趨化因子受體4與胃癌患者預后的相關性及潛在機制探索

張椿鈺，侯世科，吳 超， 程 明

胃癌是全球范圍內常見的惡性腫瘤之一，在所有惡性腫瘤中，其發病率排在第5位，病死率居第3位[1]。因此，進一步尋找能提示其預后的指標并探索胃癌發生發展的相關分子機制，對早期制定治療策略并提高療效具有重要意義[2]。研究表明，趨化因子受體4(chemokine receptor 4, CXCR4)相關通路能夠激活腫瘤干細胞，可促進胃癌細胞的增殖，并通過激活腫瘤細胞逃逸宿主免疫機制以抑制腫瘤細胞凋亡[3]。但多數臨床研究僅限于腫瘤組織中CXCR4表達高低與基礎臨床數據的相關性分析，長期隨訪數據鮮有報道。本研究擬通過利用公開的癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas, TCGA)數據庫和生物信息學方法，分析CXCR4對胃癌患者腫瘤分期及遠期生存率的影響，并探討潛在的相關機制，從而為胃癌的預后判斷和治療方案制定提供一定的參考。現報告如下。

1 資料和方法

1.1一般資料及生存曲線比較 從包含TCGA數據網站(http://www.linkedomics.org)下載胃癌患者數據集TCGA_STAD RNASeq和TCGA_STAD Clinical，篩選出同時包含生存時間數據信息和CXCR4基因表達數據的患者共375例，比較CXCR4基因表達水平與年齡、種族、放療狀況的相關性。按照CXCR4表達水平由高到低排序，將排在前50%的患者設為高表達組(188例)，其余患者設為低表達組(187例)，繪制2組患者的生存曲線。

1.2不同腫瘤分期的CXCR4比較 根據腫瘤的病理學分期及TNM分期，將患者分別歸入相應的各組，比較不同分期CXCR4的基因相對表達水平。

1.3CXCR4相關基因篩選 利用Omisc軟件，將檢測的所有基因表達水平逐一與CXCR4表達水平進行Pearson相關性檢驗，根據相關系數，選取出與CXCR4表達水平相關性最高的50個基因，并繪制基因熱圖[4]。

1.4富集分析 將篩選出的50個CXCR4相關基因導入DAVID在線數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)進行基因本體(gene ontology, GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書通路(the kyoto encyclopedia of genes and genomes pathway, KEGG通路)富集分析。

1.5蛋白相互作用網絡分析 將篩選出的差異基因導入String在線數據庫(http://string-db.org/)，獲得相關基因所編碼的蛋白質之間的相互作用，并進行聚類分析，從而找出處于網絡核心的關鍵蛋白。

2 結果

2.1CXCR4基因表達水平與年齡、種族及放療狀況的相關性 CXCR4表達水平與胃癌患者年齡呈顯著相關性(P<0.01)；放療狀況及不同種族間胃癌患者的CXCR4表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 CXCR4基因表達水平與胃癌患者年齡、放療狀況及種族的相關性

A.CXCR4基因表達水平與年齡相關性；B.放療狀況對CXCR4基因表達水平的影響；C.不同種族CXCR4基因表達水平情況；CXCR4為趨化因子受體4

2.2CXCR4表達差異對生存時間的影響 胃癌患者CXCR4高表達組的中位生存時間低于CXCR4低表達組(P<0.01)。見圖2。

圖2 2組胃癌患者生存曲線比較CXCR4為趨化因子受體4

2.3不同分期胃癌患者CXCR4表達差異 病理分期Ⅰ期患者CXCR4表達水平顯著低于Ⅱ～Ⅳ期的患者(P<0.05)，見圖3A；T1期患者CXCR4表達水平顯著低于T2～T4期患者(P<0.05)，見圖3B；N分期各期患者間CXCR4表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖3C；M0期患者CXCR4表達水平低于M1期患者(P<0.05)，見圖3D。

圖3 不同分期胃癌患者CXCR4表達水平差異

A.不同病理分期胃癌患者CXCR4表達；B.T分期胃癌患者CXCR4表達;C.M分期胃癌患者CXCR4表達；D.N分期胃癌患者CXCR4表達；CXCR4為趨化因子受體4

2.4CXCR4相關基因的篩選 在檢測的20 225個基因中，有11623個基因與CXCR4存在相關性(P<0.05)。見圖4A。選取與CXCR4表達相關系數最高的前50個基因，并繪制基因熱圖。見圖4B。其中氫電壓門控通道1(hydrogen voltage gated channel 1， HVCN1)和RCSD結構域1(RCSD domain containing 1， RCSD1)與CXCR4表達水平的相關系數最高(r=0.749，0.738，均P<0.001)。見圖4C和圖4D。

圖4 CXCR4相關基因篩選結果

A.CXCR4與各基因的相關性分析結果；B.與CXCR4表達相關系數最高的前50個基因；C.HVCN1與CXCR4表達的相關系數；D.RCSD1與CXCR4表達的相關系數；CXCR4為趨化因子受體4，HVCN1為氫電門控制通道，RCSD1為RCSD結構域1

