環(huán)境絲狀真菌對(duì)3種重金屬的耐受性能比較與解析*

毛航球 李文英 高繡紡 李 夏 宋 磊

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，廣東 廣州 510640；2.長(zhǎng)江大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，湖北 武漢 430000；3.濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心,湖北 荊州 434025)

隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展和化石燃料的燃燒，重金屬在水體、土壤環(huán)境中大量富集，使得環(huán)境中重金屬污染問(wèn)題日益嚴(yán)重[1]。重金屬污染具有隱蔽性、持續(xù)性、不可逆轉(zhuǎn)性[2]，如何綠色環(huán)保地治理重金屬污染問(wèn)題是各國(guó)科研組織和機(jī)構(gòu)研究的熱門話題[3]。微生物修復(fù)重金屬污染是近幾十年來(lái)興起的環(huán)保型、高性價(jià)比的修復(fù)技術(shù)，微生物可以改變重金屬在環(huán)境中的化學(xué)行為，通過(guò)對(duì)環(huán)境中重金屬進(jìn)行轉(zhuǎn)化、遷移或固定從而達(dá)到修復(fù)的目的，具有成本低、效率高等特點(diǎn)，應(yīng)用前景十分廣闊[4-5]。

Pb、Cd、Cr是環(huán)境中常見的重金屬，可通過(guò)食物鏈在生物體內(nèi)富集，即使少量的污染也會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生威脅[6]。國(guó)內(nèi)外研究表明一些真菌對(duì)特定的重金屬具有耐受性的同時(shí)也對(duì)重金屬具較強(qiáng)的生物吸附、轉(zhuǎn)化等作用。XIE等[7]分離出一株真菌Aspergillusaculeatus對(duì)Cd2+有較好的耐受性。ZAFAR等[8]從土壤中分離出的Trichodermasp.和Aspergillussp.對(duì)Cd2+和Cr(Ⅵ)有較好的耐受性，特別是后者對(duì)Cd2+和Cr(Ⅵ)的吸附量分別達(dá)到2.7、1.2 mg/g。宋瑛瑛等[9]測(cè)定了Pb2+耐受菌株LadosporiumcladosporioidesB142對(duì)Pb2+的吸附能力，結(jié)果表明在吸附時(shí)間為15、60 min時(shí)，其對(duì)Pb2+的吸附量分別為14.73、19.54 mg/g。

本研究利用前期從污染環(huán)境中分離的11株絲狀真菌，比較了3 種重金屬(Cr(Ⅵ)、Pb2+和Cd2+)對(duì)菌絲生長(zhǎng)擴(kuò)展的影響作用及耐受性，觀察測(cè)定重金屬對(duì)菌株培養(yǎng)性狀和菌落直徑的影響程度，為后續(xù)利用高效菌株解決重金屬污染問(wèn)題提供理論依據(jù)和實(shí)際參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

LRH-150型生化培養(yǎng)箱，DE-CJ-1N型超凈工作臺(tái),CL-32L型高壓蒸汽滅菌鍋，游標(biāo)卡尺，打孔器等。

1.1.2 菌株信息及來(lái)源

11株供試真菌為前期從污染環(huán)境中分離獲得的純培養(yǎng)菌株，分別為：大單孢屬(Aplosporellasp.)(菌株號(hào)Ap1229)、葡萄座腔菌屬(Botryosphaeriasp.)(菌株號(hào)Bo1075)、色二孢屬(Diplodiasp.)(菌株號(hào)Di0237)、毛色二孢屬(Lasiodiplodiasp.)(菌株號(hào)La1636)、毛霉屬(Mucorsp.)(菌株號(hào)Mu-tea1)、新殼梭孢(Neofusicoccumsp.)(菌株號(hào)Nf1172)、新暗色柱節(jié)孢(Neoscytalidiumsp.)(菌株號(hào)Ns1680)、青霉屬(Penicilliumsp.)(菌株號(hào)Pe-soil2)、暗葡腔菌屬(Phaeobotryonsp.)(菌株號(hào)Ph1212)、假殼梭孢屬(Pseudofusicoccumsp.)(菌株號(hào)Ps0108)、斯潘氏菌屬(Spencermartinsiasp.)(菌株號(hào)Sp1370)。

1.1.3 供試材料及試劑

供試菌株均采用馬鈴薯瓊脂(PDA)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)所用試劑Pb(NO3)2、CdCl2、K2Cr2O7為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

分別用Pb(NO3)2、CdCl2和K2Cr2O7配制3種重金屬的高濃度母液(Cr(Ⅵ) 1 000 mg/L，Cd2+100 mmol/L，Pb2+100 mmol/L)，并用微孔濾膜過(guò)濾除菌。

