黃瓜抗白粉病突變體篩選與鑒定

亓飛，林姝，宋蒙飛，張孟茹，陳姝延，張乃心，陳勁楓，婁群峰

黃瓜抗白粉病突變體篩選與鑒定

亓飛，林姝，宋蒙飛，張孟茹，陳姝延，張乃心，陳勁楓，婁群峰

（南京農業大學園藝學院/作物遺傳與種質改良國家重點實驗室，南京 210095）

【】白粉病是危害黃瓜產量、品質的最嚴重的病害之一，抗白粉病材料的發掘與研究，可以實現從根本上解決病害問題。對獲得的‘長春密刺’突變體材料進行分析，旨在篩選出黃瓜抗白粉病突變體材料，豐富育種群體。對400份‘長春密刺’突變體材料進行苗期接種白粉病菌試驗，通過葉片病斑觀察結合病情指數分析，初步篩選出抗病材料，將篩選出的抗病材料在大田環境下自然發病進一步觀察表型。對初步篩選出的抗病材料進行苗期生理鑒定，測定并分析超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶活性以及葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素、可溶性蛋白含量等生理指標，通過田間自然發病進一步篩選抗病材料，并測定其蒸騰速率、胞間二氧化碳濃度、氣孔導度、凈光合速率等光合作用指標及乙烯、茉莉酸、水楊酸激素含量，并通過熒光定量PCR分析葉片中乙烯、茉莉酸、水楊酸、木質素、病程相關蛋白等防御信號途徑中相關基因的表達。與感病材料相比，抗病材料的表面菌斑少，凈光合速率、氣孔導度都優于對照‘長春密刺’，胞間CO2濃度低于‘長春密刺’。在防御激素方面，抗病材料的乙烯、茉莉酸、水楊酸含量同樣優于感病材料，而在成熟期葉片的防御信號途徑相關基因表達上，抗病材料的表達高于感病材料。通過苗期接種白粉病菌和田間自然發病綜合篩選出了兩份抗白粉病突變體材料：Mu-86-2、Mu-58-9。通過對突變體庫的篩選可以獲得抗白粉病新材料，這些材料的獲得對黃瓜抗白粉病的遺傳研究和新品種培育具有重要價值。

黃瓜；突變體；抗白粉病；篩選鑒定

0 引言

1 材料與方法

試驗于2017年10月至2019年3月在南京農業大學園藝學院進行。

1.1 材料與處理

本試驗所用材料由南京農業大學葫蘆科作物遺傳與種質創新實驗室提供。前期已獲得華北型黃瓜品種‘長春密刺’經甲基磺酸乙酯誘變處理后自交三代的突變體材料，挑選飽滿度和整齊度都較高的種子用于試驗。

苗期抗病性篩選：對400份突變體材料進行編號，每個編號取5粒籽粒飽滿、大小一致的種子置于紙杯中，用56℃的溫水浸泡6 h后將水倒掉，置于光照培養箱中進行催芽。種子出芽后將種子播于72孔穴盤中，待長到二片真葉時進行人工接種。接種用的病原菌孢子取自當季病葉，用毛筆將病葉上的病原孢子刷下來，收集到無菌水中，攪拌均勻后用血球計數板測定孢子濃度，所用的孢子懸浮液濃度為5×105個/mL，采用噴霧法進行接種，噴至葉片上沾滿水珠為止。重復3次。接種后將材料放于溫室中，溫度控制在白天22—26℃，夜晚18—20℃，濕度在80%左右。接種后進行病情指數統計，病情指數分級采用Sakata等[16]的方法。

田間抗病性篩選：將從苗期篩選出的抗病突變體材料播種催芽，催芽方式與苗期篩選相同，將突變體材料與抗性對照材料‘IL52’[17]種植于南京農業大學白馬基地，自然發病，進行田間觀察，在結果期對植株的功能葉進行光合參數和防御相關激素含量的測定分析。

1.2 顯微觀察

取接種后7 d的葉片，用磷酸緩沖液沖洗樣品，采用Lecia DVM6數碼視頻顯微鏡對葉片表面病菌進行顯微觀察；取接種后7 d的葉片，用磷酸緩沖液清洗樣品，清洗后將樣品切成1 cm2的小塊，用2.5%戊二醛固定，樣品制備參考康振生[18]的方法，樣品制備完成后在日立S-3000N掃描電子顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 酶及葉綠素、可溶性蛋白含量的測定

