菌基因組)對后續實驗造成的影響，純化的VLPs經Benzonase核酸酶消化，消化后通過熒光定量PCR檢測，結果顯示消化后樣品直接PCR，Ct值為38.76，說明殘余重組質粒pET28a(+)/CP-PEDV已被徹底消化；而消化后的樣品，經過裂解和RT-PCR檢測，Ct值為11.13，表明形成的VLPs包封了N蛋白基因靶序列，即形成盔甲RNA(圖3)。

圖3 核酸酶消化后病毒樣顆粒殘余核酸檢測Fig.3 Detection of residual nucleic acid of virus-like particles after nuclease digestion

2.4 病毒樣顆粒核酸拷貝數確定

通過公式計算重組質粒pET28a(+)/CP-PEDV的濃度為1.5×107copies/μl，重組質粒10倍系列稀釋后，選取10-2、10-3、10-4、10-5和10-6稀釋度建

立標準曲線，以質粒系列稀釋度為橫坐標，PCR擴增的閾循環數(threshold cycle, Ct)為縱坐標建立標準曲線(圖4)，其回歸方程為Y= -3.315X+42.424，斜率為-3.315，相關系數R2= 0.998，表明PCR擴增效率高，標準曲線線性良好，樣品濃度對數值與閾循環數之間具有良好的相關性。病毒樣顆粒稀釋100倍后熒光定量PCR檢測，其Ct值為17.52，通過標準曲線計算，病毒樣顆粒拷貝數為2.4×106copies/μl。

a：擴增曲線；b：標準曲線 a: Amplification curve; b: Standard curve

2.5 病毒樣顆粒耐RNase攻擊實驗

用RNase處理VLPs后與未處理對照組，平行進行樣品裂解、RNA提取、RT-PCR后，瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示：RNase處理前后，目的條帶亮度基本一致(圖5)，說明制備的病毒樣顆粒能夠抵抗RNase的降解作用。

M：核酸分子量標準；1、2、3：RNase未處理；4、5、6：RNase 37 ℃處理60 minM: Nucleic acid molecular weight standard; 1, 2, 3: RNase untreated; 4, 5, 6: RNase treated at 37 ℃ for 60 min

2.6 病毒樣顆粒的穩定性實驗

過濾除菌的病毒樣顆粒在37 ℃條件下放置5、10和15 d，RT-PCR檢測其Ct值和4 ℃基本一致，沒有差異，37 ℃條件下放置20 d的Ct值升高(圖6)，從Ct值變化趨勢可看出，制備的盔甲RNA在37 ℃條件下至少可以儲存15 d，具有良好的熱穩定性。

圖6 病毒樣顆粒(盔甲RNA)的熱穩定性檢測 Fig.6 Detection of thermal stability of virus-like particles (Armor RNA)

3 討 論

PEDV是目前危害養豬業最重要的病原體之一，其主要危害仔豬(3～10 日齡)，導致仔豬嚴重水樣腹瀉和脫水死亡，部分地區的豬場仔豬腹瀉樣品中PEDV核酸檢出率甚至高達80 % 以上[11]，快速準確的診斷對PEDV的防控有重要意義。相較于常規的病原學檢測、血清學檢測以及病原的快速檢測(免疫膠體金層析)等方法，以核酸擴增為基礎的分子檢測技術，因其具有靈敏度高、特異性強、快速高效、定量準確和高通量等優點，在動物疾病診斷中發揮了巨大作用[12]。環介導等溫擴增[13]、巢氏PCR技術[14]、多重PCR技術[15]、SYBR Green I 熒光定量PCR[16]、TaqMan熒光定量PCR[17]等核酸檢測方法均用于PEDV的快速檢測，效果良好。PEDV基因組中的M基因和N基因保守性非常強，常作為PEDV診斷的候選基因，但不能區分經典毒株和變異毒株[11]；致弱毒株的ORF3基因有51個堿基缺失，并且造成病毒毒力減弱，可以作為鑒別強弱毒株的依據[18]，S 基因是PEDV 毒株毒力和進化的特征性基因，之前也有學者報道了通過S基因區分變異毒株的RT-PCR 方法[19-20]。

雖然病毒核酸擴增檢測成為新發再發病毒類疾病快速準確診斷的有效方法，但影響試驗過程的因素太多：核酸擴增過程本身的高靈敏度，些許的氣溶膠就會導致假陽性無法控制；實驗操作人員的操作失誤或隨機誤差；核酸提取抑制物的殘留；儀器控溫不精確和空間的差異；引物和探針設計的不合理；逆轉錄和擴增效率差；試劑良莠不齊等，這些都會造成最終結果的偏差，甚至結果不可使用[21]。因此，核酸擴增檢測特別是RNA病毒的核酸擴增檢測，必須使用質控品，對檢測的全過程進行嚴格的質量控制才能保證結果的可靠性。能做到穩定可靠、全過程監控(核酸提取、反轉錄和擴增分析)、安全無生物危害、易于制備的VLPs(盔甲RNA)無疑是理想的質控品[22]。利用MS2噬菌體外殼蛋白在體外可以將PAC位點下游的核酸包封成VLPs，HCV、HEV、HIV、EV71、流感病毒以及馬動脈炎病毒等多種RNA病毒質控品都已成功制備[21]。

本實驗選取PEDV基因組中保守性強的N蛋白基因作為靶基因，插入到含有MS2噬菌體外殼蛋白基因和PAC位點基因下游，構建重組載體，通過原核表達系統，在體外成功得到了包封靶基因的盔甲RNA。在本研究構建重組載體過程中，將MS2噬菌體外殼蛋白CP基因和PAC位點基因插入原核載體，構建重組質粒和工程菌株。該工程菌株在低溫誘導條件下，電鏡觀察和熒光RT-PCR檢測，外殼蛋白自組裝且包封靶序列形成了盔甲RNA。為了消除純化的VLPs殘余的大腸桿菌基因組以及重組質粒核酸，實驗前期使用了DNase I和RNase 37 ℃進行消化，但是效果并不理想，仍有殘余的重組質粒，后期使用Benzonase全能核酸酶，可以很好消除殘余核酸影響。本研究獲得的盔甲RNA可以抵抗一定RNase的降解，無菌過濾后，在37 ℃條件下可以穩定保存15 d，是一個理想的RT-PCR質控品，可為PEDV的快速準確檢測提供技術支持。

4 結 論

MS2噬菌體外殼蛋白可以在體外包封外源RNA(PEDV N蛋白基因靶序列)，并形成熱穩定性好，耐Rnase攻擊的病毒樣顆粒(盔甲RNA)，該盔甲RNA可從RNA提取、反轉錄到擴增檢測全程進行監控，可作為RT-PCR檢測豬流行性腹瀉病毒的質控品，從而保證檢測結果的正確性。其制備方法具有通用性，可為其它RNA病毒核酸檢測質控品的制備提供參考。