對(duì)PDA培養(yǎng)基進(jìn)行高壓蒸氣滅菌(121 ℃，20 min)，待其冷卻到50 ℃左右，加入適量的重金屬母液，配置不同濃度梯度的重金屬培養(yǎng)基(Cr(Ⅵ)為 0、20、40、60、100、160、220 mg/L；Cd2+、Pb2+均為0、3、5、8、12、16、18 mmol/L)，調(diào)節(jié)pH≤5，防止金屬離子沉淀。在無(wú)菌操作臺(tái)中用打孔器在空白處理(未添加重金屬)菌落邊緣取生長(zhǎng)狀況良好的菌餅(直徑5 mm)，倒置放于重金屬培養(yǎng)基的正中央，于26 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)觀察14 d，測(cè)定菌株最小抑制濃度(MIC)，也即重金屬抑制微生物細(xì)胞生長(zhǎng)的最低濃度[10]。采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑并記錄菌落形態(tài)(質(zhì)地、形狀、顏色等)[11]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel和Origin軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理，SPSS軟件進(jìn)行多重性比較分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 11株絲狀真菌對(duì)3種不同重金屬的耐受性測(cè)定

表1為11株供試菌株在不同濃度Cr(Ⅵ)培養(yǎng)基下的生長(zhǎng)情況及MIC。由表1可見，當(dāng)Cr(Ⅵ)低于20 mg/L時(shí)，所有菌株都能生長(zhǎng)，逐漸提高重金屬濃度，菌株明顯被抑制，當(dāng)Cr(Ⅵ)提高到100 mg/L時(shí)，菌株Mu-tea1和菌株P(guān)e-soil2可以生長(zhǎng)，當(dāng)Cr(Ⅵ)提高到220 mg/L時(shí)，只有菌株Mu-tea1能夠生長(zhǎng)。由表1可見，菌株Mu-tea1、Pe-soil2、Nf1172對(duì)Cr(Ⅵ)的耐受性能相對(duì)更強(qiáng)。

表2為11株供試菌株在不同濃度Cd2+培養(yǎng)基下的生長(zhǎng)情況及MIC。從表2可以看出，當(dāng)Cd2+低于3 mmol/L時(shí)，所有供試菌株都能生長(zhǎng)，隨著提高培養(yǎng)基中Cd2+濃度提高，菌株生長(zhǎng)狀況均變?nèi)酰珻d2+為8 mmol/L時(shí)大多菌株表現(xiàn)為被抑制，菌落不能明顯延伸，當(dāng)Cd2+提高到18 mmol/L時(shí)，只有菌株Nf1172和菌株P(guān)e-soil2能生長(zhǎng)。相比而言，對(duì)Cd2+有較強(qiáng)耐受的優(yōu)勢(shì)菌株有Nf1172、Pe-soil2、La1636。

表3為11株供試菌株在不同濃度Pd2+培養(yǎng)基下的生長(zhǎng)情況及MIC。從表3可以看出，當(dāng)Pb2+低于3 mmol/L時(shí)，所有供試菌株都能生長(zhǎng)，逐漸提高Pb2+濃度，菌株均明顯被抑制，當(dāng)Pd2+提高到8 mmol/L時(shí)，只有菌株Nf1172和菌株P(guān)e-soil2能夠生長(zhǎng)，繼續(xù)提高Pb2+到18 mmol/L時(shí)，只有Pe-soil2可以生長(zhǎng)。對(duì)Pb2+有較強(qiáng)耐受的優(yōu)勢(shì)菌株為L(zhǎng)a1636、Nf1172和Pe-soil2。

表1 供試菌株對(duì)Cr(Ⅵ)的耐受性1)

