黃瓜CsRPL1/2的克隆及其功能分析

宋維源，侯鈺，趙劍宇，劉小鳳，張小蘭

黃瓜的克隆及其功能分析

宋維源，侯鈺，趙劍宇，劉小鳳，張小蘭

（中國農業大學園藝學院，北京 100089）

【】是擬南芥果實發育調控網絡中的重要基因，參與胎座框的形成。同源克隆黃瓜的，進行表達模式分析，在擬南芥中異源過表達，探究的生物學功能。根據擬南芥信息在黃瓜基因組數據庫中比對，克隆得到黃瓜；利用MEGA5.2對CsRPL與其他物種同源蛋白進行氨基酸序列比對；利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）及原位雜交技術檢測在黃瓜中的表達模式；在擬南芥中異源表達，并對轉基因植株進行表達和表型分析。在黃瓜中存在兩個，分別命名為和，均含有BELL-Domain、Homeodomain保守域和兩個EAR-Motif。在黃瓜各個部位均有表達，在開放的雄花中表達量最高，且在果實生長前期，其表達量隨著果實的發育逐漸降低；在黃瓜各部位表達量均顯著低于。原位雜交顯示在黃瓜果實的胎座框中表達，且雜交信號在莖尖分生組織（SAM）的Central zone（CZ）區域富集。擬南芥異源過表達轉基因植株的果莢變短，花粉育性降低，且種子發育受到抑制。參與生殖器官的發育，且可能存在功能冗余，在正常生長條件下，優先發揮功能。相比于，的功能并不完全保守。

黃瓜；；轉基因植株；表達分析；果實

0 引言

【研究意義】黃瓜（L.）作為一種世界性蔬菜，在我國也有相當大的種植面積。2017年我國黃瓜栽培面積達1.24×106hm2，產量達6 387.5萬t，分別占全世界黃瓜栽培總面積和總產量的54.5%和77.46%（FAO數據）。黃瓜最主要的商品器官是果實，屬于瓠果，由子房下位的三心皮合生雌蕊發育而來，心皮發育對于黃瓜產量和外觀品質至關重要。而作為模式植物——擬南芥的果實屬于角果類型，是擬南芥果實發育調控網絡中的重要基因，參與胎座框的形成[1]。因此，研究黃瓜在果實生長發育中的作用對黃瓜育種具有重要意義。【前人研究進展】1984年，Scott等[2]運用分子生物學手段，首次發現了導致果蠅身體的一部分轉換為另一部分（例如果蠅的觸角轉變成足或翅）的同源異形基因。隨后研究發現，這些同源異形基因都編碼一段具有螺旋-轉角-螺旋（helix-turn-helix）特征的保守氨基酸序列，并命名為同源域（homeodomain HD）。植物中的許多HD同源基因已經被鑒定出來[3-4]，其中一類特殊的同源基因家族TALE[5-6]（three-amino-acid-loop- extension）通過編碼轉錄因子在植物生長發育過程中發揮重要調控功能。TALE家族首個基因于1991年在玉米中被報道，并命名為[7]（），屬于KNOX（KNOTTED-like homeodomain）亞家族，另外，TALE還包含BELL（BEL1-like homeodomain）亞家族。BELL家族蛋白除了具有標志性的Homedomain結構域[5-6]，還具有SKY-Domain和BELL-Domain結構域，兩者合稱為MID（MEINOX interacting domain），可以與KNOX蛋白的MEINOX結構域結合形成異源二聚體，進而調控下游基因的表達[8-10]。擬南芥中，BELL亞家族一共包含13個成員，其中（）為該家族中首個發現的基因[11]。（），又名（）、（）、（）、（）同屬于該家族，并且在植物生長發育多個方面行使重要功能。莖尖分生組織（SAM）是一群未分化的細胞，在植物生長過程中分化出各種側生器官的同時也保持著自身數量穩定不變[12-14]。（）是分生組織的標記基因，基因功能缺失強突變體表現為缺少SAM，進而不能產生側生器官[15-16]。也被證明在分生組織保持中發揮作用，功能缺失會加重弱突變體的表型，后續研究指出與和（）都存在直接互作參與分生組織保持[17-18]。在植物株型方面，突變體表現出植株矮小、果莢變短、節間不規則以及側生器官增多的表型[17,19]，表明在SAM中調控側生器官的分化。同樣在植物從營養生長到生殖生長這一轉變過程中發揮作用。（）和的雙突變體植株不能開花，且雙突中成花關鍵基因如（）、（）和（）的表達量下調[20-21]。在（）和雙突變體背景下過表達可以使植物恢復開花，但過表達（）卻不能，表明需要（）和來行使功能[21-22]。在雌蕊發育過程中，調控擬南芥胎座框形成，與共同限制（）（）在開裂區表達，從而形成木質層與離層，保證果實的正常開裂[1]。【本研究切入點】的基因功能在擬南芥上研究較為深入，在植物生長發育過程中從器官起始到成花轉變再到果實發育都發揮了重要作用。黃瓜作為重要蔬菜作物，其果實類型為瓠果，在黃瓜生長發育中發揮的作用目前未知。【擬解決的關鍵問題】本研究利用同源序列比對的方法克隆得到黃瓜中的同源基因，并利用時空表達分析、遺傳轉化擬南芥等方法初步探究在黃瓜生殖生長中的功能。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 以黃瓜自交系461為試驗材料。55℃溫湯浸種后，于28℃暗培養催芽2 d，種子根約1 cm時播種于營養缽，待黃瓜幼苗長到三葉一心時定植于溫室中。取黃瓜30 d左右苗齡植株的莖、葉、生長點，以及盛果期的雄花芽、雌花芽、開花當天的雄花、開花當天的雌花、3 mm果、1 cm果、2 cm果、3 cm果液氮速凍后，于-80℃超低溫冰箱保存備用。

