GAP1基因缺失對上面發酵酵母高級醇代謝能力的影響

孫中貫，王孟祺，王亞平，肖冬光

(工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

小麥啤酒是以小麥芽作為主要原料，有時也使用未發芽的小麥作為原料生產的一類啤酒[1]．根據我國2008年頒布的GB/T 4927—2008[2]規定：小麥芽應占麥芽使用總量的 40%以上，而德國啤酒《純凈法》規定小麥芽用量占總原料的50%以上[3]；目前在國際上并未形成統一的規定．小麥啤酒采用上面發酵法釀制，發酵溫度一般為 20～24℃[4]，成品小麥啤酒具有泡沫潔白細膩、口味醇厚、苦味較輕、熱量高、營養豐富等特點[5-6]．

20世紀80年代，我國啤酒企業就已經開始引進小麥啤酒，但多年來小麥啤酒在消費者中的認知度并不高．近年來，隨著消費者的需求日趨多元化、細分化、個性化，同時由于全球大麥資源的短缺、價格的上漲；各地啤酒企業積極調整產品結構，開發高品質、多元化、個性化的產品[7]．其中，小麥芽以其優良的釀造特性而受到釀造者們的青睞[8-9]．但小麥啤酒由于其較高的發酵溫度以及原料中豐富的蛋白質含量，導致成品中高級醇含量高達300mg/L以上，而大麥啤酒的高級醇含量一般在 100mg/L以下，優質啤酒則需控制在 50mg/L左右[10-11]．高級醇含量過高，將導致飲用后產生口渴、頭痛等癥狀，不利于飲用者的身體健康，嚴重影響小麥啤酒的發展[12]．

高級醇是在啤酒釀造過程中，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)產生的主要風味代謝產物之一；其合成過程主要有兩條途徑：一種是以丙酮酸為代謝起始物的糖酵解合成代謝途徑；另一種是以氨基酸為代謝起始物的氨基酸分解代謝途徑，如圖1所示[10-13]．目前，有關高級醇的代謝研究主要集中在這兩條途徑上[11]，而有關酵母菌株碳、氮源代謝調控對高級醇代謝影響的研究還鮮有報道．

在釀酒酵母中，GAP1基因編碼的氨基酸轉運蛋白是一種通用型的氨基酸運輸載體，能夠將培養物中所有的在蛋白質中常見的D型和L型氨基酸轉運到酵母細胞內，供酵母生長代謝所用[14-15]．Chiva等[16]研究發現，GAP1基因的缺失不僅會影響釀酒酵母對氮源的利用，還對其他氨基酸轉運蛋白的表達產生了影響．GAP1基因對釀酒酵母氨基酸的利用具有十分重要的作用，這有可能影響釀酒酵母合成高級醇的代謝能力，但目前還沒有研究報道GAP1基因與高級醇代謝之間的關系．

本研究以上面發酵酵母 S17為出發菌株，通過構建GAP1一個等位基因敲除菌株和GAP1兩個等位基因敲除菌株，考察GAP1基因缺失對釀酒酵母高級醇代謝能力及發酵性能的影響．

圖1 釀酒酵母高級醇代謝網絡圖Fig. 1 Biosynthetic pathways of higher alcohols formation in Saccharomyces cerevisiae

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒及引物

本研究中所用菌株見表 1，引物見表 2．質粒pUG6(Kanr，包含loxP-KanMX-loxP)為本實驗室保存．其中，上面發酵酵母S17購于中國工業微生物菌種保藏中心(保藏號為CICC1929)．

表1 菌株Tab. 1 Strains

表2 引物Tab. 2 Primers

1.1.2 主要儀器

MS204S電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；PCR儀、核酸分析儀，美國Bio-Rad公司；全自動生長曲線分析儀，芬蘭 Bioscreen公司；1100系列高效液相色譜儀、7890A型氣相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；實時熒光定量PCR儀，美國AB公司．

1.1.3 培養基

酵母培養基(YEPD，g/L)：葡萄糖 20，蛋白胨20，酵母浸粉10，自然pH．

細菌培養基(LB，g/L)：胰蛋白胨10，氯化鈉10，酵母浸粉5，自然pH．

半乳糖誘導培養基(YEPG，g/L)：半乳糖 20，蛋白胨20，酵母浸粉10，自然pH．

麥芽汁培養基：稱量粉碎后的小麥芽，按 1﹕4的料水比，30℃投料并保持 30min，65℃保持90min，78℃保持 10min，經過濾、煮沸、冷卻至室溫后，調整表觀糖度至12°P．

