番茄ShARPC5抗白粉病功能分析

馮嬋婧, 孫廣正, 王陽, 馬青

番茄抗白粉病功能分析

馮嬋婧, 孫廣正, 王陽, 馬青

（西北農林科技大學植物保護學院/旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌 712100）

【】白粉?。╬owdery mildew）是番茄生產上的重要病害，嚴重影響番茄的產量。番茄基因組測序工作的完成為抗病基因挖掘提供了重要的信息資源。ARP2/3（actin-related protein 2 and 3）復合體是肌動蛋白微絲骨架動力學的主要調控因子，能夠參與包括響應外界脅迫等多種細胞學過程。本研究通過對番茄（actin-related protein C5）進行克隆和抗病功能驗證，為番茄基因組信息完善、抗病機制解析和分子育種等方面打下基礎。從番茄LA1777（）cDNA中PCR擴增，使用DNAMAN 6.0進行多序列比對；MEGA 6.0構建系統發育樹；應用在線工具ProtComp v. 9.0進行亞細胞定位預測。利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）比較接種白粉菌（，-Lz）后高感品種Moneymaker（MM）和高抗品種LA1777中番茄的表達特征，分析白粉菌侵染與表達的相關性。應用病毒誘導的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）技術進一步驗證該基因在番茄中的抗病功能，觀察沉默株和野生型株系接種后表型變化，利用臺盼藍和DAB染色法檢測植株產生過敏性壞死和H2O2的能力，并檢測沉默后一些與植物抗病相關標記基因的表達變化。采用農桿菌浸花法遺傳轉化擬南芥過表達植株，觀察轉基因和野生型株系接種后表型變化，并統計單病斑分生孢子數。從番茄品種LA1777中克隆到，編碼132個氨基酸殘基，包含一個保守的P16-Arc結構域。與番茄MM-白粉菌親和互作相比，非親和互作的番茄品種LA1777在接種白粉菌后，顯著上調表達，尤其在接種后18 h。在番茄上沉默能夠增加植株對白粉菌-Lz的敏感性，防衛反應基因顯著下調表達。組織學觀察顯示與對照植株相比，沉默植株接種后誘導產生過敏性壞死和活性氧減少。在煙草上瞬時過表達能夠誘導產生壞死斑。相反，在擬南芥上過表達能夠增加植物的抗病性。是番茄響應白粉菌侵染的重要基因，可減輕番茄白粉病的發病程度，在番茄抗白粉病機理研究方面具有較大的應用價值，可作為番茄抗白粉病分子育種的一個候選基因。

