鈣網織蛋白-短發夾RNA 慢病毒載體構建及其對喉鱗狀細胞癌細胞Hep-2 中鈣網織蛋白表達的影響△

高樹峰，楊明福，張克輝，游龍貴，王富華，王心濤，劉遺斌，羅冬，蔡云香

贛州市人民醫院耳鼻咽喉頭頸外科，江西 贛州3410000

喉癌是耳鼻咽喉頭頸外科常見的惡性腫瘤，發病率高，在中國，其占全身腫瘤的1%～2%，占耳鼻咽喉惡性腫瘤的11%～22%。早期喉癌的治療方法以手術或放療為主，中晚期喉癌的治療方法為以手術為主的綜合治療。雖然目前的治療手段提高了喉癌患者的5 年生存率，但術后復發和轉移仍是喉癌患者的主要死因[1-2]。因此，尋找有效、簡便、不良反應小的新治療方法成為耳鼻咽喉科工作者關注的焦點。喉癌的發生是以癌基因的激活和抑癌基因的失活為基礎的多步驟、多階段過程，因此，尋找阻斷癌基因激活與抑癌基因失活的靶向基因是目前研究的工作重點[3-4]。鈣網織蛋白（cal‐reticulin，CRT）具有促進巨噬細胞吞噬腫瘤細胞并破壞腫瘤細胞的功能，當細胞凋亡時，CRT 會發生簇集，與相關蛋白所識別的磷脂酰絲氨酸（phos‐phatidylserine，Ps）、C1q 形成“來吃我”信號識別復合體，啟動清除、吞噬過程，同時，促使凋亡細胞被樹突狀細胞（dendritic cell，DC）等識別并呈遞給CD4+和CD8+，從而激發抗腫瘤免疫應答[5]。為了探究CRT 在喉癌發展過程中的可能機制，本研究自行設計并構建了CRT-短發夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）慢病毒載體，鑒定了其對人喉鱗狀細胞癌細胞Hep-2 中CRT基因的沉默效果，為后續研究CRT基因功能奠定基礎，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

限制性內切酶EcoRⅡ、BamHⅠ、T4DNA 連接酶及DNA 凝膠回收試劑盒均購自TaKaRa 公司；DH5α大腸桿菌購自上海吉凱基因醫學科技股份有限公司；慢病毒包裝細胞293T 細胞、Lipofectami‐neTM2000 轉染試劑、SYBR Green qPCR SuperMix 試劑盒、immobilon western chemilum HRP substrate 試劑均購自Invitrogen 公司；高純度質粒小提試劑盒、胎牛血清均購自Hyclone 公司；LymphoprepTM分離液購自NycoPrep 公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒、CRT 抗體、兔抗人免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）抗體均購自Abcam 公司；人喉鱗狀細胞癌上皮細胞Hep-2 購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所。

1.2 方法

1.2.1 人CRT siRNA 靶序列的設計合成及表達載體構建 通過國家生物技術信息中心（the Nation‐al Center for Biotechnology Information，NCBI）檢索人CRT基因信息，獲取CRT基因核苷酸序列，使用相關的siRNA 干擾序列設計軟件并經Blast 比對分析同源性后，選擇3 條特異性較高的核心編碼序列（coding sequence，CDS），分 別 命 名 為siRNA1（GAGAAAGATAAAGGTTTGCAGACAAGCCAG ‐GATGCACGCT）、siRNA2（CAACAGCCAGGTG‐GAGTCCGGCTCCTTGGAAGACGATTGG）和siR‐NA3（ACGAGACGTGGGGCGTAACAAAGGCAG‐CAGAGAAACAAAT），同時選擇一條無意義的序列作為陰性對照，命名為Negative siRNA（TAT‐CAGCACGTGTCAGTACG）。將這4 條序列構建成穩定的表達載體CRT siRNA（1、2、3）-pSIH1-H1-copGFP 和Negative siRNA-pSIH1-H1-copGFP，將構建好的載體轉化至大腸桿菌中進行擴增培養，挑取單克隆菌落進行聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）鑒定，并對陽性單克隆菌液進行測序。

1.2.2 有效序列的篩選 采用高純度質粒小提取試劑盒提取純化CRT siRNA-pSIH1-H1-copGFP 質粒，然后利用LipofectamineTM2000 轉染試劑分別將其轉入培養的喉鱗狀細胞癌細胞Hep-2 中，通過實時PCR 檢測細胞中CRTmRNA 的相對表達量，以β-actin基因為內參基因?；虮磉_效率=（1-siR‐NA 序列mRNA 占空白對照組的百分比）/轉染率。選擇一條沉默效率最高的CRT siRNA。