以擬南芥野生型Columbia（Col）為試驗材料。0.03% TritionX-100/75%酒精消毒后播種于MS固體培養基上，4℃黑暗條件下低溫處理4 d，轉入16 h光照/8 h黑暗24℃環境中培養。約10 d待其長出真葉后移栽到土壤培養基質（花卉營養土﹕草炭﹕蛭石≈1﹕1﹕1）中，并進行后續試驗。

1.1.2 試劑與菌株 提取植物總RNA試劑Trizol采購于北京華越洋生物科技有限公司；限制性內切酶Ⅰ、Ⅰ采購于New England Biolabs公司；Taq DNA聚合酶、同源重組酶采購于北京艾德萊生物科技有限公司；High-Fidelity DNA聚合酶采購于北京聚合美生物科技有限公司；RT-PCR試劑盒采購于北京天根生化科技有限公司；A-Tailing Enzyme、pMD19-T Vector、熒光定量試劑盒采購于Takara公司；原位雜交探針合成試劑盒DIG RNA Labeling Kit（SP6/T7）采購于Roche公司；亞歷山大染液采購于Solarbio公司；所用大腸桿菌感受態DH5α、根癌農桿菌感受態EHA105與植物過表達載體pSuper1300為本實驗室保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物各部位RNA的提取與反轉錄 根據華越洋公司提供的Trizol說明書提取黃瓜各部位RNA，利用天根公司反轉錄試劑盒合成單鏈cDNA，-80℃保存備用。

1.2.2 黃瓜將擬南芥BELL亞家族基因蛋白序列在黃瓜數據庫中（http://www.cucurbitgenomics. org/）進行BLAST比對得到黃瓜BELL亞家族基因蛋白序列。用MEGA 5.2對擬南芥與黃瓜BELL亞家族基因蛋白序列進行系統發育樹分析[23]。其中與擬南芥（）同源性較高的為（），同源性次之的為（）。根據的CDS序列，利用Primier 5.0設計克隆引物-F/R、-F/R（引物序列見表1）。用高保真聚合酶進行PCR擴增。擴增程序為95℃預變性2 min；94℃變性25 s；58℃復性30 s；68℃延伸30 s，35個循環；68℃延伸5 min。經電泳檢測，瓊脂糖凝膠回收產物3′端加A后連接pMD19-T載體。冰浴20 min，42℃熱激2 min，轉化大腸桿菌感受態DH5α。篩選陽性克隆送北京擎科新業生物技術有限公司測序。