超氧化物歧化酶（SOD）活性測定采用氮藍四唑光化還原法；過氧化物酶（POD）活性測定采用愈創木酚法；過氧化氫酶（CAT）活性測定采用紫外分光光度計法；葉綠素含量測定采用乙醇溶液浸提法；可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍法。

1.4 光合參數測定

采用LI-6400XT光合儀，在晴天中午光強為6 000 lx時選取不同編號同一部位的第7—8節葉片測量凈光合速率、蒸騰速率、胞間CO2濃度、氣孔導度。

1.5 內源激素測定

取第7—8節葉片（功能葉）0.5 g，采用ELISA法[19]測定乙烯、茉莉酸、水楊酸含量，試劑盒由南京森貝伽生物科技有限公司提供。每份樣品進行3次重復。

視覺航標，又稱目視航標，是可以直接目視觀測的助航標志，顏色與形狀特點是非常容易讓人辨認的，航海人員在白晝直接觀察標身的顏色、形狀和頂標，視覺航標也可安裝燈器及其他設備，在夜間識別需要觀察航標的燈光節奏和燈光顏色。視覺航標包括有水上燈樁、浮標、燈浮標、燈船等水上浮動航標和燈塔、立標、導標等固定航標。

1.6 RNA提取、反轉錄和實時熒光定量PCR

在成熟期采植株第7—8節葉片，總RNA的提取采用Trizol法，反轉錄利用反轉錄試劑盒（TaKaRa）。合成CTR EIN2 ETR EDS5 NPR1 CCR PAL COI1 PDF PR2及內參基因的引物[20]。利用CFX96熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司）以及SYBR Green1試劑盒（TaKaRa）進行擴增。反應條件為95℃ 3 min，95℃10 s，60℃ 30 s，共40個循環，對PCR結束后樣品進行熔解曲線分析，確定為特異性擴增。所有樣品進行3次重復，采用2－ΔΔCT法進行基因相對表達量分析。

2 結果

2.1 黃瓜突變體苗期抗白粉病材料的篩選

2.1.1 抗病性病情指數分析 在黃瓜幼苗長到二葉一心，用5×105個/mL濃度的白粉病原菌懸浮液對幼苗進行噴灑接種，觀察發現，不同編號材料的抗病性表現不一。依照病情指數將400份突變體材料分類，其中高抗材料3份，占接種材料總數的0.75%；中抗材料8份，占2%；中感材料30份，占7.50%；其余的為感病材料，共359份，占總數的89.75%。

根據病情指數分析，將選出的3份抗性材料和8份中抗材料進一步進行幼苗期抗性相關指標的鑒定分析（表1）。

表1 初步篩選的抗病突變體的病情指數分析

2.1.2 感染白粉病菌葉片的顯微觀察 通過接種白粉病菌，7 d后在對照幼苗葉片部位可以清楚的觀察到一層白粉，取其中的一份抗病材料Mu-58-9，通過顯微觀察在抗病材料未能觀察到菌絲體（圖1-A），而在感病材料‘長春密刺’葉片上能清楚的觀測到病原菌絲體（圖1-B）。

通過掃描電鏡觀察發現在不同病級的材料上，白粉病菌絲的生長情況不同，在高抗材料Mu-86-2葉片上未觀察到菌絲體（圖2-A），在中抗材料上僅觀察到很少的孢子，隨著感病程度加強，病原菌絲體也逐漸明顯。在感病材料上能觀察到從菌絲中出現長且為圓柱形的分生孢子，孢子直立地分開分枝，直至布滿整個葉片。

2.1.3 生理生化指標 如表2所示，與對照（CK）‘長春密刺’相比，黃瓜突變體材料中葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量均有不同程度變化。其中，除Mu-104-2、Mu-9-9、Mu-50-10的葉綠素a和葉綠素b指標低于對照，其他材料的3種色素指標均高于對照，且葉綠素a和葉綠素b的變化較類胡蘿卜素明顯。