番茄白粉病；抗病性；肌動蛋白微絲骨架；ARP2/3復合體；ARPC5

0 引言

【研究意義】番茄白粉菌（）是一種活體營養寄生菌，能在番茄葉表面、背面、葉柄和花萼上產生白粉病斑，但不侵染果實。它通過影響植物的葉片使葉片失去生長活力，能導致產量（果實）損失高達50%[1]。目前，在溫室和大田中對番茄白粉病的控制主要依賴于化學農藥。然而，化學藥劑不僅增加病原菌抗藥性，也通過果實中農藥的殘留對環境和人體造成危害[2]。大多數栽培番茄易受白粉菌侵染，控制番茄白粉病的有效策略是培育抗性品種?！厩叭搜芯窟M展】目前，野生番茄品種中一些抗性基因已經被鑒定并轉入栽培番茄，包括5個顯性基因（、、、、）、1個隱性基因（）和3個多基因抗性數量性狀基因座（quantitative trait locus，QTLs）[3]。研究發現抗性基因介導的對番茄白粉病的抗病性與過敏性壞死（hypersensitive response，HR）有關[3]。當細胞產生HR時，未受感染的鄰近細胞顯示肌動蛋白微絲（actin filaments，AFs）聚集現象[4]。AFs是形成肌動蛋白細胞骨架的主要結構元件，既能將質膜和細胞壁上的物質通過囊泡的靶向輸送轉運到生長位點，也能特異性的轉運防衛相關物質形成抵御病原菌侵入的屏障[5-6]。肌動蛋白組成的關鍵步驟是肌動蛋白成核，而肌動蛋白成核在很大程度上受ARP2/3（actin-related protein 2 and 3）復合體的活性調節，這能確保AFs正確形成[7]。ARP2/3復合體包含7個亞基，分別為ARP2、ARP3、ARPC1-ARPC5。該復合體是一種高度保守的肌動蛋白調節劑，能核化與質膜區域相關的分支狀的肌動蛋白網絡，也能促進特定細胞器和細胞骨架的耦合、在核內和細胞質間提供某種形式的物理連續性[8]。ARP2/3復合體不同亞基在發育過程中起著不同的作用。例如，ARP2對膜結合是必不可少的[9]；ARP3在體內定位于肌動蛋白成核部位[10]；ARPC1或ARPC2的缺失導致釀酒酵母的致死性和生存能力嚴重下降；擬南芥（）ARP3或ARPC5的功能喪失導致根毛短小且彎曲[11-12]；ARPC4是控制ARP2/3復合體組裝和穩定性的最關鍵亞基[9]；ARPC4和ARPC5在介導與ABA-和H2O2-誘導的保衛細胞肌動蛋白動力學中起關鍵作用[13]。【本研究切入點】ARP2/3復合體的亞基除了能夠參與植物生長發育和結構組成，較少的研究證實其參與植物的抗病性[14]。西北農林科技大學植物保護學院植物病害綜合治理團隊發現白粉菌（-Lz）與番茄Moneymaker（MM）（）形成親和互作，而與番茄LA1777（）非親和互作，在非親和互作體系中番茄受白粉菌誘導顯著上調表達，推測其可能參與抗白粉菌侵染的過程。【擬解決的關鍵問題】通過對進行克隆、生物信息學分析、差異性誘導表達、VIGS分析、煙草瞬時表達、擬南芥過量表達以及酵母突變體異源互補等方面的研究，為進一步揭示其抗病機制打下基礎。

1 材料與方法

試驗于2016—2018年在西北農林科技大學植物保護學院植物病害綜合治理實驗室完成。

1.1 試驗材料

番茄白粉菌菌株-Lz采自甘肅省蘭州市，分離保存在栽培番茄（Moneymaker，MM）上，生長溫度（20±3）℃，相對濕度（70±5）%，16 h光照/8 h黑暗。

番茄MM和-Lz構成親和互作體系，LA1777和-Lz構成非親和互作體系。番茄種子消毒后，在25℃、95%相對濕度和3 500 lx光照下生長[15]。生態型擬南芥Columbia-0（Col-0）購自擬南芥生物資源中心（Ohio）。按照WU等[16]的方法對擬南芥種子進行消毒和催芽。發芽和生長分別在21℃和19℃生長室，8 h光照/16 h黑暗，相對濕度為70%。

1.2 生物信息學分析

以擬南芥ARPC5（序列號：NP_567216.1）氨基酸序列作為指示查詢序列在SGN Tomato Combined數據庫（http://solgenomics.net/tools/blast/）TBLASTN程序、GenBank的BLASTN（http://blast.ncbi.nlm.nih. gov/blast.cgi）程序搜索同源序列。利用NCBI（http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）的BLAST程序和基因開放式閱讀框（ORF）分析的cDNA序列。使用DNAMAN6.0進行多序列比對。用Mega 6.0軟件的鄰近法進行系統發育分析。蛋白質結構域預測使用RCSB PDB蛋白質數據庫（https://www.rcsb. org/）。利用Protcomp程序（v.9.0，http://linux1.softberry. com/berry.phtml）預測ARPC5蛋白亞細胞定位。

1.3 煙草瞬時過表達

利用ARPC5-TF（5′-ATGGCTGAGATTGTCGAAGCAGATA-3′，下劃線為載體同源臂）和ARPC5-TR（5′-TCACACAGTATTCACAGTGTCAGCA-3′，下劃線為載體同源臂）擴增的ORF，將擴增產物同源重組到PGR106載體的I酶切位點，由CaMV35S啟動子驅動。參照LU等[17]的方法將重組質粒pGR106:或pGR106:（陰性對照）電轉至根癌農桿菌GV3101中，將轉化子處理后在黑暗中培養2—3 h，然后注射到煙草葉片，接種后5—7 d對表型進行觀察。