1.2.3 黃瓜CsRPL1/2蛋白保守域分析 在http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/網站分析的基因結構。用MEGA 5.2中的Clustal W對包括在內的13種同源基因的蛋白序列進行比對[23]。及同源蛋白3個域的氨基酸保守性利用在線工具（http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）進行分析。

1.2.4 黃瓜過表達載體構建及遺傳轉化擬南芥 用Ⅰ、Ⅰ限制性內切酶對pSuper1300植物雙元表達載體進行雙酶切。以-pMD19-T、-pMD19-T質粒為模板，分別利用引物- 1300-F/R、-1300-F/R為基因的CDS序列添加同源臂接頭。利用同源重組試劑盒對已切開的載體與帶有同源臂接頭的基因片段進行同源重組，轉化大腸桿菌感受態DH5α，篩選陽性克隆送北京擎科新業生物技術有限公司測序。提取測序正確的-1300、-1300菌液質粒，凍融法轉化至根癌農桿菌EHA105感受態中，PCR鑒定后將攜帶質粒的農桿菌通過農桿菌蘸花法遺傳轉化擬南芥。

1.2.5 轉基因擬南芥陽性植株篩選與鑒定 收獲農桿菌侵染后的擬南芥T0代植株種子，消毒后播種于含25 mg?L-1潮霉素的MS固體培養基上培養篩選。7—10 d后，將根生長較長且已長出真葉的陽性苗移栽到土壤培養基中。1—2周后提取擬南芥葉片DNA，利用引物35S-F、-OV-R、-OV-R進行PCR鑒定，其中35S-F為載體35S啟動子上特異片段，-OV-R、-OV-R分別為、CDS序列上特異片段。對陽性轉基因擬南芥植株進行單株收種，再次播種后即為T2代轉基因植株。對T2代轉基因植株進行表型觀察和表達分析。

1.2.6 擬南芥花粉活力染色檢測 在上午10：00左右選取擬南芥植株主莖上完全開放成“十字形”的花10朵，置于1.5 mL離心管中，冰上保存。在載玻片上滴一滴亞力山大染液；解剖鏡下小心剖去花瓣、萼片與雌蕊，將花藥浸沒在染液中并用鑷子輕輕擠壓使花粉散出；立即蓋上蓋玻片在顯微鏡下觀察。有活力的花粉被染成紅色，沒有活力的花粉不被染色呈無色。選取顯微鏡下5個視野，統計沒有活力花粉占視野中總花粉比例。

1.2.7 實時熒光定量PCR 提取黃瓜幼莖、幼嫩葉片、頂點、雌花芽、雄花芽、開放當天雄花、開放當天雌花、3 mm果實、1 cm果實、2 cm果實和3 cm果實的RNA，并反轉錄為cDNA；提取擬南芥col及相關轉基因株系花序的RNA，反轉錄為cDNA。以黃瓜（）和擬南芥（）分別為內參基因。依照TB Green Premix Ex Taq II試劑盒（Takara）說明進行加樣與PCR。選用10 μL反應體系，PCR反應程序為：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，58℃復性 34 s，40個循環。用2-△△CT分析方法計算基因相對表達量。試驗采用3次技術重復，3次生物學重復。

1.2.8 mRNA原位雜交 取20 d黃瓜苗的生長點和盛果期1 cm的果，立即置于FAA固定液中4℃固定，并用石蠟包埋。選取（330 bp）和（309 bp）的特異片斷設計上、下游引物，并在上、下游引物的5′端分別添加SP6和T7接頭。利用DIG RNA Labeling Kit（SP6/T7）試劑盒合成探針，其中SP6探針為負對照，并利用點雜交的方法檢測探針質量。將樣品切成10 μm厚的切片，置于載玻片上，42℃烘片4—12 h，將烘干樣品進行脫蠟、去蛋白、乙酰化、脫水處理后，敷探針50℃過夜，使探針與目的片段結合（此過程完成前所有步驟均要求RNase-free環境）。洗去探針，封閉處理后與抗體共孵育，之后洗去抗體用BICP（5-Bromo-3-Indolyl-4-Chloro Phosphate ）和NBT（Nitroblue tetrazolium chloride）進行染色處理（避光），2—3 d后用顯微鏡觀察樣品組織染色情況，并拍片[24]。

