一例犬細小病毒與圓環病毒混合感染的診斷報告

馮帆，盧建遠，黃堅，湯承

（西南民族大學生命科學與技術學院，四川 成都 610041）

犬腹瀉是寵物犬最為常見的疾病之一，細菌、寄生蟲和病毒是致犬腹瀉的三種主要病因。病毒性犬腹瀉是非免疫犬死亡的重要原因[1]，犬細小病毒2 型（CPV-2）、犬冠狀病毒（CCoV）和犬瘟熱病毒（CDV）是寵物犬中最常見的病毒性腸道病原體[2]。近年來的研究顯示，犬圓環病毒（CanineCV）、犬星狀病毒（CAstV）等新發病毒也是致犬腹瀉的重要病原。目前，多種病毒的混合感染已十分常見，不僅加大了臨床獸醫對犬病毒性腹瀉的診斷難度，而且常常會增加疾病的嚴重程度，從而增加治療難度。CanineCV 于2012 年首次在美國被發現[3]，該病毒可引起犬急性腹瀉、嘔吐等癥狀，并且該病毒可能與宿主免疫抑制有關[4-5]，國內關于CanineCV病例的報道很少。本文對接診的一例腹瀉犬進行了犬細小病毒、犬冠狀病毒、犬瘟熱病毒、犬圓環病毒、犬星狀病毒5 種犬腹瀉病毒的PCR 檢測，以確診引發腹瀉的病原，現報告如下：

1 病犬基本情況

2018年12月，在動物醫院接診了一只6月齡雌性博美犬，體重為2.90 kg。該犬疫苗接種情況為：首免使用英特威二聯疫苗，第二、三、四次免疫使用英特威四聯苗及狂犬病疫苗。發病時間距最后一次免疫接種完成有30 d。就診前一日該犬出現嘔吐，由最初吐出食物到最后吐出白色帶泡沫的黏液，之后出現拉稀、血便。

2 臨床癥狀

體溫40.3 ℃（犬正常體溫為38.0～39.5 ℃），精神沉郁，嘔吐頻繁，鼻汗少，便血并帶有腥臭味，可視黏膜蒼白，被毛凌亂，喜臥。

3 5種致犬腹瀉病毒的PCR檢測

3.1 樣本采集及核酸提取 使用無菌棉簽蘸取適量糞便樣本于采樣管中，加入PBS 緩沖液，按照1∶5的比例稀釋，渦旋振蕩5 min，置于4 ℃離心機中以12 000 r∕min 離心15 min。離心后取上清液于新的1.5 mL EP管中，采用酚-氯仿法提取樣本中的總DNA，采用Trizol 法提取樣本中的總RNA，并反轉錄成cDNA。采用文獻報道的檢測方法，對CPV-2、CCoV、CDV、CAstV 和CanineCV 5 種病毒進行PCR 檢測，引物由上海生工生物公司合成，引物信息見表1。

表1 PCR擴增引物信息

PCR 反應體系為25 μL：2×rTaq PCR PreMix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 或cDNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL。反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30 個循環；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。反應結束后，取PCR 產物10 μL 用1.5%瓊脂糖凝膠電泳（120 V，30 min），觀察結果并拍照。

3.2 PCR 檢測結果 CCoV、CDV 和CAstV 均為陰性，CPV-2 和CanineCV 為陽性，部分檢測電泳圖見圖1、圖2。

圖1 CPV-2 PCR檢測凝膠電泳圖

圖2 CanineCV PCR檢測凝膠電泳圖

4 診斷結果

根據臨床檢查和PCR檢測結果，診斷該患病犬為CPV-2和CanineCV的混合感染。

5 結論與討論

本試驗對病犬進行了CPV-2、CCoV、CDV、CAstV和CanineCV 5種病毒的特異性PCR檢測，結果顯示為CPV-2 和CanineCV 的混合感染，排除了其他3種病毒的感染。目前國內對于犬腹瀉病原的診斷常限于CPV-2、CCoV 和CDV 等常見病原，對于新發病毒的檢測還重視不夠。本實驗室前期對四川省犬腹瀉糞便樣本的調查結果顯示：CanineCV 和CAstV 的檢出率分別為15.4%（32∕208）和39.3%（42∕107）[11]，因此對新發犬腹瀉病毒的檢測值得關注。

最近的研究顯示，CanineCV 常 與CPV-2 共同感染，在腸道疾病中起協同作用，從而導致臨床癥狀加重；或者在其他病原體損傷宿主腸道上皮細胞和淋巴細胞后，CanineCV致病性發生變化，從而加重病情[12]。2016年，孫文超等[13]首次在中國大陸從犬血清樣品中檢測出CanineCV病毒。2018年，嚴楠等[11]對四川省部分地區寵物醫院的犬腹瀉樣本進行CanineCV 熒光定量PCR 檢測，檢出率為15.4%（32∕208）。目前可以確定的是，CanineCV 可導致犬出現脈管炎、壞死性淋巴結炎等。美國于2016年、德國于2017年分別報道了CanineCV 與CPV-2混合感染導致犬急性出血性腹瀉和急性死亡的病例[12，14]。

CPV-2 能夠引起患犬急性腸炎、白細胞減少、嘔吐及幼犬的心肌炎等病癥。該病一年四季皆可發生，以發病急、病程短、傳染性強、死亡率高為特點，是危害我國養犬業最為嚴重的傳染病之一。目前對該病毒的防控主要以疫苗為主，商品化的CPV-2疫苗已有不少，即使使用了CPV-2疫苗進行免疫，也仍有可能出現CPV-2感染。免疫失敗的原因可能是疫苗方面的原因，如疫苗使用不當、流行毒株發生變異與疫苗毒株不匹配等；也有可能是免疫犬自身的原因，如營養不良、寄生蟲感染、患有免疫抑制性疾病等[15]。這些因素都會使CPV-2 的免疫接種不可靠，這對CPV-2的防控提出了新的考驗。有趣的是，本次接診的患犬根據其免疫記錄可知其已經過4次疫苗免疫，其發病時間距最后一次免疫接種完成僅有30 d，即使接種了CPV-2 疫苗，也仍然出現了CPV-2 感染。雖然無法確定兩種病毒感染的先后順序，但該犬存在感染CanineCV后自身出現免疫抑制，最后造成CPV-2感染的可能性。這也提醒我們有必要將CanineCV 作為犬腹瀉病原診斷的一個重要檢測項目。