以上培養基的固體培養基需加20g/L瓊脂粉．

1.2 實驗方法

1.2.1 目的片段的擴增

以上面發酵酵母 S17菌株的基因組 DNA為模板，利用引物對 GA-F/GA-R、DGA-F/DGA-R、GBF/GB-R、DGB-F/DGB-R擴增GAP1基因的兩條上游同源序列 GA和 DGA、兩條下游同源序列 GB和DGB．以質粒 pUG6為模板，GK-F/GK-R、DGKF/DGK-R為引物擴增KanMX、KanMX-D片段．

1.2.2 酵母的轉化和重組子的篩選

釀酒酵母的轉化采用 LiAc/SSDNA/PEG法[17].利用G418篩選轉化子，提取轉化子基因組進行PCR定點驗證．

1.2.3 啤酒發酵實驗

將甘油管中保存菌種轉接至 YEPD試管斜面30℃活化培養 2d．取活化后的斜面菌種 1環，接種于裝有50mL 12°P麥芽汁培養基的250mL三角瓶內，24℃靜置培養 36h．種子液經離心無菌水洗滌2次后得到酵母泥，按 0.5%的接種量接入盛有150mL麥芽汁培養基的 250mL三角瓶內，20℃靜置發酵．

1.2.4KanMX抗性基因的去除

采用 Cre/loxP報告基因挽救系統[18]，剔除陽性轉化子中的篩選標記基因KanMX．利用影印平板法篩選 G418抗性陰性轉化子，以 K-U/K-D為引物對進行PCR驗證．

1.2.5 實時熒光定量PCR(Real-time PCR)

酵母RNA的提取使用Yeast RNAiso Kit酵母總RNA提取試劑盒(TaKaRa公司)，采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa公司)進行基因組 DNA的去除和 cDNA的合成．使用SYBR?PremixEx TaqTMⅡ 試劑盒(TaKaRa公司)進行實時熒光定量 PCR，通過 ΔΔC(t)值法對目的基因及內參基因UBC6進行基因表達量的分析．

1.2.6 指標測定

生長曲線的測定：以 YEPD液體培養基為空白對照，采用全自動生長曲線測定儀測定菌液在波長為600nm處的吸光度．以時間為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制生長曲線．

CO2排放量的測定：發酵前預先稱量發酵體系總質量，發酵過程中每隔12h稱量1次，稱量前應先搖晃三角瓶，以去除發酵液中的 CO2，當質量減少小于0.1g時，表示發酵已經結束[19]．

糖類物質的測定：葡萄糖、麥芽糖和麥芽三糖含量測定采用高效液相色譜法[19]．高效液相色譜條件為：Bio-Rad公司的 Aminex HPX-87H色譜柱(300mm×7.8mm，9μm)，流動相為 5mmol/L 的稀硫酸，流量 0.6mL/min，柱溫 65℃，檢測器為示差折光檢測器，檢測器溫度 45℃．樣品稀釋到合適的質量濃度(低于 1000mg/L)并用 0.22μm 的濾膜過濾，進樣量20μL．

α–氨基氮含量的測定：采用茚三酮比色法測定．2mL樣品稀釋液中加入 1mL顯色劑，沸水浴中加熱 16min，立即在 20℃水浴中冷卻 20min，于570nm測定吸光度．

啤酒中高級醇含量的測定：啤酒發酵液經蒸餾后得到的樣品使用氣相色譜法測定．色譜條件：LAP-930色譜柱(50m×0.32mm×1.0μm)；檢測器為氫火焰離子化檢測器；初始柱溫 50℃，保持 8min，以5℃/min的升溫速率升至200℃，保持5min；進樣量1.0μL；分流比 10﹕1．

其他發酵參數的測定：利用手持糖度折光儀測定原麥汁的表觀糖度；利用斐林試劑法測定發酵液中還原糖的含量；酒精度及發酵度的測定依據啤酒分析方法進行[20]．

2 結果與討論

2.1 GAP1一個等位基因敲除重組菌株的構建

將GAP1基因上游同源序列GA片段、下游同源序列 GB片段和KanMX片段轉化上面發酵酵母S17，同源重組過程如圖2所示．對在G418質量濃度為50mg/L的YEPD平板上生長的轉化子進行PCR驗證，獲得的陽性轉化子命名為S17G．

重組菌株 S17G的 PCR驗證結果如圖 3所示．以重組菌株 S17G基因組為模板，以 G1-F/G1-R為引物能夠擴增得到長度為 1304bp的片段，以G2-F/G2-R為引物能夠擴增得到長度為1012bp的片段，兩條片段均與設計片段長度一致；而以出發菌株 S17基因組為模板無法獲得與目的片段長度一致的條帶，同時也沒有擴增得到其他長度的片段．PCR驗證結果證實，KanMX片段已整合到出發菌株 S17的基因組上，且整合位點正確．