1.4 病毒誘導基因沉默

利用ARPC5-VF（5′-CGAAGGCATAATCACAAGAATCG-3′，下劃線為載體同源臂）和ARPC5-VR（5′-CAGCAAGACAACGCAGTATGCA-3′，下劃線為載體同源臂）擴增基因片段，重組TRV2:質粒。參照LIU等[18]的方法，將TRV1和TRV2:農桿菌混合菌液注射到番茄LA1777植株葉片。TRV2:（序列登錄號：NM 001247166）作為陽性對照。接種病毒30 d，觀察沉默植株的光漂白癥狀。在葉片上接種-Lz 7 dpi（days post inoculation）觀察葉片侵染表型。參照SUN等[19]的方法在7—14 dpi統計病害嚴重度，計算病情指數（DI），病情指數（DI）＝[Σ（某一病害嚴重度的發病植物葉片數×病害嚴重度）/（調查總植株葉片數×最高病級）]×100。利用THORDAL- CHRISTENSEN等[20]的方法對植物葉片進行3,3-二氨基聯苯胺（DAB）和臺盼藍染色，分別于6、18、24、48、72 hpi（hours post inoculation）在分生孢子侵染點處檢測植物產生HR和H2O2的形成率，形成率=（HR或H2O2在侵染點處形成個數/總侵染點數）×100%。

1.5 擬南芥過量表達

利用ARPC5-AF（5′-ATGGCTGAGATTGTCGAAGCA-3′，下劃線為載體同源臂）和ARPC5-AR（5′-TCACACAGTATTCACAGTGTCAGCA-3′，下劃線為載體同源臂）擴增的ORF區段，重組到雙元載體pCAMBIA3301的HI限制酶（Promega）位點，由CaMV35S啟動子驅動。將pCAMBIA3301-轉化到農桿菌GV3101，然后通過浸花法將其導入Col-0野生型擬南芥中[21]。轉基因T1代植株用含卡那霉素（25 μg·mL-1）的0.5×MS培養基/1%瓊脂進行陽性篩選。催芽2周后，將抗卡那霉素幼苗移栽到土壤中。從自交的T1株系中獲得卡那霉素抗性的T2代植株，T2代植株生長90 d（每個處理3—4株），然后測定轉基因株系對-Lz的抗性。同時，上述T2代植株通過使用特異性引物（LP-CGGTT CTCCAAATGAAGACTT，RP-AATTGAGACTTTTC AAAGGTAATA）PCR檢測確認為轉基因植株。為了量化病原菌生長狀況，在7 dpi統計每個病斑的分生孢子數。

1.6 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析

為了評估在番茄MM和LA1777上接種病菌后表達量的變化，在0、12、18、24、36、48、72和96 hpi采樣，提取RNA，反轉為cDNA，然后進行qRT-PCR。VIGS試驗中，在0、24、48和72 hpi檢測沉默效率以及（）和（）、（）表達量，作為內參基因。擬南芥轉基因植物在0、24、48、72 hpi取樣進行qRT-PCR，以為內參基因（表1）。

使用Biozol總RNA提取試劑盒提取總RNA，Qubit 2.0 Fluorometer計算RNA濃度。使用單鏈cDNA合成試劑盒和oligo (dT)18引物將總RNA（1 μg）用于第一鏈cDNA合成。采用IQTM5 real-time PCR系統進行qRT-PCR擴增。在qRT-PCR反應中，將2 μL總cDNA添加到含有10 μL 2×SYBR混合液的20 μL PCR反應液中，上下游引物各0.4 μL（10 μmol·L-1），dH2O 7.2 μL。qRT-PCR反應條件：在95℃預變性10 min，隨后在95℃變性15 s，40個周期，55℃退火30 s，72℃延伸30 s。定量結果通過2-??CT法計算。試驗進行3次生物學重復。

表1 qRT-PCR反應中的基因及引物

1.7 數據分析

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析，應用Duncan氏新復極差法進行差異顯著性檢驗，＜0.05表示兩組處理間差異顯著。

