豬偽狂犬病gE、gB抗體鑭系熒光免疫層析快檢試劑盒的研制及效果評估

王澤洲，陳弟詩，張毅，吳俊清，章健，賀冬梅

（1.四川省動物疫病預防控制中心，四川 成都 610041；2.成都微瑞生物科技有限公司，四川 成都 611731）

豬偽狂犬病是由偽狂犬病毒（PRV）引起的一種傳染病，妊娠母豬發病后可發生流產、死胎、木乃伊胎；哺乳豬和保育豬發病后，可出現神經癥狀和呼吸道癥狀，感染豬日齡越大死亡率越低；育肥豬和成年豬發病后，可出現發熱和呼吸道癥狀，耐過豬可終身帶毒，成為病原貯存宿主。我國自1947 年首次報道豬感染偽狂犬病毒以來，已有20 多個省市相繼發生過本病，豬群的平均陽性率達20%以上［1］。豬偽狂犬病防控和凈化的核心技術是基因缺失（標記）疫苗和鑒別診斷方法的研究和應用。目前我國豬場中使用的基因缺失疫苗有Bartha 株、HB98 株、SA215 株和BUK株。偽狂犬病毒野毒抗體的檢測常使用gEELISA試劑盒，免疫抗體的檢測常使用gB-ELISA試劑盒和滅活全病毒抗原的ELISA 試劑盒。由于ELISA 抗體和免疫保護力關系不強，用膠體金法檢測抗體又存在敏感性不高，憑肉眼觀察存在主觀臆斷、準確性低等問題，因此，本研究應用鑭系元素作熒光標記物研制了一種既具有金標層析技術簡單、方便、快捷，又具有ELISA 準確、特異、敏感等優點的豬偽狂犬病抗體鑭系熒光免疫層析快檢試劑盒（PRV-LFICA）。

1 材料與方法

1.1 材料 PRV-gE 和PRV-gB 表達蛋白抗原、兔抗雞IgY 抗體、雞IgY 抗體，鑭系熒光納米微球和Wellray?WR-1608 熒光儀，吸水紙、樣品墊、硝酸纖維素膜，1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC），N-羥基琥珀酰亞胺，切條機、點膜和噴金膜機，其他試劑均為國產分析純。豬瘟病毒（CSFV）、豬圓環病毒2 型（PCV-2）、豬繁殖與呼吸道綜合征病毒（PRRSV）、豬細小病毒（PPV）、豬乙型腦炎病毒（JEV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）的陽性血清，豬偽狂犬病毒gB 抗體ELISA 檢測試劑盒，豬偽狂犬病毒gE抗體ELISA檢測試劑盒。

此外，制備包被膜、抗原標記微球、夾心法建立等均參照說明書或按相關要求操作。

1.2 熒光免疫層析試紙條的組裝 在濕度小于30%，溫度20～25 ℃的環境下，把吸水紙、標記物墊和樣品墊按順序粘貼在聚氯乙烯底板上形成微反應體系，然后將其切割成0.5 cm寬，即成試紙條，將試紙條裝入卡殼中制成檢測卡，裝入鋁箔袋封存備用。

1.3 特異性試驗 以建立的判斷標準（標準曲線）與CSFV、PCV-2、PRRSV、PPV、JEV、PEDV、TGEV的陽性血清進行豬偽狂犬病抗體鑭系熒光免疫層析檢測，同時設豬偽狂犬病毒血清陽性和陰性對照，以確定該試驗方法是否發生交叉反應。

1.4 敏感性試驗 將PRV 標準陽性血清按1∶40、1∶160、1∶640、1∶2 560、1∶10 240、1∶40 960 倍比稀釋，每個稀釋度平行做4個重復，用上述組裝好的PRV-LFICA 試劑卡檢測，將結果換算成T∕C值，判斷抗體檢出效價。

1.5 重復性試驗

1.5.1 批內重復性試驗 在相同條件下選取12份PRV 抗體水平不同的血清，每份樣本平行做8個重復，用組裝的PRV-LFICA 試劑卡檢測（批號為20170831），然后對檢測結果進行統計學分析。