A：Mu-58-9；B：‘長春密刺’Changchunmici

表2 接種白粉病菌后對黃瓜突變體幼苗色素含量影響

CK：對照‘長春密刺’。不同字母表示不同處理間差異顯著（＜0.05）。下同

CK: Control Changchunmici. The different letters indicate significant difference at 0.05 level among different treatments. The same as below

A：Mu-86-2；B：Mu-150-3；C：Mu-1-5；D:‘長春密刺’ Changchunmici

如表3所示，有3個材料的POD活性顯著高于對照，4個突變體材料SOD活性顯著高于對照，4個突變體材料CAT活性顯著高于對照，其中Mu-86-2和Mu-58-9的這3種酶活性顯著高于對照。在這3種活性酶中，突變體材料與‘長春密刺’相比，SOD、CAT上升較少，POD的活性比對照上升明顯。

表3 接種白粉病菌后對黃瓜突變體幼苗抗氧化酶活性的影響

如圖3所示，不同突變體可溶性蛋白質含量存在差異。其中Mu-58-9、Mu-86-2、Mu-50-10幼苗的可溶性蛋白的含量顯著高于對照，抗性更好；Mu-84-8、Mu-106-3的可溶性蛋白含量顯著低于對照；其他突變體材料與對照相比無顯著差異。

2.2 黃瓜抗白粉病突變體田間篩選

2.2.1 突變體材料田間抗病性的表型觀察 通過苗期篩選得到的材料在田間進行觀察，發現除Mu-86-2、Mu-58-9外，其他材料抗性較差。在田間自然狀態下，抗病材料Mu-58-9相對于感病材料葉片表面白粉病斑更少。感病材料白粉病斑濃厚，嚴重的導致植株死亡（圖4）。

2.2.2 光合指標測定 如表4所示，在對田間自然發病品種的光合指標測定分析中發現，抗性材料Mu-58-9、Mu-86-2、IL52在凈光合速率、氣孔導度方面都優于對照。其中，Mu-58-9的凈光合速率相比‘長春密刺’上升6.366 μmol·m-2·s-1，升高38%；氣孔導度上升0.604 mmol·m-2·s-1，升高106%。Mu-86-2比‘長春密刺’凈光合速率上升6.366 μmol·m-2·s-1，升高38%；氣孔導度上升0.255 mmol·m-2·s-1，升高45%。IL52比‘長春密刺’凈光合速率上升7.1 μmol·m-2·s-1，升高43%；氣孔導度上升0.22 mmol·m-2·s-1，升高38%；而蒸騰速率與對照相似，胞間CO2濃度低于對照。

圖3 接種白粉病菌后黃瓜突變體幼苗的可溶性蛋白質含量

2.2.3 防御激素含量測定 如表5所示，3份抗性材料的3種激素含量都高于對照‘長春密刺’，Mu-58-9的茉莉酸含量比對照上升349.603 pmol·L-1，升高26%；Mu-86-2上升405.906 pmol·L-1，升高30%；IL52上升345.675 pmol·L-1，升高25%。在水楊酸含量上，與對照相比，Mu-58-9上升154.193 pmol·L-1，升高16%；Mu-86-2上升103.828 pmol·L-1，升高11%；IL52上升49.59 pmol·L-1，升高5%。在乙烯含量上，與對照相比，Mu-58-9上升30.235 ng·L-1，升高19%；Mu-86-2上升35.185 ng·L-1，升高22%；IL52上升63.196 ng·L-1，升高40%。表明在防御外界病原菌入侵時，3種激素起到了重要作用。

2.2.4 防御信號途徑中相關基因表達分析 如圖5所示，利用Real-time PCR方法分析田間自然發病條件下防御信號途徑中相關基因的表達，在黃瓜成熟期葉片的基因表達分析顯示，與對照材料‘長春密刺’相比，Mu-58-9、Mu-86-2、IL-52中乙烯相關基因、、表達量均較高，且表達最明顯。水楊酸相關基因在抗性材料中呈現高表達。茉莉酸相關基因在在抗性材料中呈現高表達。病程相關蛋白基因在Mu-58-9、Mu-86-2、IL-52中比在對照中表達要高。

