綿陽(yáng)地區(qū)山羊糞便中捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)的分子鑒定

蒲善秋，簡(jiǎn)克靈，李波，謝躍，何冉，楊光友，古小彬*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130；2.四川省綿陽(yáng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 綿陽(yáng) 621000）

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)（Haemonchus contortus）主要寄生于山羊等家養(yǎng)和野生反芻動(dòng)物的真胃，是反芻動(dòng)物胃腸道寄生蟲(chóng)中致病能力最強(qiáng)的線蟲(chóng)之一，感染率高（6.5%～96%），死亡率也比較高（40%）[1]。傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法對(duì)于形態(tài)相近的寄生蟲(chóng)蟲(chóng)卵和幼蟲(chóng)階段的鑒定具有局限性[2]，現(xiàn)通常應(yīng)用分子生物學(xué)方法進(jìn)行蟲(chóng)種鑒定[3-4]。核糖體第二內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA ITS-2）基因的進(jìn)化速度快，物種內(nèi)高度保守，而在亞種間具有不同程度的差異[5]，已應(yīng)用于圓線蟲(chóng)的分類(lèi)鑒定[6]。本研究采用PCR 技術(shù)對(duì)山羊糞便中疑似血矛屬線蟲(chóng)蟲(chóng)卵的ITS-2基因（糞便樣本來(lái)自綿陽(yáng)市北川、鹽亭、三臺(tái)三個(gè)縣）進(jìn)行分子鑒定和序列多態(tài)性分析，為綿陽(yáng)地區(qū)山羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)的分子流行病學(xué)調(diào)查和種群遺傳研究提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品 綿陽(yáng)地區(qū)三個(gè)縣疑似有血矛屬線蟲(chóng)蟲(chóng)卵的山羊糞便樣品60 份，其中鹽亭縣23 份（YT1-YT23），北川縣15 份（BC1-BC15），三臺(tái)縣22份（ST1-ST22）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蟲(chóng)卵收集與保存 根據(jù)鏡檢結(jié)果，采用飽和鹽水漂浮法收集上述糞便樣品中的蟲(chóng)卵，蟲(chóng)卵經(jīng)清水反復(fù)漂洗后，收集于1.5 mL EP管內(nèi)，保存于-20 ℃待用。

1.2.2 ITS-2基因的擴(kuò)增與PCR產(chǎn)物純化回收 將收集的蟲(chóng)卵根據(jù)QIAamp?DNA Stool Mini Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA 提取，然后將洗脫的DNA 置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ镄蛄袇⒖糂ott等的文獻(xiàn)報(bào)道[7]，序列如下：P1為5′-CAAATG?GCATTTGTCTTTTAG-3′，P2為5′-TTAGTTTCTT TTCCTCCGCT-3′，引物由英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成。

25 μL PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為：上下游引物（20 pmol）各1 μL，模板DNA 1 μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，滅菌雙蒸水9.5 μL。蒸餾水作為空白對(duì)照模板。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃4 min；94 ℃45 s，55 ℃45 s，72 ℃30 s（共30個(gè)循環(huán)）；最后72 ℃延伸10 min。將PCR 反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。擴(kuò)增條帶大小與預(yù)期結(jié)果相符，將目的條帶切割下來(lái)，裝入1.5 mL滅菌離心管中，根據(jù)天根公司DNA純化回收試劑盒的說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行PCR產(chǎn)物膠回收純化。

1.2.3 克隆與測(cè)序 將上述純化的PCR 產(chǎn)物連接到PMD19-T 載體，將連接產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)入30 μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，最后將菌液涂布于含Amp的LB固體培養(yǎng)基，挑取單個(gè)菌落，進(jìn)行菌液PCR 鑒定。取PCR 鑒定為陽(yáng)性的菌液送英濰捷基生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.4 序列分析 用MEGA5.0 軟件計(jì)算測(cè)序所得序列的各個(gè)堿基（A、T、C、G）組成的含量，將所得的測(cè)序序列根據(jù)序列是否一致進(jìn)行分類(lèi)，序列完全一致的歸為一種類(lèi)型，否則歸為不同類(lèi)型。將不同類(lèi)型的ITS-2序列與GenBank中各國(guó)的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)和柏氏血矛線蟲(chóng)的ITS-2序列進(jìn)行比較分析。所有序列用BioEdit 進(jìn)行人工輔助校對(duì)剪切，然后通過(guò)MegAlign軟件進(jìn)行序列同源性分析。采用MEGA 5.0軟件構(gòu)建ML系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，同時(shí)進(jìn)行1 000次的自舉檢驗(yàn)（Bootstrap test）。

2 結(jié)果

2.1 PCR 擴(kuò)增結(jié)果 60 份疑似血矛屬線蟲(chóng)卵的糞便樣品均能特異性地?cái)U(kuò)增出約300 bp 的基因片段，與預(yù)期目的片段的長(zhǎng)度大小相符，擴(kuò)增的目的片段單一清晰（圖1）。

2.2 序列特征 測(cè)序結(jié)果顯示，60 份疑似血矛屬線蟲(chóng)卵的糞便樣品均得到部分265 bp的ITS-2基因片段和部分74 bp 的28S 基因片段。經(jīng)比對(duì)和編輯后，得到ITS-2基因片段長(zhǎng)度均為191 bp，60 條序列的A、T、C、G 堿基平均含量分別為29.5%、36.2%、15.4%、18.9%，A+T 堿基含量（65.7%）顯著高于G+C 堿基含量（34.3%）。60 份ITS-2 序列共含有174 個(gè)保守位點(diǎn)，17 個(gè)變異位點(diǎn)（占8.90%，且全部為單變異位點(diǎn)），存在2個(gè)轉(zhuǎn)化位點(diǎn)，14個(gè)置換位點(diǎn)，1個(gè)樣品在第140位點(diǎn)存在堿基缺失（表1）。