1.5.2 批間重復性試驗 在相同條件下選取12份PRV 抗體水平不同的血清，分別用4 批PRVLFICA 試劑卡檢測（批號分別為20180717、20181023、20181211、20190216），然后對檢測結果進行統計學分析。

1.6 比較試驗 分別取豬偽狂犬病毒gB抗體高敏熒光免疫層析法試劑卡和豬偽狂犬病毒gB 抗體ELISA檢測試劑盒，同時檢測臨床樣品200份，操作方法與結果判定按說明書進行。再分別取豬偽狂犬病毒gE 抗體高敏熒光免疫層析法試劑卡和豬偽狂犬病毒gE 抗體ELISA 檢測試劑盒，同時檢測臨床樣品200份，操作方法與結果判定也按說明書進行。

1.7 試劑盒的組裝及保存期試驗 PRV-LFICA 試劑盒由熒光檢測儀、檢測卡、連接線組成。試劑盒置4 ℃保存，于保存后60、120、180、240、300、360、420、480 d按照PRV-LFICA的各個優化條件，對PRV 陽性和陰性參考血清進行檢測，并對結果進行統計學分析。

1.8 應用試驗 應用本次研制的PRV-LFICA試劑盒檢測收集自四川省內各地的1782份樣本，了解PRV血清抗體陽性率。

2 結果

2.1 測定條件的選擇 按照鑭系熒光免疫層析法的操作步驟，選擇標記量比例為1∶25的免疫微球；以樣本稀釋倍數40 倍為加樣量；檢測時間選擇為加樣后15 min。

2.2 檢測結果的判讀 加樣后，由于層析作用液體向前移動，先后與包被在T 線和C 線上的抗原形成復合物，這時試紙條經熒光檢測設備掃描顯示出2條熒光帶。C線熒光掃描值基本一致，T線值隨加樣中抗體濃度的增加而升高。相應的檢測結果以濃度為橫坐標，熒光值信號為縱坐標，經對數函數數據處理程序擬合即得到標準曲線。當樣本為陰性時，PRV抗體濃度很低，T線熒光值很低或完全檢測不到；當樣本為陽性時，PRV 抗體濃度越高，T 線熒光值也越高。無論結果是陽性還是陰性，C線總能顯示熒光，如果C線沒有熒光顯現，無論T線有無，結果均判為無效。

2.3 特異性試驗 本次用PRV-gE和PRV-gB蛋白分別建立的PRV-gE-LFICA 和PRV-gBLFICA 試劑盒檢測7 種常見豬病的陽性血清，得到的熒光比值均低于0.35（表1、表2），呈陰性反應。表明PRV-gE-LFICA 和PRV-gB-LFICA 試劑盒與7 種常見豬病的陽性血清不發生交叉反應，PRV-gE-LFICA 試劑盒對gB陽性血清，PRVgB-LFICA試劑盒對gE陽性血清也不發生交叉反應，顯示出很好的特異性。

表1 PRV-gE交叉反應試驗結果

表2 PRV-gB交叉反應試驗結果

2.4 敏感性試驗 把PRVgB 和PRV-gE 標準陽性對照血清稀釋至2 560 倍，鑭系熒光檢測結果仍為陽性。用同一份陽性血清分別同時做ELISA 和PRV-gB-LFICA、PRV-gE-LFICA檢測，結果顯示：PRV-gB-LFICA、PRVgE-LFICA 比ELISA 檢 測 結果高1～2個滴度。表明該方法敏感性很好。

2.5 重復性試驗 批內重復性試驗的變異系數均小于10%（表3、表4），批間重復性試驗的變異系數也均小于10%（表5、表6）。表明PRV-gE-LFICA 和PRV-gBLFICA 試劑盒具有良好的重復性。

表3 PRV-gB-LFICA批內重復性試驗結果

表4 PRV-gE-LFICA批內重復性試驗結果

表5 PRV-gB-LFICA批間重復性試驗結果

表6 PRV-gE-LFICA批間重復性試驗結果

2.6 比較試驗 用PRVgB-LFICA試劑盒和gB-ELISA試劑盒同時檢測臨床樣品200 份，其中PRV-gB-LFICA檢出陽性139 份，陰性48 份，可疑13 份；gB-ELISA 檢出陰性47 份，陽性152份，可疑1 份。兩種檢測方法的總符合率為89%（表7）。