1.2.3 慢病毒載體的包裝及滴度測定 選擇沉默效率最高的CRT siRNA 包裝生產CRT-shRNA 慢病毒。具體操作方法：用限制性內切酶EcoRⅡ、BamHⅠ將pLVX-shRNA 載體雙酶切后，用DNA 凝膠回收試劑盒純化回收線性片段，再使用T4 DNA連接酶將回收的載體片段與CRT siRNA 片段連接。經PCR 鑒定為陽性且測序正確的載體命名為Lv-CRT shRNA。將Lv-CRT shRNA 質粒與包裝質粒導入293T 細胞中，獲得高滴度的慢病毒。將高滴度的慢病毒按照10 倍梯度稀釋后轉染293T 細胞，培養48 h 后，用熒光顯微鏡對熒光陽性細胞進行計數并計算慢病毒滴度。

1.2.4 慢病毒載體體外感染 取培養狀態良好的第二代喉癌細胞系Hep-2，感染實驗前24 h 進行接種，使用Ham’s F-12+10%胎牛血清（fetal calf se‐rum，FBS）的完全培養基，于37 ℃、5%CO2條件下培養，然后使用CRT siRNA-慢病毒液感染，添加病毒液，感染復數（multiplicity of infection，MOI）為30。感染后24 h 進行換液，換液后72、96 h 于顯微鏡下觀察細胞有無綠色熒光蛋白表達，并進行傳代、培養，傳代后24、72 h 分別觀察，然后繼續做傳代培養。

1.2.5 基因及蛋白表達水平檢測 取傳代培養細胞菌液，提取總RNA 和總蛋白，進行實時PCR 和蛋白質印跡法（Western blot）檢測。實驗分為3 組，即空白對照組（喉鱗狀細胞癌細胞Hep-2）、陰性對照組（喉鱗狀細胞癌細胞Hep-2+Lv-Negative shR‐NA）、shRNA 組（喉鱗狀細胞癌細胞Hep-2+Lv-CRT shRNA）。采用實時PCR 檢測3 組喉鱗狀細胞癌 細 胞Hep-2 中CRT基 因 的 表 達 量：取10 μg 總RNA，以Oligo（dT）為引物反轉錄合成cDNA 后，取5 μl cDNA 模板，使用SYBR Green qPCR superMix試劑盒進行熒光定量檢測。CRT基因的上游引物 為5'-ACTGTACTGATCATACGAGACG-3'，下 游引物為5'-CAGCGTCCAATTTGTTTCTCTGC-3'。β-actin基因的上游引物為5'-CTCCATCCTGGCCTC‐GCTGT-3'，下游引物為5'-GCTGTCACCTTCACC‐GTTCC-3'。PCR 反應條件：95 ℃3 min，95 ℃30 s，60 ℃30 s，共36 個循環。反應結束后，導出計算結果，采用2-ΔΔCt法對CRT基因的表達進行相對定量分析。Western blot 檢測方法：提取3 組喉鱗狀細胞癌細胞Hep-2 總蛋白后，采用BCA 蛋白定量試劑盒對蛋白進行初步定量，每組取等量蛋白進行上樣，采用8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（so‐dium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophore‐sis，SDS-PAGE）進行凝膠電泳后，將目的條帶轉移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST（Tris-HCl Strip Buf‐fer Tween）緩沖液封閉轉膜1 h，室溫下與一抗（CRT 抗體）孵育2 h，洗去未結合一抗，再于室溫下與二抗（兔抗人IgG 抗體）孵育1 h，洗去未結合二抗，于雜交膜上加入immobilon western chemilum HRP substrate，反應5 min 后，于暗室進行曝光、顯影、定影。

1.3 統計學分析

采用SPSS 13.0、SAS 9.0 軟件對數據進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher 確切概率法。相關性分析采用Spearman 秩相關分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人CRT siRNA 表達載體的鑒定

CRT siRNA-pSIH1-H1-copGFP 表達載體的PCR 產 物 大 小 為240 bp，Negative siRNA-pSIH1-H1-copGFP 的PCR 產 物 為220 bp。PCR 陽 性 鑒 定及測序分析結果顯示，插入片段的序列及方向均與預期結果一致。（圖1）

圖1 PCR陽性鑒定結果

2.2 有效序列的篩選

含靶序列CRT siRNA1、CRT siRNA2、CRT siR‐NA3 的載體轉染喉鱗狀細胞癌細胞Hep-2 的表達量均低于空白對照，差異均有統計學意義（P＜0.05）。含靶序列CRT siRNA1、CRT siRNA2 的載體轉染喉鱗狀細胞癌細胞Hep-2 的基因表達效率均低于CRT siRNA3，差異均有統計學意義（P＜0.05）。含不同靶序列的載體轉染喉鱗狀細胞癌細胞Hep-2 后的表達量和表達效率比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表1）

表1 不同靶序列的基因表達情況（±s）

表1 不同靶序列的基因表達情況（±s）

注：a與空白對照比較，P＜0.05；b與CRT siRNA3比較，P＜0.05

靶序列CRT siRNA1 CRT siRNA2 CRT siRNA3 Negative siRNA空白對照F值P值表達量1.24±0.22a 1.64±0.31a 0.84±0.20a 3.61±0.53 3.66±0.54 40.096＜0.05轉染率（%）92.05±1.36 90.13±1.05 91.68±1.24 90.32±1.14—1.918＞0.05表達效率（%）71.73±1.18b 61.45±1.26b 84.78±0.95 1.34±0.41—316.910＜0.05