圖1 山羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)ITS-2基因部分PCR產(chǎn)物

測(cè)序所得的60條序列共有15種不同的基因序列，將這15 種不同的序列命名為H1～H15。7個(gè) 樣 品（BC1、BC8、BC13、BC15、YT22、YT23、ST15）歸類(lèi)為H1，25 個(gè)樣品（BC2、BC4、BC7、BC9、BC11、ST4、ST5、ST8、ST9、ST10、ST14、ST17、ST19、ST22、YT1、YT2、YT7、YT8、YT9、YT11、YT14、YT15、YT16、YT17、YT21）歸類(lèi)為H2，15 個(gè)樣品（BC3、BC5、BC6、BC10、BC12、BC14、YT5、YT6、YT10、YT12、YT19、ST1、ST6、ST12、ST16）歸類(lèi)為H3，2 個(gè)樣品（ST7、ST20）歸類(lèi)H6，余下的H4～H5和H7～H15各類(lèi)型僅包含1個(gè)樣本（表1）。

2.3 ITS-2 基因序列同源性分析 所得15 種類(lèi)型的ITS-2部分序列與GenBank上相關(guān)分離株的同源性為97.4%～100%，與捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)日本分離株（AB682687）的同源性為95.8%～99.0%，與馬來(lái)西亞分離株（AY647245）的同源性為96.0%～99.5%，與意大利分離株（FN432336）、美國(guó)分離株（EU084691）、也門(mén)分離株（HQ683715）的同源性均在96.4%～99.5%，與法國(guó)分離株（AJ577465）的同源性為97.4%～99.5%，與中國(guó)內(nèi)蒙古分離株（HQ844231）的同源性為97.4%～100%。對(duì)所得60 條血矛線蟲(chóng)的ITS-2 序列進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)：不同蟲(chóng)株間序列的差異性較低，且不同地區(qū)的蟲(chóng)株有完全一致的序列，各個(gè)地區(qū)蟲(chóng)株的差異性并未與所采集的地區(qū)產(chǎn)生相關(guān)性。

2.4 ITS-2 基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 以山羊毛圓線蟲(chóng)（T.capricola）（GenBank序列號(hào)為JF276023）和短古柏線蟲(chóng)（C.curticei）（GenBank 序列號(hào)為AJ000033）作為系統(tǒng)發(fā)育分析的外群，利用MEGA 5.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（NJ 樹(shù)），結(jié)果顯示：本研究得到的15種類(lèi)型的ITS-2序列與各國(guó)的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)聚類(lèi)形成一個(gè)小分支，且15種類(lèi)型的序列不是按地區(qū)聚類(lèi)，而是交叉分布。由此可見(jiàn)，本研究中來(lái)自山羊糞便的血矛屬線蟲(chóng)均為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)，且ITS-2 序列的變異與蟲(chóng)株的地理位置無(wú)相關(guān)性。

表1 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)15個(gè)類(lèi)型的ITS-2基因序列核苷酸變異位點(diǎn)

3 討論

由于核糖體第二內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA ITS-2）在生物進(jìn)化過(guò)程中顯示種的特征，種內(nèi)具有高度保守性，而在不同種間又具有不同程度的變異，所以是較理想的種間鑒定遺傳標(biāo)記[8]。目前，ITS-2 作為分子分類(lèi)標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于寄生蟲(chóng)的檢測(cè)，如弓形蟲(chóng)[9-11]、隱孢子蟲(chóng)[12-13]和犬新孢子蟲(chóng)[14]等。目前，有關(guān)血矛線蟲(chóng)的分子鑒定主要以蟲(chóng)體為材料來(lái)進(jìn)行，而非蟲(chóng)卵。因此，本研究對(duì)綿陽(yáng)地區(qū)疑似血矛屬線蟲(chóng)的蟲(chóng)卵進(jìn)行了分子鑒定。

研究發(fā)現(xiàn)，測(cè)序所得60 條序列的ITS-2 和28 S基因片段的長(zhǎng)度均為265 bp，其中ITS-2基因片段的長(zhǎng)度為191～192 bp，該結(jié)果與Bott 等[7]報(bào)道的結(jié)果一致；且來(lái)自綿陽(yáng)3 縣的60 份樣品的ITS-2基因片段與已報(bào)道的其他地理來(lái)源的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)株的同源性達(dá)95.8%～100%。NJ 樹(shù)揭示60條ITS-2序列歸類(lèi)的15種類(lèi)型與源自美國(guó)、澳大利亞、法國(guó)等地的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)聚為一大支系，且不同地理來(lái)源的蟲(chóng)株并未因地域關(guān)系而歸為不同的分支，由此推測(cè)ITS-2 序列變異與蟲(chóng)株地理分布的相關(guān)性不明顯。這一結(jié)果與嚴(yán)若峰[15]等報(bào)道的剛好相反，可能是由于各研究所使用的ITS-2片段大小不同所致，本研究?jī)H用ITS-2部分片段作分析，而嚴(yán)若峰等使用的是ITS-2 全序列作分析。

4 結(jié)論

綜上所述，綿陽(yáng)地區(qū)60份山羊糞便中疑似血矛屬蟲(chóng)卵的樣品均為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)（H.contortus），且ITS-2 序列在種內(nèi)保守程度高，不同地域來(lái)源的分離株變異小。本研究為綿陽(yáng)地區(qū)山羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)的分子分類(lèi)和種群遺傳分析奠定了一定的基礎(chǔ)。