2.5GO富集分析和KEGG通路富集分析 對篩選的50個基因進行GO富集分析可見，主要涉及的生物學過程包括對刺激的反應、生物調節、細胞通訊、多細胞生物過程和發育過程；主要定位的細胞組分為膜、囊泡、細胞質、細胞外空間和內膜系統；主要涉及的分子功能為蛋白質結合、分子換能器活動、酶調節劑活性、離子結合和脂質結合。見圖5。KEGG通路富集分析可見主要涉及的信號通路為負性胸腺T細胞選擇、B細胞活化參與免疫反應、免疫球蛋白介導的免疫反應、調節適應性免疫反應和T細胞分化。見圖6。

圖5 GO富集分析

圖6 KEGG通路富集分析

2.6編碼蛋白相互作用分析 相關基因所編碼的蛋白之間的相互作用網絡。見圖7。酪氨酸蛋白激酶BTK(tyrosine-protein kinase BTK，BTK)、胞質分裂蛋白2脫除劑(dedicator of cytokinesis protein 2，DOCK2)、受體型酪氨酸蛋白磷酸酶C(receptor-type tyrosine-protein phosphatase C，PTPRC)是處于網絡核心的蛋白。見圖7。

3 討論

CXCR4由352個氨基酸構成，其分子量為48 000，基因定位于2q21，在腫瘤形成和轉移中起重要作用[5]。CXCR4活化后可影響腫瘤細胞增殖、血管生成、侵襲和遠處轉移[3]。陳佳棟等[6]通過對300例胃癌患者病理標本研究發現，CXCR4的轉錄及表達水平在胃癌組織中明顯升高，可能與胃癌患者的臨床分期和淋巴結轉移有關。Nikkhoo等[7]報道，CXCR4在胃癌細胞中表達增加，且細胞核優勢表達患者較細胞質優勢表達患者的預后更佳。但多數研究缺乏長期隨訪數據，CXCR4對于胃癌患者長期生存率的影響仍有待進一步探討。本實驗通過分析公開數據庫中的患者信息發現，胃癌患者CXCR4高表達組的中位生存時間顯著低于CXCR4低表達組，表明CXCR4高表達與胃癌患者預后不良相關。進一步對CXCR4表達與腫瘤分期的相關性進行分析發現，腫瘤分期級別越高，CXCR4的表達越高。這與Nikzaban等[8]結果一致，其發現CXCR4水平在胃癌晚期顯著升高，CXCR4水平與疾病的分期和淋巴侵襲有關。但CXCR4可參與多條信號通路，其造成胃癌患者預后不良的相關機制尚未完全闡明，為此本研究進一步探索并分析了與CXCR4表達相關系數較高的基因，以期尋找潛在相關機制。

圖7 相關基因編碼蛋白的相互作用網絡

本研究結果顯示，HVCN1和RCSD1與CXCR4表達水平的相關系數最高，其中HVCN1基因編碼電壓門控蛋白質通道蛋白，其可介導高選擇性氫離子外向電流，能在短時間內補償酸負荷。腫瘤細胞由于耗能增加可造成細胞內酸性物質聚積，若酸性物質聚積過量則會誘導發生細胞凋亡，而HVCN1的過表達則可緩解癌細胞內酸性物質的聚積，促進腫瘤細胞的增殖[9-10]。RCSD 1又稱為CapZ相互作用蛋白(capZ-interacting protein， CAPZIP)，在應激條件下誘導的磷酸化可調節F-肌動蛋白加帽蛋白重塑肌動蛋白絲組裝的能力。CAPZIP主要高表達于免疫細胞和骨骼肌，當細胞暴露于外界應激時，可被多個應激蛋白激酶磷酸化，導致CapZIP中CapZ的分離，從而進一步影響CD28胞漿內結構域的磷酸化[11]。CD28的磷酸化是激活T 細胞發揮抗腫瘤免疫效應時重要的共刺激信號，其磷酸化程度降低將有利于腫瘤細胞的免疫逃逸[12]。CAPZIP在腫瘤細胞中高表達或可與免疫細胞中的CAPZIP競爭性結合應激蛋白激酶，從而促進腫瘤細胞的免疫逃逸。

本研究對相關基因進行富集分析和相互作用分析可見，無論是對刺激的反應功能、蛋白質結合功能，還是主要定位于細胞膜和囊泡，這都與通路富集分析中的負性胸腺T細胞選擇、B細胞活化參與免疫反應、免疫球蛋白介導的免疫反應、調節適應性免疫反應和T細胞分化等結果相一致。這提示CXCR4促進胃癌患者預后不良的機制可能與對應激后免疫系統的調控有關。蛋白相互作用分析也同樣再次印證了這一點。相互作用分析結果可見BTK、DOCK2和PTPRC處于網絡核心，其中BTK對B淋巴細胞的發育、分化和信號傳導是必不可少的[13]，DOCK2可參與趨化因子響應的淋巴細胞遷移所需的細胞骨架重排[14]，PTPRC與DPP4結合后可作為T細胞共激活的正調節劑[15]。

綜上所述，CXCR4在提示胃癌患者預后中發揮重要作用，這可能與其通過調控免疫系統而促進腫瘤細胞免疫逃逸有關，這為胃癌的機制和藥物治療研究提供了一定參考。