近海海洋真菌生物轉化(+)-檸檬烯

楊道茂， 陳煌

(1. 華僑大學 化工學院， 福建 廈門 361021；2. 廈門萬泰滄海生物技術有限公司， 福建 廈門 361022)

出于對食品安全的考慮，消費者對天然來源產品的需求日益提高.按照美國和歐洲的立法，天然香辛料是指其原料來源于動物、植物或通過物理、酶和微生物的處理方式獲得的,且帶有芳香味的化合物[1-2].天然來源的化合物比化學合成的化合物具有更高的市場價值，因此，通過生物轉化或酶解工藝獲得天然生物香料就具有很高的市場研發價值[3].(+)-檸檬烯為結構最簡單的環狀單萜類化合物，主要分布于葡萄柚、檸檬、酸橙，橘子中，為柑橘加工廠的副產物檸檬精油的主要成分.研究表明，由檸檬烯出發，共有6條代謝途徑可以生成一系列香料型含氧衍生物[4-15].底物和轉化產物的價格差異巨大[16]，通過生物轉化作用可以實現檸檬烯的結構改造，從而達到產業增值的目的.生物轉化檸檬烯的一個關鍵因素是大量微生物的篩選分離.為此，國內外很多科學家開展了大量的菌株篩選工作，Rottava等[17]在生物轉化檸檬烯和α-蒎烯的研究中，從405株菌株中選用193株進行生物轉化檸檬烯，有8株能利用檸檬烯生成松油醇，有1株青霉屬微生物最高產量達3 450 mg·L-1.Bicas等[18]從柑橘加工廠環境中分離到238株菌株，僅有70株能在以檸檬烯為唯一碳源的基礎培養基中生長.本文對近海海洋真菌生物轉化(+)-檸檬烯進行研究.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

1) 試劑.(+)-檸檬烯(純度為96%，穩定型，美國Acros Organic公司)；GF254硅膠板(50 mm×100 mm，山東省青島海洋化工有限公司)；無水乙醇、乙酸乙酯、石油醚(上海國藥集團化學試劑有限公司)，其他試劑均為分析純.

2) 儀器.N-1100型旋轉蒸發儀(日本EYELA公司)；GCMS-QP2010 Ultra型氣質聯用儀(FID檢測器，附美國國家標準與技術局(NIST)11.0化學數據庫，日本Shimadzu公司).

1.2 近海海域海洋真菌菌株篩選

首先，從福建省廈門市環島路沙灘上采集海水浸泡的海藻、浮木、貝殼等材料，用無菌海水洗凈.然后，取2 g材料浸泡于10 g無菌海水中，并粉碎、靜置；取1 mL上清液涂布于用海水配制的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基(內含20～50 μg·mL-1的青霉素和鏈霉素)中，于30 ℃下培養2～3 d后，按照菌落形態的差異，挑選單菌株劃線分離，直到獲得單菌落為止.最后，將各單菌落保存到斜面備用.

1.3 生物轉化實驗

挑選上述分離到的30株真菌置于沙保氏培養基(40 g·L-1葡萄糖，10 g·L-1蛋白胨，1 L陳海水，pH值自然)中，進行生物轉化實驗.用接種環挑取實驗菌的菌絲或孢子，每株真菌接種到2個250 mL的錐形瓶中，每個錐形瓶接100 mL培養基，于30 ℃，150 r·min-1下培養6 d.然后，在其中一個錐形瓶中加入1 mL檸檬烯底物溶液(V(檸檬烯)∶V(乙醇)=1∶1，檸檬烯的最終體積分數為0.5%)作為實驗組，另外一瓶作為菌株對照組,不做其他處理.同時,單獨取一無菌培養基加入等量底物溶液，設置為底物對照組，即該培養基內只含體積分數為0.5%的底物溶液，而不接種任何菌株.在相同條件下，錐形瓶繼續培養4 d.生物轉化實驗結束后，將各菌株的發酵液用濾紙過濾，濾液用100 mL乙酸乙酯萃取2次，并合并萃取液，經無水硫酸鈉脫水后，用旋轉蒸發儀濃縮至1.5 mL左右；將濃縮液置于1.5 mL的離心管中，用10 000g的相對離心力離心10 min，取上層有機相用于產物成分分析.

1.4 產物成分分析

將底物對照組、菌株實驗組和菌株對照組樣品進行薄層色譜(TLC)點板預檢測.顯色劑為香草醛-硫酸-乙醇顯色劑(15 g香草醛溶于250 mL體積分數為1%的濃硫酸-乙醇溶液中)；展開劑為V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=15∶4或V(氯仿)∶V(甲醇)=10∶1的溶液.

將菌株實驗組與底物對照組間存在差異的樣品進行氣相色譜-質譜(GC-MS)分析.GC-MS的檢測條件:色譜柱為Rxi-5sil MS(30.00 m×0.25 mm×0.25 μm)，柱箱溫度為60 ℃，進樣口溫度為250 ℃，柱流量為1 mL·min-1，分流比為1∶2，進樣量為1 μL.升溫程序為：柱溫60 ℃×3 min→升溫速度10 ℃·min-1→柱溫150 ℃×5 min→升溫速度20 ℃·min-1→柱溫250 ℃×3 min.質荷比(m/z)掃描范圍為40～200.