圖5 田間自然發病條件下防御信號途徑中相關基因的表達

表4 田間感染白粉病菌后對突變體材料光合指標影響

表5 田間感染白粉病菌后對突變體材料防御激素含量影響

3 討論

本研究獲得抗白粉病黃瓜突變體Mu-58-9、Mu-86-2。這為進一步研究黃瓜抗病機制提供了材料。植物在受到病原菌侵害后，病菌迅速繁殖，造成葉片組織受損進而使其光合速率下降、葉綠素含量降低[21]。在本研究中，通過研究發現受到病菌侵害后的不同突變體材料葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素均有不同程度的下降，且葉綠素a、葉綠素b的含量變化明顯大于類胡蘿卜素。葉綠素a主要存在于兩個光系統的PS Ⅰ、PS Ⅱ核心復合物中，葉綠素b主要是兩個光系統的天線組分，類胡蘿卜素是光合作用的輔助色素。白粉病菌侵染后，使黃瓜葉片光合膜全鏈D電子傳遞受損，受損的主要部位在光系統Ⅱ[22]。葉綠素a比其他兩種色素對白粉病菌更敏感。本研究還發現，抗性材料的凈光合速率、氣孔導度比對照高。黃瓜在遭受到病菌侵害后，由于葉肉細胞光合活性下降從而造成光合速率下降[23]，進而影響植株正常生長。

為抵御病原物侵染或逆境的影響，體內防御酶活性的次生代謝物含量或發生明顯變化[24]。多數學者認為植物體內防御性酶POD、SOD、CAT等的活性變化與植物的抗病性具有一定的關系[25]。SOD、POD、CAT能夠有效清除過量的活性氧，減少對膜結構和功能的破壞。SOD活性的增加和減少經常與疾病抗性和易感性相關，植物受到病原菌侵入后需要增加SOD的活性來催化氧化爆發期間H2O2的合成以防止超氧化物的積累[26]。CAT是保護植物免受ROS氧化損傷的重要酶[27]，幾種酶共同協同來去除O2-和H2O2[28]。通過對防御性酶的研究發現，與對照相比，3種防御酶的活性有不同程度的變化，高抗材料較對照活性最強。在對材料的表型進行觀察時，發現在苗期篩選得到的中抗材料在田間成熟下發病嚴重，葉片上布滿白粉，幼苗期的表型與成熟期有差異。在對苗期進行病情分級時或許應該采用更嚴格的分級。

植物體內的防御反應機制十分復雜，植物通過多條途徑對外來的病原物產生反應，研究最深入的抗病信號途徑主要是乙烯、茉莉酸、水楊酸途徑[29]。植物抗病性受到乙烯的調控，乙烯在植物抗病性上的作用目前存在分歧，Cooper等[30]研究發現在番茄果實中低濃度的乙烯可以提高抗炭疽病能力。外源施用水楊酸可以增強蠶豆抗黃葉病毒能力[31]。茉莉酸在植物防衛反應和抗病性方面起到重要的作用，植物通過茉莉酸信號的傳導對病原菌的入侵產生主動反應[32]。對3種內源激素的研究發現，與對照相比，Mu-58-9、Mu-86-2及選擇的抗性材料IL52的激素含量明顯增高。相關研究表明乙烯在成熟階段起到了一定作用，但由于乙烯還對植物的生長和發育過程起著重要作用[33]，尚不清楚其是否參與了抗病過程。而茉莉酸、水楊酸在抗病性上起到了一定的作用。、是水楊酸信號途徑中的關鍵基因，武健東等[34]發現在玉米感染小斑病原菌后會誘導的上調。魯秀梅等[35]在研究甜瓜接種蔓枯病后，抗蔓枯病材料在接種后期的表達水平高于感病材料。本研究中，植株在成熟階段的抗病材料中、的表達量高于感病材料，說明在整個生長階段，水楊酸信號途徑相關基因在病原入侵中啟發，進而積累水楊酸，從而發揮作用。茉莉酸信號途徑相關基因的表達與水楊酸信號途徑的表達情況相似，這兩個途徑是相互協同的。病程相關蛋白在受到外來脅迫時其表達量上升，植物生成自我防衛系統防御外來侵害[36]。成熟期，基因在抗性材料中表達高于感病材料‘長春密刺’，表明在成熟階段，植物能不斷的產生防衛信號來防御外來物入侵。抗病信號途徑相關基因和活性酶參與了植物的防御過程，本研究通過葉片表型觀察與多項生理指標綜合評價材料的抗病性，篩選出的突變體幼苗的各項指標均較好，但在成熟期的激素相關基因表達上與IL-52有一定差別。其中的原因還需要做進一步研究。植物的抗病機制十分復雜，受外界環境的影響很大，本試驗選取黃瓜突變體幼苗期和成熟期2個時期對抗性水平進行綜合對比，最終篩選出抗性材料。