2.3 慢病毒載體的滴度測定及感染情況

經測定，慢病毒載體的滴度為3.5×107TU/ml，MOI=30 時，慢病毒轉染至Hep-2 細胞的轉染率在90%以上。

2.4 基因及蛋白表達水平

實時PCR 結果顯示，空白對照組和陰性對照組喉鱗狀細胞癌細胞Hep-2 中CRT基因的表達水平分別為（3.662±0.023）和（3.620±0.031），兩組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；shRNA 組喉鱗狀細胞癌細胞Hep-2 中CRT基因的表達水平為（0.829±0.006），低于空白對照組和陰性對照組，差異 均 有 統 計 學 意 義（t=206.434、245.783，P＜0.05）。Western blot 結果顯示，與空白對照組和陰性對照組相比，shRNA 組喉癌Hep-2 細胞中CRT 蛋白的表達水平明顯下降。

3 討論

CRT 是一種主要存在于內質網膜上的Ca2+結合蛋白，也存在于細胞毒性T 淋巴細胞的胞漿顆粒和嗜中性粒細胞表面，由單一基因編碼，位于人19號染色體，包含9 個外顯子，具有高度的進化保守性。CRT 最初被認為僅參與了Ca2+平衡的調節。隨著研究的不斷深入，發現CRT 在抑制腫瘤血管生成、抗原呈遞和細胞凋亡中也具有重要作用[6-8]。細胞發生凋亡時，CRT 發生簇集并與相關蛋白結合形成“來吃我”信號識別復合體，清除、吞噬巨噬細胞[9]。CRT 能夠引起E7 抗原特異性分泌γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ），使CD4+T 淋巴細胞明顯增殖，從而發揮抗腫瘤作用，還能通過“交叉啟動”效應增強細胞核因子對腫瘤特異性抗原的免疫原性，從而增強機體的抗腫瘤能力[10]。近年來，又發現CRT 能夠被蒽環類抗生素誘導表達于細胞表面，并促使樹突狀細胞的吞噬及細胞毒性T 淋巴細胞產生免疫應答，增強蒽環類抗生素的化療效果[11]。研究發現，白血病、非霍奇金淋巴瘤以及膀胱癌、腦癌和膽囊癌的腫瘤細胞表面均表達CRT，腫瘤細胞的侵襲性增強，腫瘤細胞中CRT 的表達水平也相應升高，而大多數正常細胞群表面不表達或弱表達CRT[12-14]。Boasman 等[15]發現腫瘤細胞表面的CRT 具有促進巨噬細胞吞噬并破壞這些腫瘤細胞的功能，大多數腫瘤細胞不會受到巨噬細胞攻擊的原因是這些腫瘤細胞同時還表達另外一種分子CD47，從而抵消了CRT 促吞噬的信號。通過沉默CRT基因在腫瘤細胞的表達反向證明CRT的過表達在腫瘤發展中的作用，可能會給以CRT為靶點的基因治療提供新途徑。

RNAi 技術能以少量的dsRNA 達到同源基因特異性沉默的目的，其作用原理是siRNA 與其對應的內源基因mRNA 特異性結合，阻止翻譯過程，從而達到基因沉默的效果，是研究基因功能、表達調控機制及基因治療領域的關鍵技術[16]。RNAi 常用的載體有質粒載體和慢病毒載體，相比而言，慢病毒載體有更大的優勢，不僅能轉染分裂期細胞，又能轉染非分裂期細胞，大大提高了轉染效率；同時慢病毒載體的穩定性更好，可以容納大片段的外源基因，并能夠長久穩定表達，且免疫反應小，因此，其已經成為理想的轉基因載體，應用越來越廣泛[17]。

本研究利用RNAi 技術設計了3 條以CRT基因為靶點的siRNA，構建表達CRT siRNA-pSIH1-H1-copGFP 質粒，經PCR 陽性鑒定及測序分析證明插入片段的序列及方向均與預期一致，通過轉染喉鱗狀細胞癌細胞Hep-2 篩選出沉默效率最高的CRT siRNA3。將CRT siRNA3包裝生產CRT-shRNA慢病毒后，得到高滴度（3.5×107TU/ml）的慢病毒載體Lv-CRT shRNA，完全可以滿足后續實驗的需求。以人喉鱗狀細胞癌細胞Hep-2 為靶細胞進行慢病毒轉染，轉染率可達90%，經實時PCR 和West‐ern blot 檢測證實，重組慢病毒可以抑制Hep-2 細胞中CRT 蛋白及基因的表達水平，提示本研究成功構建了CRT-shRNA 慢病毒干擾載體，為對以CRT為靶點的基因治療的進一步研究奠定了基礎。