表1 引物序列

2 結果

2.1 黃瓜CsRPL1/2的克隆

將擬南芥BELL亞家族基因蛋白序列比對到黃瓜庫中，發現黃瓜中存在11個BELL亞家族基因。系統發育樹分析發現黃瓜中和與擬南芥位于同一分枝，蛋白序列相似度分別為41.43%和37.97%，依次命名為和（圖1-A）。通過同源克隆得到黃瓜的CDS序列，與黃瓜基因組庫（http:// www.cucurbitgenomics. org/）中序列一致。的CDS長度分別為1 443 bp和1 386 bp。基因結構與擬南芥相似，都含有3個內含子和4個外顯子，且第3個外顯子長度高度保守（圖1—B）。其中第3外顯子長61 bp，第3外顯子長63 bp。

A：黃瓜與擬南芥BELL亞家族基因蛋白序列系統發育樹分析，紅色實線框內為AtRPL和與其同源的CsRPL1/2。BEL1（AT5G41410）；ATH1（AT4G32980）；BLH1（AT2G35940）；BLH2/SAW1（AT4G36870）；BLH3（AT1G75410）；BLH4/SAW2（AT2G23760）；BLH5（AT2G27220）；BLH6（AT4G34610）；BLH7（AT2G16400）；BLH8/PNF（AT2G27990）；BLH9/RPL（AT5G02030）：BLH10（AT1G19700）；BLH11（AT1G75430）。B：紫色方塊代表5′UTR、3′UTR；橙色方塊代表外顯子；直線代表內含子

2.2 黃瓜CsRPL1/2蛋白序列分析

利用NCBI網站進行BLAST得到除黃瓜外13個物種同源蛋白序列，并用MEGA 5.2中的Clustal W對蛋白序列進行比對。結果表明，同源基因都含有BELL-Domain和Homeodomain兩個保守域，且保守域內氨基酸在不同物種中高度保守（圖2-A、B和C）。同時在RPL同源蛋白序列中存在兩個EAR-Motif（圖2-D和E），其中第二個EAR-Motif氨基酸序列完全保守其序列特征為LTLGL（圖2-A和E）；除了薔薇科的葡萄、錦葵科的棉花以及單子葉的玉米、小麥和水稻外，第一個EAR-Motif序列也高度保守，序列特征符合EAR-Motif的序列特征LxLxL（x代表任意氨基酸）（圖2-A和D）。

A：橙色實線框內為BELL-Domain，藍色實線框內為Homeodomain，紅色虛線框內為EAR-Motif。AtRPL：擬南芥RPL（NP_195823.1）；GmRPL：甜瓜RPL（XP_008448414.1）；VvRPL：葡萄RPL（XP_010654234.1）；PpRPL：桃RPL（XP_007208167.1）；GhRPL：棉花RPL（XP_016738976.1）；MdRPL：蘋果RPL（XP_008363517.1）；GmRPL：大豆RPL（XP_003516903.1）；SlRPL：番茄RPL（XP_004246395.1）；ZmRPL：玉米RPL：（NP_001168681.1）；TaRPL：小麥RPL（BAJ04689.1）；OsRPL：水稻RPL（XP_015641948.1）。B—E：BELL （B）、Homeodomain保守域（C）和EAR-Motif（D—E）的氨基酸保守性分析。D中的氨基酸序列不包括葡萄、棉花以及單子葉植物玉米、水稻和小麥；星號代表完全保守氨基酸

2.3 CsRPL1/2在黃瓜各部位的表達模式分析

在黃瓜地上部各個器官中均有表達，且表達量都遠高于。在葉中表達量最少，在開放的雄花中表達量最高，同時隨著果實的發育，的表達量逐漸下降。在莖中表達量最高，其次為開花當天的雄花，在果實中的表達量隨著果實的發育而逐漸降低。原位雜交結果顯示在黃瓜果實的胎座框中表達（圖3-B和D）；且雜交信號在植株頂點和側生器官分生組織處的central zone（虛線框）區域富集（圖3-C和E）。