4 結論

通過苗期接種白粉病菌和田間自然發病綜合篩選出兩份抗白粉病突變體材料：Mu-86-2、Mu-58-9；抗病材料成熟期葉片的防御信號途徑相關基因表達高于感病材料，抗病材料的獲得對黃瓜抗白粉病的遺傳研究和新品種培育具有重要價值和意義。

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GAO Q H, ZENG X R, JIA L, NIU D D, LI X J, GUAN M X, JIA M, LAN J P, DOU S J, LI L Y, LIU L J, LIU G Z. The expression profiling of rice pathogenesis-related proteins in seedling stage under environmental stresses., 2013, 40(11): 1140-1147. (in Chinese)

Screening and Identification of Cucumber Mutant Resistant to Powdery Mildew

QI Fei, LIN Shu, SONG MengFei, ZHANG MengRu, CHEN ShuYan, ZHANG NaiXin, CHEN JinFeng, LOU QunFeng

(College of Horticulture, Nanjing Agricultural University/State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing 210095)

【】Powdery mildew is one of the most serious diseases that effects cucumber yield and quality. The discovery and research of materials resistant to powdery mildew can fundamentally solve the disease problem. To screen out materials of cucumber resistant to powdery mildew and enrich the breeding population, the Changchunmici mutants were investigated and analyzed in the study.【】Totally, 400 Changchunmici mutant lines were inoculated with powdery mildew at seedling stage, and resistant materials were screened preliminarily based on leaf lesion observation combined with disease index analysis. The selected resistant materials were further observed in the natural environment in the field environment.Physiological indexes of resistant materials in the seedling stages were analyzed, including the activities of superoxide dismutase, peroxidase and catalase activity, and physiological indicators such as the contents of chlorophyll a, chlorophyll b, carotenoids and soluble protein. The resistant materials were screened by natural pathogenesis in the field and were further analyzed for the photosynthetic indexes such as transpiration rate, intercellular carbon dioxide concentration, stomatal conductance and net photosynthetic rate. And the contents of ethylene, jasmonic acid and salicylate were determined, and expression of related genes in defense signaling pathways such as ethylene, jasmonic acid, salicylic acid, lignin, and disease-related proteins in leaves were analyzed by real-time PCR. 【】Compared with susceptible materials, the resistant materials had less plaque. The net photosynthetic rate and stomatal conductance of resistant materials were higher than those of wild-type Changchunmici, and the intercellular CO2concentration of them was lower than that of Changchunmici. In terms of defensive hormones, the contents of ethylene, jasmonic acid and salicylate of resistant materials were higher than those in control. The expression of defense signal related genes in mature leaves of resistant materials was higher compared with susceptible materials. Two powdery mildew resistance materials, Mu-86-2 and Mu-58-9 were screened by inoculation of powdery mildew in seedling stage and natural disease. 【】The new materials resistant to powdery mildew could be obtained by screening mutant libraries. The acquisition of these materials had the important value for the genetic research and new varieties breeding of cucumber resistance to powdery mildew.

cucumber; mutant; resistance to powdery mildew; screening and identification

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.01.016

2019-06-03；

2019-10-23

國家“十三五”重點研發計劃子課題（2016YFD0100204-25）、江蘇省農業科技自主創新項目[CX(17)3016]、江蘇省農業重大新品種創制項目（PZCZ201719）、江蘇高校“青藍工程”人才項目

亓飛，E-mail：qifei0115@163.com。通信作者婁群峰，E-mail：qflou@njau.edu.cn

（責任編輯 趙伶俐）