用PRV-gE-LFICA 和gE-ELISA 試劑盒同時檢測臨床樣品200 份，其中PRV-gE-LFICA 檢出陽性13 份，陰性187 份；gE-ELISA 檢出陰性188份，陽性12 份。兩種檢測方法的總符合率為97.5%（表8）。

表7 gB-ELISA和PRV-gB-LFICA試劑盒檢測200份臨床樣品的結果

表8 gE-ELISA和PRV-gE-LFICA試劑盒檢測200份臨床樣品的結果

2.7 保存期試驗 統計學分析表明（表9、表10），PRV-gE-LFICA 和PRV-gB-LFICA 試劑盒在保存480 d 后檢測陽性血清、陰性血清，T∕C 值的變異系數均小于10%，說明該試劑盒在保存12個月后仍然穩定有效，進一步的穩定性試驗還在進行中。

表9 PRV-gB-LFICA保存期試驗結果

表10 PRV-gE-LFICA保存期試驗結果

2.8 現場應用試驗 使用本次研制的PRV-gELFICA和PRV-gB-LFICA試劑盒檢測收集自四川省內各地的樣本1 782 份，結果檢出血清gB 抗體陽性1 551 份，免疫抗體陽性率為87.0%；檢出血清gE抗體陽性39份，野毒抗體陽性率為2.19%。

3 討論

3.1 本研究采用鑭系元素銪（Eu）作為熒光物質，與傳統熒光物質相比，銪具有獨特的熒光光譜特性：Stokes位移大，激發光譜寬，發射光譜窄，熒光壽命很長［2-3］。由此建立的熒光方法特異性更強、敏感性更高，檢測結果更準確可靠。熒光納米微球的大小和均勻度也是影響快檢試劑盒檢測效果的重要因素，本試驗用的微球粒徑為70～200 nm。微球表面經過羧基（或氨基）活化處理，易與蛋白或抗體共價偶聯，能牢固地結合，提高標記物的穩定性，提高蛋白質的包被量，從而大大提高標記效率和靈敏度。

3.2 在豬偽狂犬病常用檢測方法中，病毒分離鑒定與中和試驗是經典方法，但由于涉及細胞繁殖、病毒培養、染色標記等復雜操作，加之檢測周期長，對實驗儀器和操作人員技術水平的要求也較高，故很難在基層和普通實驗室推廣應用。ELISA 是目前應用最廣、發展最快的免疫檢測技術，是目前檢測動物疫病抗體的主要方法。所有的ELISA 都具有敏感性和特異性強、操作簡單、檢測相對快速、檢查微量、無輻射、高通量等優點，但需要比較完整的實驗設備，操作人員需要有一定的專業技術水平和經驗，檢測一批樣品的整個流程至少需要2～4 h，對于基層獸醫站和一般養殖場不適用。膠體金免疫層析法（GICA）是近年來發展起來的一種快速檢測方法，操作簡單，使用方便，不需要特殊儀器設備，肉眼直接觀察和判定結果，全程只需要幾分鐘，但敏感性、重復性不高，產品質量參差不齊，漏檢率和誤診率較高[4-5]。

本研究建立的PRV-LFICA 檢測方法，既具有膠體金免疫層析法（GICA）簡單方便、適于基層等優點，通過專用設備檢查克服了主觀臆斷，采用鑭系元素作熒光標記克服了產品質量的不穩定性；又具有ELISA敏感、特異、微量等優點，克服了其缺點，檢測時間從2～4 h縮短到十多分鐘，檢測不需要有經驗的專業技術人員，檢測設備小巧便于攜帶，尤其適用于基層獸醫部門、養殖場和技術服務人員。從PRV-LFICA 方法學評估可以知道，該方法的特異性、敏感性和重復性都較好，與國內ELISA 試劑盒檢測結果的符合率和敏感性都在90%以上，表明該方法完全可以用于PRV 免疫抗體的檢測和野毒抗體的監測。