A：CsRPL1/2在黃瓜各器官中的表達分析；B—F：CsRPL1（B和C）和CsRPL2（D和E）在黃瓜果實與植株頂點處的原位雜交分析；B、D：CsRPL1/2在胎座框處表達；C、E：CsRPL1/2信號在植物頂端分生組織的CZ區域富集；白色虛線框代表信號富集區域；F：CsRPL-SP6探針作為負對照，未發現雜交信號。比例尺：100 μm

2.4 CsRPL1/2過表達載體遺傳轉化擬南芥

為研究的基因功能，用35S組成型啟動子構建過表達載體，并遺傳轉化野生型擬南芥Columbia（Col）。得到T1代植株后提取DNA，用PCR鑒定的方法分別得到（#1-1、#1-2、#1-3）和（#2-1、#2-2、#2-3）各3株過表達轉基因陽性植株（圖4），取轉基因擬南芥的花序提取RNA，對的表達量進行熒光定量分析，35S::和35S::轉基因株系中的和的表達量相較于野生型表達量急劇升高（圖5-H）。

M：2000 bp DNA標準分子量；Plasmid：陽性對照質粒；Col：野生型擬南芥

2.5 轉基因擬南芥植株表型分析

將鑒定得到的和的各3個T1代轉基因株系單株收種，用潮霉素抗性篩選陽性植株，同時播種野生型Col擬南芥植株作為對照。每個株系移栽6株（即為T2代株系），并對其進行表型觀察。與野生型相比，除了果莢長度顯著變短外，35S::和35S::轉基因株系的整個植株的生長發育未發生明顯變化（圖5-A）。進一步表型觀察，統計每株擬南芥主莖從下到上20個果莢長度，轉基因株系果莢長度均明顯短于野生型（圖5-D）。將轉基因擬南芥果莢沿著腹縫線剝開，發現部分種子敗育（圖5-B）；且轉基因擬南芥株系的成熟果莢種子數較野生型也顯著減少（圖5-F）。為探究種子敗育原因，用亞歷山大染料染色法觀察花粉活力，發現轉基因擬南芥未染色花粉比例明顯高于野生型植株（圖5-E和G）。

3 討論

TALE基因家族廣泛存在于動植物中[25]，作為其中的一員，其功能涉及植物生長發育的多個方面，包括SAM（Shoot apical meristem）的起始與保持、側生器官分化、莖伸長、成花轉變、四輪花器官發育，以及果實發育等[1,18,20-22,26-35]。本研究中利用同源比對，發現黃瓜中存在兩個，且與擬南芥相比，內含子與外顯子數量相同；內含子長度相近，表明基因長度和結構相對保守。和的蛋白序列均包含BELL-Domain、Homeodomain保守域，以及分別位于BELL-Domain上游和Homeodomain下游的兩個EAR-Motif。EAR-Motif最早發現于TFⅢA型鋅指蛋白中[36]，與轉錄因子相連時轉錄因子表現出轉錄抑制作用[37]，并且這種抑制作用在許多基因的研究中得到證明，如[38]、/[39]等。因此，推測黃瓜在行使功能時可能表現為轉錄抑制作用。

擬南芥中，在葉中少量表達，在莖、花序和花中表達量較高[1]。在黃瓜中，在葉片中表達低，其次為頂點和莖，在生殖器官花芽和開放的花中表達量較高，特別是在開放的雄花中，其表達量是葉片中的25倍左右。值得注意的是，隨著黃瓜果實的生長，表達量呈逐漸下降趨勢，推測可能主要在黃瓜果實生長發育前期發揮作用。與相比，在所有檢測部位中，的表達量極低，且在生殖器官中的表達模式與相似，因此推測和可能存在功能冗余，且在正常條件下，優先發揮功能。擬南芥中，在胎座框處表達，通過限制異位表達從而促進擬南芥胎座框的形成[1]。黃瓜果實橫切面的原位雜交結果顯示同樣在果實胎座處表達，但是其具體功能有待進一步探究。之前有報道在擬南芥SAM的PZ（peripheral zone）區域表達[19,26]，而本研究中黃瓜信號則主要聚集在分生組織的CZ（central zone）區域，推測黃瓜在生長點處的功能與擬南芥存在不同，有待進一步研究。