注：1)“+”表示能夠生長(zhǎng)，“-”表示抑制生長(zhǎng)，表2、表3同。

表2 供試菌株對(duì)Cd2+的耐受性

表3 供試菌株對(duì)Pb2+的耐受性

MIC可以反映菌株對(duì)重金屬離子的耐受性程度。從上述結(jié)果可以看出，供試菌株對(duì)不同種類重金屬的耐受性有較大的差異，這可能與重金屬進(jìn)入菌絲體內(nèi)形成不同化合物有關(guān)[12]。同一菌株對(duì)不同重金屬濃度耐受性也有較大差異，在低濃度條件下，重金屬對(duì)菌絲體毒害作用較弱，提高重金屬濃度，其對(duì)菌株的抑制毒害作用顯著增強(qiáng)。MUNOZ等[13]從礦區(qū)污水中分離出一株Trichosporonsp.對(duì)Pb2+的MIC為12～14 mmol/L，本研究中菌株Nf1172、Pe-soil2對(duì)Pb2+的MIC為18 mmol/L，說(shuō)明Nf1172、Pe-soil2對(duì)Pb2+有更好的耐受性。OLADIPO等[14]從礦山分離的Bacilluskochii對(duì)Cr(Ⅵ)的MIC為150 mg/L，本研究中菌株Mu-tea1對(duì)Cr(Ⅵ)的MIC為220 mg/L，耐受性能明顯增強(qiáng)，這可能是由于絲狀真菌生長(zhǎng)快、生物量大、有細(xì)胞壁等原因，所以對(duì)重金屬的抗性能力要優(yōu)于細(xì)菌。

2.2 3種重金屬對(duì)強(qiáng)耐受性菌種菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

真菌在重金屬脅迫培養(yǎng)下的生長(zhǎng)狀況可直接反映重金屬對(duì)其產(chǎn)生的危害程度。從供試菌株中分別選出對(duì)Cr(Ⅵ)、Pb2+和Cd2+耐受性最強(qiáng)的3株菌株，在不同脅迫濃度下培養(yǎng)14 d，觀察菌落直徑的變化。根據(jù)表1篩選結(jié)果，選擇菌株Nf1172、Mu-tea1和Pe-soil2進(jìn)行Cr(Ⅵ)脅迫的菌落直徑對(duì)比，結(jié)果見圖1。

圖1 3株供試菌株在不同Cr(Ⅵ)質(zhì)量濃度下的菌落直徑Fig.1 The colony diameters of 3 tested fungi strains under different Cr(Ⅵ) concentrations

由圖1可見，3株供試菌株對(duì)不同濃度Cr(Ⅵ)的耐受性具有一定的差異性。當(dāng)Cr(Ⅵ)≤20 mg/L時(shí)，其對(duì)3株供試菌株抑制效果不明顯，菌落直徑都為9.0 cm。當(dāng)培養(yǎng)基Cr(Ⅵ)提高至60 mg/L時(shí)，菌株Nf1172的菌落直徑為4.3 cm，與Cr(Ⅵ)為0 mg/L的空白處理組相比有顯著性差異(p<0.05)，菌株Mu-tea1和Pe-soil2在Cr(Ⅵ)為60 mg/L下均能正常生長(zhǎng)。繼續(xù)提高Cr(Ⅵ)至220 mg/L時(shí)，只有菌株Mu-tea1能夠擴(kuò)展，菌落直徑為3.1 cm，與其他菌株相比有顯著性差異(p<0.05)。3株供試菌株對(duì)Cr(Ⅵ)的耐受性大小為Mu-tea1> Pe-soil2> Nf1172。不同菌株對(duì)Cr(Ⅵ)耐受性差異明顯，可能是菌株體內(nèi)的官能團(tuán)通過(guò)減少對(duì)Cr(Ⅵ)的吸收或增加體內(nèi)Cr(Ⅵ)的排出量存在差異，從而對(duì)Cr(Ⅵ)的抵抗力不同[15]。

根據(jù)表2篩選結(jié)果，選擇菌株La1636、Nf1172和Pe-soil2在不同濃度Cd2+脅迫下培養(yǎng)14 d進(jìn)行菌落直徑觀察，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，隨著Cd2+濃度的增加，3株供試菌株菌落的直徑均逐漸減小。當(dāng)Cd2+≤3 mmol/L時(shí)，3株供試菌株的菌落直徑均為9.0 cm。提高Cd2+摩爾濃度至8 mmol/L，菌株La1636的菌落直徑為3.3 cm，與Cd2+摩爾濃度為0 mmol/L的空白對(duì)照組相比有顯著差異(p<0.05)，而該濃度水平下菌株Nf1172和Pe-soil2的菌落直徑均為9.0 cm。提高Cd2+摩爾濃度至18 mmol/L時(shí)，只有菌株Nf1172和Pe-soil2能生長(zhǎng)，菌落直徑分別為2.3、2.7 cm，與其他菌株相比差異顯著(p<0.05)。3株供試菌株對(duì)Cd2+耐受性大小為Pe-soil2>Nf1172>La1636。菌株P(guān)e-soil2對(duì)Cd2+顯現(xiàn)出更好的耐受性可能是因?yàn)榧?xì)胞膜表面的官能團(tuán)對(duì)Cd2+有排斥作用，從而增大其對(duì)Cd2+的耐受性[16]。