構建GAP1兩個等位基因敲除的重組菌株，需要以重組菌株 S17G為模板，并再次利用KanMX抗性基因作為篩選標記，因而必須剔除存在于重組菌株S17G基因組上的KanMX抗性基因．利用 Cre/loxP報告基因挽救系統可以實現KanMX抗性標記的剔除和反復利用．

圖2 同源重組過程Fig. 2 Homologous recombining process

圖3 重組菌株S17G的PCR驗證Fig. 3 PCR verification of the mutant strain S17G

重組菌株S17G基因組中的KanMX抗性基因剔除的 PCR驗證結果如圖3(b)所示，將獲得的陽性轉化子命名為S17G-K．以K-U與K-D為引物，以重組菌株 S17G為模板，能夠擴增出長度為 1613bp的KanMX抗性基因片段；以重組菌株S17G-K為模板，無法擴增出與KanMX抗性基因長度一致的目的片段；結果證實重組菌株 S17G基因組中的KanMX抗性基因已被剔除．

重組菌株 S17G-K敲除GAP1一個等位基因的PCR驗證如圖 3(c)所示．以出發菌株 S17的基因組為模板，利用引物DG1-F/DG2-R能夠擴增得到1條長度為2148bp的片段，片段長度與設計片段長度大小一致．以重組菌株 S17G-K的基因組為模板，能夠擴增得到 2條長度分別為 2148bp和 755bp的片段，且片段長度與設計片段長度大小一致．PCR驗證結果表明重組菌株 S17G-K為GAP1一個等位基因敲除的重組菌株．

2.2 GAP1兩個等位基因敲除重組菌株的構建

采用縮進式基因整合的方式，即同源序列 DGA位于同源序列GA的下游區域，同源序列DGB位于同源序列GB的上游區域，且同源序列彼此之間均無重復區域，將上游同源序列 DGA片段、下游同源序列DGB片段和KanMX-D片段轉化重組菌株S17GK，同源重組過程參照圖2．獲得的G418抗性轉化子經PCR驗證，結果如圖4所示．

以重組菌株 S17G-K為出發菌株，再次進行GAP1基因的敲除，將得到的陽性重組菌株命名為S17G2．以重組菌株 S17G2基因組為模板，利用兩對引物 DG1-F/DG1-R、DG2-F/DG2-R能夠擴增獲得長度分別為1394bp和1033bp的片段，且片段長度與設計片段長度一致．而以出發菌株S17G-K的基因組為對照，無法擴增獲得與目的片段長度一致的片段，同時也沒有擴增得到其他長度的片段．PCR驗證結果證實，重組片段已整合到出發菌株S17G-K的基因組上，且整合位點正確．重組菌株 S17G2剔除KanMX抗性基因的重組菌株S17G2-K的PCR驗證如圖4(b)所示．以K-U與K-D為引物，以重組菌株S17G2為模板，能夠擴增獲得長度為 1613bp的KanMX抗性基因片段；以重組菌株 S17G2-K為模板，無法擴增得到與KanMX抗性基因長度一致的目的片段；結果證實重組菌株 S17G2基因組中的KanMX抗性基因已被剔除．

以重組菌株 S17G2-K的基因組為模板，利用引物 DG1-F/DG2-R能夠擴增得到長度分別為 1705bp和 755bp的片段，所得片段長度與設計片段長度大小一致，PCR驗證結果表明獲得的重組菌株 S17G2-K為GAP1兩個等位基因敲除的突變株．

圖4 重組菌株S17G2的PCR 驗證Fig. 4 PCR verification of the mutant strain S17G2

2.3 GAP1基因轉錄水平

為了檢測GAP1基因在重組菌株中的表達量，利用實時熒光定量 PCR技術，以 GAP1-F與 GAP1-R為引物，對重組菌 S17G、S17G2及親本菌株 S17的GAP1基因轉錄水平進行測定，結果如圖 5所示.

圖5 GAP1基因轉錄水平Fig. 5 Transcription of GAP1 gene

GAP1一個等位基因敲除后，其轉錄水平約降低了 65%，GAP1兩個等位基因敲除后，其轉錄水平為0；實驗結果表明，GAP1基因的敲除降低了其在釀酒酵母菌株S17中的表達水平．

2.4 重組菌株生長性能分析

以原始菌株S17為對照，對敲除GAP1一個等位基因的重組菌株 S17G和敲除GAP1兩個等位基因的重組菌株S17G2進行生長曲線的測定，結果如圖6所示．重組菌株的生長速率均受到了一定程度的影響．與原始菌株相比，重組菌株 S17G的生物量沒有發現顯著的變化；而重組菌株 S17G2的生物量受到了一定程度的影響，較原始菌株稍有下降．這可能是由于GAP1基因部分或完全敲除后菌株對氨基酸的吸收能力受到了影響，從而阻礙了菌體的生長．