2 結果

2.1 番茄ARPC5鑒定和序列分析

利用擬南芥作為探索基因，從番茄LA1777中克隆到767個核苷酸的基因片段。（Solyc01g090450.3）的開放閱讀框（399 bp）編碼132個氨基酸，分子量約為15 kD。ARPC5與ARPC5和ARPC5具有高度的序列相似性（圖1），其同源性分別為86.36%和97.73%。SMART和RCSB PDB程序分析顯示，ARPC5具有保守的Pfam:P16-Arc結構域（氨基酸2—131），其遺傳關系與ARPC5和ARPC5密切相關。ProtComp 9.0程序預測ARPC5蛋白具有不同的細胞定位，包括質膜、胞外、細胞質、線粒體、內質網、過氧化物酶體、高爾基體和葉綠體。

2.2 ARPC5差異性誘導表達

為了確定的表達量，用qRT-PCR檢測番茄與病原菌互作時的mRNA表達量。在非親和互作中，與0 hpi相比，在18—36 hpi顯著上調表達（＜0.05），在18 hpi的表達量達到峰值（圖2），為對照的6倍。此外，在親和互作中，表達量在18 hpi顯著高于對照（0 hpi），12 hpi以及36—96 hpi表達量顯著低于對照（＜0.05）。

2.3 沉默ShARPC5對番茄抗病性的影響

為了確定在病原菌侵染番茄中的作用，利用煙草脆裂病毒（，TRV）誘導沉默驗證基因功能。接種TRV2:的葉片在接種后30 d出現光漂白的表型（圖3-A），證實TRV-VIGS沉默系統的穩定性。與對照相比，沉默植株顯示出明顯的白粉病病斑，沉默株的病情指數更高，在7和14 dpi分別達到6.0和13.1（圖3-B）。在24 hpi的沉默效率達到78%（圖3-C），且沉默株中顯著下調表達（＜0.05）。

A：ShARPC5的多重氨基酸序列比對以及氨基酸序列的特征。氨基酸序列中黑色部分表示同源性達到100%，粉色表示同源性≥75%，青色表示同源性≥50% Multiple protein sequence alignment of ShARPC5 and characterized members of ARPC5 proteins. Black boxes indicate regions of 100% homology, pink boxes indicate ≥75% homology level, and cyan boxes highlight ≥50% homology level；B：ShARPC5系統進化分析，在不同的基因名稱后顯示各基因登錄號Evolutionary analysis of ShARPC5. Accession numbers are shown after the gene names

圖2 qRT-PCR分析番茄葉片ARPC5表達量

A：不同處理（對照株、沉默ShPDS植株、沉默ShARPC5植株）接種白粉菌7 d后的表型觀察Infection phenotypes of CK (TRV2), TRV2:ShPDS, TRV2:ShARPC5 tomato leaves at 7 dpi；B：對照株和沉默ShARPC5植株在接種白粉菌后7和14 d的病情指數Disease indexes of CK and TRV2:ShARPC5 plants at 7 and 14 dpi, respectively；C：對照株和沉默株接種白粉菌后24 h ShARPC5和PRs基因表達量變化Relative mRNA transcript levels of ShARPC5 and PRs at 24 hpi (determined by qRT-PCR)

2.4 沉默ShARPC5對番茄防衛反應的影響

通過顯微觀察病原菌侵染番茄葉片后植物上產生的HR和H2O2變化進一步研究如何參與番茄抗病性。在48和72 hpi，沉默的植株上HR形成率顯著低于對照，分別為26%和36%（圖4-A）；在72 hpi，沉默株上的H2O2形成率顯著低于對照（＜0.05），僅為34%（圖4-B）。

2.5 煙草瞬時表達ShARPC5分析

為了進一步檢測的功能，基于PVX瞬時植物表達系統，使用本氏煙（）評估是否誘導植物細胞壞死。用表達PGR106:的農桿菌侵染煙草葉片不能誘導產生細胞壞死，但是用轉PGR106:的農桿菌侵染煙草葉片產生明顯的細胞壞死（圖5）。同樣，用表達PGR106:的農桿菌侵染葉片也能產生壞死。