圖2 3株供試菌株在不同Cd2+摩爾濃度下的菌落直徑Fig.2 The colony diameters of 3 tested fungi strains under different Cd2+ concentrations

根據(jù)表3篩選結(jié)果，選擇菌株La1636、Nf1172和Pe-soil2在不同濃度Pb2+脅迫下培養(yǎng)14 d進(jìn)行菌落直徑觀察，結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，在14 d觀察時(shí)間內(nèi)，當(dāng)Pb2+≤3 mmol/L時(shí)，3株供試菌株的菌落直徑均為9.0 cm。當(dāng)Pb2+摩爾濃度提高到8 mmol/L時(shí)，菌株La1636完全被Pb2+毒性所抑制，菌株Nf1172的菌落直徑為6.7 cm，與Pb2+為0 mmol/L的空白對(duì)照組相比有顯著性差異(p<0.05)，而菌株P(guān)e-soil2的菌落直徑仍為9.0 cm。提高Pb2+摩爾濃度至18 mmol/L時(shí)，只有菌株P(guān)e-soil2能夠生長(zhǎng)，菌落直徑為4.3 cm，與其他菌株相比差異性顯著(p<0.05)。可以看出，3株供試菌株對(duì)Pb2+耐受性大小為Pe-soil2>Nf1172>La1636。不同菌株對(duì)Pb2+耐受性的差異可能與菌株體內(nèi)無(wú)機(jī)酸根離子含量多少有關(guān)，Pe-soil2中無(wú)機(jī)酸根離子含量較高，可與Pb2+離子形成絡(luò)合沉淀從而減低體內(nèi)Pb2+含量。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株Mu-tea1對(duì)Cr(Ⅵ)表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐受性，而菌株Nf1172和Pe-soil2對(duì)Pb2+、Cd2+比其他供試菌株表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐受性。不同濃度的重金屬對(duì)同一菌株菌絲生長(zhǎng)具不同程度的抑制作用，且抑制作用隨重金屬濃度的升高而增強(qiáng)，菌落擴(kuò)展速率也隨著重金屬濃度的升高而減小。不同菌株對(duì)重金屬耐受性差異明顯，可能與菌株細(xì)胞內(nèi)部官能團(tuán)結(jié)構(gòu)和重金屬影響菌株次生代謝有關(guān)。楊超等[17]分離出一株P(guān)haeoacremoniummortoniae對(duì)Pb2+脅迫條件下的半致死質(zhì)量濃度為951 mg/L，本研究中Pe-soil2在18 mmol/L Pb2+條件下能夠生長(zhǎng)，菌落直徑為4.3 cm，這是由于絲狀真菌體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)能有效降低活性氧的傷害，分泌多種有機(jī)酸，可絡(luò)合、沉淀重金屬離子，從而降低重金屬的毒害。徐在超等[18]從礦區(qū)分離3株具重金屬抗性的內(nèi)生真菌Fusariumsp．(菌株號(hào)CBRF14)、Penicilliumsp．(菌株號(hào)CBRF65)和Alternariasp．(菌株號(hào)CBSF68)，對(duì)Cd2+的MIC分別達(dá)到了20.54、53.43、27.25 mg/L，對(duì)Pb2+的MIC分別為299.8、356.6、188.9 mg/L，對(duì)Pb2+和Cd2+也表現(xiàn)出較好的耐受性，可能是絲狀真菌通過(guò)表面吸附作用，菌絲分泌出多糖物質(zhì)產(chǎn)生結(jié)合作用使重金屬的毒性降低[19]。

3 總 結(jié)

(1) 將11株絲狀真菌在含有不同濃度Cr(Ⅵ)、Cd2+、Pb2+的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在高濃度重金屬脅迫條件下菌絲擴(kuò)展均受到明顯抑制,菌落的形態(tài)也有著明顯的變化,證實(shí)了Cr(Ⅵ)、Cd2+、Pb2+對(duì)真菌的生長(zhǎng)具有不同程度的抑制作用。

(2) 不同菌株對(duì)不同重金屬耐受能力不同，菌株Mu-tea1對(duì)Cr(Ⅵ)耐受能力最強(qiáng)，Nf1172和Pe-soil2對(duì)Cd2+、Pb2+耐受能力較強(qiáng)，與其他供試菌株相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)。

(3) 本研究供試菌株均從華南特色環(huán)境中分離出來(lái)，在利用優(yōu)勢(shì)菌株修復(fù)華南區(qū)域性重金屬污染等方面，具備得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)，可為下一步研發(fā)環(huán)境污染控制及微生物修復(fù)技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)和材料基礎(chǔ)。