圖6 重組菌株S17G、S17G2及親本S17的生長曲線Fig. 6 Growth curves of mutants S17G，S17G2 and parental strain S17

2.5 重組菌株發酵性能分析

對重組菌株及親本菌株進行全小麥麥芽汁發酵，每隔12h稱量1次，測定發酵液的CO2釋放量，結果如圖 7所示．重組菌株 S17G、S17G2與親本菌株S17相比，在整個發酵過程中重組菌株S17G的CO2釋放量較親本菌株 S17略低，重組菌株 S17G2的CO2釋放量最低；但重組菌株S17G及S17G2的整體發酵趨勢與親本菌株S17一致，說明GAP1基因的敲除沒有顯著影響菌株的發酵速率．

圖7 重組菌株S17G、S17G2及親本S17的CO2釋放量Fig. 7 CO2 emission amount of mutants S17G，S17G2 and parental strain S17

發酵結束后，測定各菌株發酵液中還原糖含量、酒精度及發酵度，進一步探究重組菌株的基本發酵性能，結果見表3．對表中數據進行t檢驗，結果表明重組菌與親本菌株 S17 發酵液的酒精度、還原糖含量以及發酵度均無明顯差異，說明GAP1基因的敲除沒有影響啤酒發酵的基礎指標．

2.6 不同菌株風味物質的代謝能力

重組菌株與親本菌株代謝產生高級醇和酯類物質的差異，見表 4．與出發菌株 S17相比，重組菌株S17G 發酵產生的總高級醇含量降低了 17.47%，其中異丁醇的生成量下降最為顯著，降低了46.01%，另外，在酯類物質中乙酸異戊酯的生成量降低了52.61%；重組菌株 S17G2 發酵產生的總高級醇含量進一步降低，降低了21.98%，其中除異丁醇的生成量下降最為顯著外，活性戊醇、正丙醇、異戊醇也有不同程度的降低，在酯類物質中，乙酸異戊酯的生成量降低了約 45.76%．這表明GAP1基因對釀酒酵母高級醇代謝具有極為顯著的影響．

表4 不同菌株風味物質代謝能力的比較Tab. 4 Comparison of flavor substance produced by different strains

2.7 α-氨基氮及糖類物質的代謝能力

利用茚三酮比色法測定發酵過程中重組菌株與親本菌株發酵液中α–氨基氮的含量，其變化趨勢如圖8所示．與親本菌株S17相比，重組菌株S17G和S17G2對α–氨基氮的利用能力明顯減弱，不僅利用速率出現不同程度的減緩，發酵結束后發酵液中α–氨基氮的含量也顯著增加．結果證明，GAP1基因的部分或完全缺失都會對上面發酵酵母 S17利用α–氨基氮的能力產生影響，但影響程度并沒有隨基因功能的減弱呈疊加效應．

圖8 不同菌株發酵過程中α-氨基氮的含量Fig. 8 Concentration of α-amino acid of different strains during fermentation

通過 HPLC 測定了發酵結束后，各菌株發酵液中麥芽糖、葡萄糖、麥芽三糖的含量，結果見表5．

表5 不同菌株糖類物質代謝能力的比較Tab. 5 Comparison of metabolic capacity of carbohydrates different strains

重組菌株 S17G、S17G2 和親本菌株 S17 均能夠充分利用全小麥麥芽汁中的葡萄糖和麥芽三糖；但對麥芽糖的利用，重組菌株與親本菌株相比存在顯著差異．發酵結束后，重組菌株 S17G 的麥芽糖利用能力降低31.08%，重組菌株S17G2 的麥芽糖利用能力降低35.14%．這些實驗結果表明，GAP1基因的部分或完全缺失對上面發酵酵母 S17利用麥芽糖的能力產生了一定影響．

重組菌株S17G與S17G2對α–氨基氮和麥芽糖的利用能力均呈現下降的趨勢，對重組菌株的發酵性能和生長性能產生了一定的影響，同時影響了重組菌株合成高級醇及酯類物質等次級代謝產物的能力.這可能是因為重組菌株對碳源和氮源利用能力的下降不足以對菌株的初級產物合成能力產生顯著的影響，而只是顯著影響了次級代謝產物的合成能力．

3 結 論

本實驗利用基因同源重組的原理及 Cre/loxP報告基因挽救系統，在上面發酵酵母菌株中實現了GAP1基因的單敲除和雙敲除．重組菌株 S17G及S17G2的高級醇合成能力得到不同程度的減弱．通用型氨基酸通透酶編碼基因GAP1的部分或完全缺失能夠減弱釀酒酵母對α–氨基氮的利用能力，同時對麥芽糖的利用能力產生一定程度的影響．發酵性能的測定結果表明，重組菌株符合啤酒發酵的基本要求，具有一定的實際應用潛力．