2.6 過表達ShARPC5對擬南芥抗病性的影響

為了檢測ARPC5在擬南芥上的抗病性，分別在野生型Col-0擬南芥和野生型Col-0轉化pCAMBIA3301-植株上接種-Lz。過表達（over-expression，OE）擬南芥植株抗病性增強，植株葉片上幾乎未發現白粉病病斑（圖6-A）。顯微觀察發現，與對照相比，在野生型Col-0轉化pCAMBIA3301-植株上單個病斑分生孢子數顯著減少（圖6-B，＜0.05）。

3 討論

通過核苷酸和氨基酸序列比對，表明番茄ARPC5與擬南芥和煙草ARPC5具有高度相似性，這些蛋白具有類似的保守的P16-ARC結構域，推測ARPC5在這3個物種上行使相似的功能，包括對生物和非生物脅迫的響應。作為植物的防御信號，本研究結果證明了番茄在遭受白粉菌侵染時所起的作用。

A：對照植株和沉默植株接種白粉菌后24、48和72 h壞死產生率HR production rate of TRV2 (CK) or TRV2:ShARPC5 tomato leaves at 24, 48, and 72 hpi, respectively；B：對照植株和沉默植株接種白粉菌后24、48和72 h H2O2產生率H2O2 production rate of CK or TRV2:ShARPC5 tomato leaves at 24, 48, and 72 hpi, respectively

A：農桿菌介導的瞬時表達在接種7 d后葉片的表型Leaf phenotypes at 7 dpi with Agrobacterium tumefaciens-expressing constructs；B：A中的煙草葉片用1﹕1的乙醇和冰醋酸脫色后的表型Leaf inoculation phenotypes after clearing in ethanol/acetic acid (1﹕1, v/v) for 2 days

A：野生型Col-0轉化pCAMBIA3301-ShARPC5植株上接種On-Lz 7 d后表型觀察Infection phenotypes of WT Col-0 transgenic plants expressing pCAMBIA3301-ShARPC5. Images were taken at 7 dpi；B：野生型Col-0轉化pCAMBIA3301-ShARPC5植株上接種On-Lz 7 d后植株上單病斑分生孢子數Quantitative assessment of conidiation on WT Col-0 plants expressing pCAMBIA3301-ShARPC5. Images were takenat 7 dpi

為了確定ARPC5是否參與植物與病原菌的互作過程，本研究檢測了番茄被白粉菌侵染后植物中表達量的變化。在病原菌侵染初期，非親和互作的番茄能快速上調表達，尤其在18 hpi，可能在早期的激活防御信號中，表達量的增加與病原菌初生吸器的大量形成有關。相反，在親和互作體系中，除了18—24 hpi，其余時間點的表達量較對照均顯著下調。因此，ARPC5可能是番茄抗病的關鍵調節因子。

VIGS是一種廣泛使用的反向遺傳學技術，特點是使用簡單、快速和穩定[22]。沉默后，沉默效率不能達到100%可能與農桿菌的轉化效率、病毒的感染效率、沉默片段的選擇以及該基因在植物發育中的多種功能有關[23]。沉默株更加感病說明ARPC5是ARP2/3復合體介導的番茄抗白粉病的關鍵亞基。研究表明該抗病性可能與ARP2/3復合體介導的肌動蛋白聚合有關，該復合體也在植物防御信號級聯反應中起作用[24-25]。此外，擬南芥異源過表達時，轉基因植株比對照Col-0植株的抗病性更強，說明ARPC5蛋白功能具有保守性。并且沉默后，植物的長勢并不會受影響，因此該基因可以作為一個抗番茄白粉病育種的優勢抗病基因。