A：野生型與轉基因植株表型（Col：野生型；#1-1：CsRPL1過表達株系；#2-1：CsRPL2過表達株系，比例尺：10 cm）；B：果莢內種子發育情況，白色箭頭指向敗育的種子（比例尺：2 mm）；C：果莢長度表型（比例尺：1 cm）；D：果莢長度統計數據；E：花粉活力檢測（比例尺1 mm）；F：單個果莢種子數統計；G：花粉活力的統計數據；H：野生型與轉基因植株中CsRPL1/2的表達量分析

擬南芥過表達轉基因植株均表現為果莢變短的表型，且果莢內部有很多胚珠敗育，不能發育形成正常的種子，野生型植株種子則發育正常，之后對單個成熟果莢種子數的統計結果也證明了這一點。種子的發育需要雌雄配子的結合，花粉萌發后花粉管伸長運送精細胞至胚珠與卵細胞結合，完成授精進而發育成種子。轉基因植株花粉活力檢測結果顯示（其雄蕊與野生型相比結構上無明顯差異），轉基因植株花粉約有30%左右不能被染色，而野生型植株花粉則幾乎全部被染色，說明轉基因株系花粉活力下降或許是種子敗育的原因之一。擬南芥花粉發育是一個極為精細的過程，大約有3 500個基因參與表達[40]。在花藥發育早期，在調控雄蕊原基形成的同時[41]，也被報道通過正調控來誘導花粉形成[42]。而下游的一系列基因包括、、、和都控制著花粉囊細胞的分化[43-46]。在成熟花粉形成階段，作為下游基因，兩者共同調控絨氈層發育[47-48]，在突變體中絨氈層細胞沒有發生細胞凋亡，同時花粉壁合成異常導致花粉最終敗育[49]。在調控絨氈層形成的同時，在花粉壁發育網絡中也起著至關重要的作用[50-51]。結合在雄花芽和開放雄花中的高表達模式，推測可能參與花粉的發育，但其在生殖器官發育中的功能還需要進一步探究。

4 結論

在黃瓜中存在兩個同源基因并命名為、，同屬于BELL（BEL1-like homeodomain）家族。在黃瓜各器官中的表達量遠高于；在擬南芥中異源過表達均會導致花粉育性降低，果莢變短，說明可能參與生殖器官的發育，且存在功能冗余，在正常生長條件下，優先發揮功能。

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Cloning and Functional Analysis of

SONG WeiYuan, HOU Yu, ZHAO JianYu, LIU XiaoFeng, ZHANG XiaoLan

(College of Horticulture, China Agricultural University, Beijing 100089)

【】is an important gene regulatingfruit development and mediating replum formation. Using homologous cloning, thehomolog in cucumber was identified, the biological function ofby expression analysis and ectopic transformation inwas explored.【】We cloned thegene by performing a BLAST search ofin cucumber genome. Then we performed amino acid sequence alignment ofandhomologs from other species by MEGA5.2.expression pattern in cucumber was detected by real-time quantitative PCR (qRT-PCR) andhybridization. Expression and phenotypic analysis of transgenicupon ectopic expression ofwere performed as well.【】Twogenes, namedand, were identified in cucumber with the conserved BELL domain and Homeodomain, and two EAR-Motifs.was expressed in all organs of cucumber, with the highest expression level in male flowers at anthesis. During early stages of fruit development, theexpression decreased gradually. The expression level ofwas significantly lower than that of.hybridization revealed that signals ofwere detected in the placenta of fruits and the central zone (CZ) of the shoot apical meristem (SAM). Ectopic overexpression ofintoresulted in shorter siliques, reduced pollen fertility, and inhibited seed development.【】were involved in the development of reproductive organs and might have functional redundancy in cucumber.might play the primary role under normal growth condition. The function ofwas not fully conserved as compared to that of.

cucumber;;transgenic plant; expression analysis; fruit

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.01.014

2019-06-03；

2019-07-02

國家自然科學基金（31772315）

宋維源，E-mail：songwy@cau.edu.cn。通信作者張小蘭，E-mail：zhxiaolan@cau.edu.cn

（責任編輯 趙伶俐）