2 實驗結果

2.1 菌株分離純化

在菌落初篩階段共篩選出80株真菌，其中，65株為霉菌，15株為酵母菌.對菌株進行編號(1～80)，并保存于4 ℃冰箱中備用.

(a) V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=15∶4 (b) V(氯仿)∶V(甲醇)=10∶1圖1 菌株萃取液的TLC結果Fig.1 TLC result of extracts from strains

2.2 菌株萃取液的TLC檢測

挑選出30株菌株，將其底物對照組、菌株實驗組和菌株對照組的萃取液分別進行TLC實驗，判斷是否出現差異點.結果表明，大部分菌株對照組的TLC板上無斑點.在TLC的比對結果中，23，27，36，41號菌株可能具有生物轉化(+)-檸檬烯的能力.菌株萃取液的TLC結果，如圖1所示.圖1中：Lim為底物對照組；ct為菌株對照組.

由圖1可知：培養4 d后， 底物對照組有5個明顯的斑點(比移值Rf分別為0.14，0.49，0.62，0.75，0.86);當Rf=0.54時，23，36號菌株出現1個明顯的斑點，與底物對照組進行比對，推測這2株菌具有生物轉化(+)-檸檬烯能力.

由圖1還可知：41號菌株出現的4個主要斑點均與底物重合，其他部分略有些差異，推測該菌株可能具有一定的生物轉化(+)-檸檬烯能力；當Rf=0.20時，27號菌株的實驗組出現1個紅色斑點，經與菌株對照組比對，表明該紅點為菌株自身代謝產物，其余位置只出現3個主要斑點，與底物對照組差異較大，由此推測27號菌株可能具有一定的生物轉化(+)-檸檬烯能力.

2.3 菌株萃取液的GC-MS檢測

將23，27，36，41號菌株的萃取液進行GC-MS檢測(代謝產物的GC-MS分析工作主要借助華僑大學材料學院宋秋玲教授課題組儀器完成)，其總離子流色譜圖，如圖2所示.圖2中：δ為相對強度；1～6代表可辨識的化合物峰信號;tR為各化合物峰的保留時間.

(a) 23號菌株 (b) 27號菌株

(c) 36號菌株 (d) 41號菌株圖2 菌株萃取液的總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram of extracts from strains

由圖2可知：23,36號菌株的峰信號1(tR=7.78 min)相對強度最大，底物(檸檬烯)信號(tR=5.64 min)較弱，表明這兩株菌株能轉化底物，生成峰信號1所代表的化合物，該結果與圖1的TLC判斷結果一致；27,41號菌株中的峰信號2(tR=5.40 min)和峰信號3(tR=5.61 min)的相對強度均比底物信號更大，說明27,41號菌株也能轉化底物，生成其他一系列化合物，該結果與圖1的TLC判斷結果一致.

圖3 暫定的菌株生物轉化(+)-檸檬烯代謝產物的化學結構Fig.3 Tentatively identified chemical structure of metabolitesby biotransformation of (+)-limonene

通過NIST化學數據庫檢索，并結合生物轉化檸檬烯的作用機理，暫定出4株菌株生物轉化(+)-檸檬烯代謝產物的化學結構，如圖3所示.各菌株主要代謝產物準確的化學結構還有待進一步驗證.

3 討論

菌株來源于福建省廈門市近海海域腐爛的沉積木、海藻等組織，按照海洋真菌定義，只要是在海洋環境中分離，并能在海水鹽度(或略低于海水鹽度)的培養基中正常生長的真菌，都可以稱為海洋真菌或海洋生真菌.因此，實驗來源的真菌都屬于兼性海洋真菌[19].

目前，關于生物轉化(+)-檸檬烯的微生物報道很多，主要有以下5類：1) 細菌，如惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)[20-22]、海洋弧菌(Vibriocholerae，Listonelladamsela，Vibrioalginolyticus)[23]；2) 酵母菌，如解脂耶氏酵母(YarrowialipolyticaATCC 18942)[13]；3) 真菌，如植物內生真菌(Phomopsissp.)[6]、柑橘綠霉(PenicilliumdigitatumDSM 62840)[10]、尖孢鐮孢菌(Fusariumoxysporum152B)[15]；4) 微藻(Chlorella，Oocystis，Chlamydomonas和Synechococcus)[7]；5) 斜紋夜蛾的幼蟲(Spodopteralitura)[24].然而，目前較少有關于利用海洋真菌完成生物轉化(+)-檸檬烯方面的報道.

利用海洋真菌生活環境產生的獨特催化特性進行生物轉化(+)-檸檬烯，實驗結果表明，其代謝產物與文獻報道的陸地微生物代謝產物的差異較大，例如，未檢測出比較常見的香芹酮、檸檬烯-1， 2-二醇、紫蘇醇、紫蘇酸等代謝產物.這說明利用海洋真菌生物轉化檸檬烯還有待深入研究.

從廈門近海海域分離了80株真菌，其中，65株為霉菌，15株為酵母菌.在選取的30株兼性海洋真菌中，23,27,36,41號菌株具有生物轉化檸檬烯的能力，但其菌株種屬還有待進一步確定.4株菌株生物轉化(+)-檸檬烯的主要代謝產物暫定為異辣薄荷烯酮、波斯菊萜、1，3，8-孟三烯、4-萜烯醇、二氫香芹酮、香芹醇.23，36號菌株的主要代謝產物異辣薄荷烯酮具有進一步研究開發的價值.