植物細胞微絲骨架能在病原菌侵染初期作出快速識別和反應。如ADF7能介導微絲骨架的動態變化，通過小麥積累ROS和產生HR抗條銹病[26]。本研究發現番茄LA1777植株接種白粉菌后能快速誘導產生HR和H2O2，而沉默株產生HR和H2O2遲緩，抗病能力減弱。事實上，微絲骨架的重排與激活植物防衛信號有關，包括氧迸發和誘導細胞壞死、抗病基因的表達、侵染點處乳突的形成等[27]，推測ARP2/3復合體能通過調節HR和H2O2積累量發揮抗病作用。微絲骨架可以調節細胞器的移動[28]，而葉綠體、線粒體和過氧化物酶體等細胞器是產生活性氧的主場所[29]，因此可能在ETI途徑中通過介導細胞器的移動積累活性氧。沉默后，沉默株上的表達量顯著下調表達，說明在白粉菌侵染植株的早期，植株能夠激活先天免疫反應通過PTI途徑阻止病原菌的侵染。本研究闡明了在番茄響應生物脅迫時作出的反應，包括產生ROS和HR，以及誘導病程相關蛋白基因（）的表達。結合番茄的功能研究[14]，說明ARP2/3復合體在病原菌侵染過程中參與抗病作用。

4 結論

番茄ARPC5包含一個保守的P16-Arc結構域。ARPC5可能通過誘導植物產生過敏性壞死和活性氧以及調節防衛基因的表達參與番茄抗白粉病，是一個潛在重要的抗病基因。

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Functional Analysis of GeneInvolved in Tomato Resistance to Powdery Mildew

FENG ChanJing, SUN GuangZheng, WANG Yang, MA Qing

(College of Plant Protection, Northwest A&F University/State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas, Yangling 712100, Shaanxi)

【】Powdery mildew is an important disease in tomato production, and seriously affects the yield of tomato. Genome sequences ofprovide valuable information resources for disease-resistant gene searching. The actin- related protein 2 and 3 complex (ARP2/3 complex), a key regulator of actin cytoskeletal dynamics, has been linked to multiple cellular processes, including those associated with response to stress. In this study, tomato, encoding a subunit protein of the ARP2/3 complex, was cloned and identified for disease resistance. The results will lay a foundation for upgrading tomato genomic information, further studying the resistance mechanism and molecular breeding.【】was annotated from the genomic databases and cloned from tomato LA1777 (). DNAMAN 6.0 was used for multiple sequence alignment and MEGA 6.0 was used for constructing phylogenetic tree. The prediction of protein subcellular localization was performed using ProtComp v. 9.0. The qRT-PCR was used to compare the expression of(-Lz). The correlation between-Lz infection andexpression was analyzed. The function ofinvolving in tomato resistance to-Lz was further verified by the technology of virus-induced gene silencing (VIGS). The phenotypic changes of-silenced and wild-type lines were observed. Hypersensitive response (HR) and H2O2production were detected by trypan blue and DAB staining, respectively, and the expression of some marker genes related to plant disease resistance was assayed in-silenced plants. Additionally, genetic transformation ofwas conducted by-mediated floral-dip method. The phenotypic changes of transgenic and wild-type lines were observed, and the number of conidia per lesion was also counted.【】Thewas identified and characterized.encodes a 132-amino-acid protein possessing a conserved P16-Arc domain.Compared with the compatible interaction between tomato MM (Moneymaker) and-Lz, the expression ofwas significantly up-regulated in incompatible interaction between tomato LA1777 and-Lz, especially at 18 hpi. Silencing of-Lz. The expression of, a maker gene related to signal regulation, was significantly down-regulated after silencing of. The histological observation showed that the induction of hypersensitive cell death and the generation of reactive oxygen were reduced in silenced-tomato plants compared with wild types. Transient over-expression ofConversely, over-expression of, followed by inoculation with-Lz, showed enhanced resistance.【】is animportant gene which can reduce the incidence of tomato powdery mildew, and has a great application value in themechanism study of tomato resistance to powdery mildew. At the same time, it can be used as a candidate gene for molecular breedingof tomato powdery mildew resistance.

tomato powdery mildew; resistance; actin cytoskeleton; ARP2/3 complex; ARPC5

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.01.006

2019-07-10；

2019-08-21

國家自然科學基金（31571960）、陜西省重點產業創新鏈項目（2019ZDLNY03-07）、西北農林科技大學試驗示范站（基地）科技創新與成果轉化項目（2018-10）、高等學校學科創新引智計劃（B07049）

馮嬋婧，E-mail：fcj413@163.com。通信作者王陽，E-mail：wangyang2006@nwsuaf.edu.cn。通信作者馬青，E-mail：maqing@nwsuaf.edu.cn

（責任編輯 岳梅）