CMC/陽離子β-CD靜電自組裝水凝膠的制備及其緩釋性能

劉 瑜，徐 力，賈 盼，賈旺強，鄭進智，劉澤華

(天津市制漿造紙重點實驗室，天津科技大學輕工科學與工程學院，天津 300457)

羧甲基纖維素(CMC)作為一種天然無毒的聚陰離子纖維素醚，可用作 pH敏感型水凝膠的構建與設計[1]．基于 CMC等天然高分子材料制備得到的水凝膠具有較好的生物相容性、生物可降解性以及與活體組織的相似性，從而這類水凝膠更適合作為藥物輸送的載體[2]．因疏水性藥物與纖維素基水凝膠親水性聚合物網絡之間固有的不親和性，故其多用于水溶性藥物的輸送[3–6]，疏水性藥物在此類水凝膠中的釋放不能長時間控制[7]．為克服以上問題，可將β–環糊精(β-CD)與纖維素及其衍生物以水凝膠為載體進行有效地結合．

β-CD作為一種具有納米尺形疏水空腔結構的低聚糖，可用于提高疏水性藥物溶解度、穩定性及生物利用度等[8]．在現有報道中，多通過交聯聚合方法制備得到 β-CD與纖維素基材料相結合的水凝膠，但在制備過程中需使用有毒的交聯劑[9–10]，這較大程度地影響了所得水凝膠的生物相容性．Ghorpade等[11–12]則選用檸檬酸作為無毒的交聯劑分別制備得到了 β-CD/羥丙基甲基纖維素交聯水凝膠與 β-CD/CMC交聯水凝膠，并研究所得水凝膠對疏水性藥物酮康唑的載藥性能．嚴安等[13]基于CMC與陽離子β-CD的靜電相互作用得到了自組裝功能纖維，并將其抄片成紙應用于苯酚廢水的處理．此法雖與本研究基于同一原理，但所制備的材料缺乏水凝膠生物材料相關的優異特性．

本研究將利用CMC與陽離子β-CD之間的靜電作用，無需交聯劑，以一種簡便易行的方法制備得到智能型自組裝水凝膠用于疏水性藥物的載運．通過FITR、SEM 等表征方法對所得自組裝水凝膠基本性能進行分析，研究陽離子溶液濃度、組裝時間、陽離子 β-CD取代度等組裝條件對水凝膠性質的影響，測試水凝膠在不同 pH條件下的溶脹性能，探討疏水性藥物氯霉素在新型 pH敏感水凝膠中的控釋機理，并且利用 Korsmeyer-Peppas動力學模型擬合藥物釋放曲線．

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

CMC，DS 0.7，上海古長實業有限公司；2，3–環氧丙基三甲基氯化銨，分析純，上海笛柏化學品技術有限公司；酚酞，分析純，天津市化學試劑一廠；無水乙醇，分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司；氯霉素，分析純，上海麥克林生化科技有限公司；無水碳酸鈉，分析純，天津市江天化工技術有限公司；β-CD、氫氧化鈉、丙三醇，分析純，國藥集團化學試劑有限公司．

FTIR–650型傅里葉變換紅外光譜儀，天津市港東科技發展有限公司；UV–2550型多功能 UV-vis分析儀，日本SHIMADZU公司；JSM–IT300 LV型掃描電子顯微鏡，日本JEOL公司；ALpHR1–2 LD plus型冷凍干燥機，北京市五洲東方科技發展有限公司；DF–101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，河南省鞏義市予華儀器有限責任公司；VOS–60A 型真空干燥箱，施都凱儀器設備有限公司；Kjeltec 8400型全自動凱式定氮儀，丹麥 FOSS公司；TGL–20M 型高速臺式冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；HNY–100B型恒溫培養振蕩器，天津市歐諾儀器儀表有限公司．

1.2 水凝膠的制備

1.2.1 陽離子β-CD的合成

稱取10g β-CD于單口燒瓶中，加入一定量的氫氧化鈉溶液，于 70℃恒溫攪拌 5～10min后，加入2，3–環氧丙基三甲基氯化銨(陽離子醚化劑)于70℃下反應 5h．反應后，用無水乙醇浸泡，攪拌直至形成白色粉末狀物質．乙醇洗滌，抽濾，于 60℃真空烘箱中干燥至質量恒定．氫氧化鈉加入質量為 β-CD質量的2.2%，反應體系含水量為25%．

1.2.2 陽離子β-CD取代度的測定

采用全自動凱式定氮儀測定陽離子 β-CD的含氮量，通過式(1)計算陽離子β-CD的取代度．

式中：DS為陽離子β-CD的取代度；ws為樣品中氮的質量分數；w0為原 β-CD 中的氮的質量分數；162為β-CD中葡萄糖單元的相對分子質量；14為氮元素的相對原子質量；151.5為取代基團季銨基的相對分子質量．

1.2.3 自組裝水凝膠的制備

CMC溶液和陽離子 β-CD溶液直接混合進行組裝所形成的凝膠結構松散、強度低，故采用 CMC膜與陽離子 β-CD進行組裝，形成的組裝體狀態穩定，便于性能檢測和應用．以蒸餾水為溶劑，將 CMC在40℃下攪拌溶解，制成質量分數為 5%的溶液，加入10mL丙三醇，攪拌均勻后，以 2500r/min的轉速進行離心脫泡 6min．將離心后的溶液轉入培養皿，于55℃烘箱中干燥至質量恒定，即得CMC膜．取0.3g CMC膜浸泡在20mL一定濃度的陽離子β-CD溶液中，12min后取出，即得 CMC/陽離子 β-CD 自組裝水凝膠．

1.3 水凝膠的表征

1.3.1 凝膠中β-CD含量的測定

參照文獻[14]繪制標準曲線，通過最小二乘法擬合得到直線方程為 A＝0.93533–0.00604ρ，R2＝0.9989．式中：A為吸光度；ρ為 β-CD 質量濃度，mg/L．

稱取冷凍干燥后的干凝膠 50mg于 25mL比色管中，加入10mL蒸餾水，之后加入 2.00mL濃度為3.7×10-4mol/L的酚酞溶液，在搖床中以 110r/min的轉速振蕩 2h，再加入 2.00mL濃度 2.8×10-2mol/L的碳酸鈉溶液，定容至 25mL，搖勻，在 15min內測定其在 552nm 處吸光度，將測得的吸光度代入回歸方程得到β-CD質量濃度ρ．通過式(2)計算凝膠中β-CD含量．

式中：w為凝膠中β-CD 含量，mg/g；ρ為β-CD質量濃度，mg/L；V為溶液體積，L；m為干凝膠質量，g．

1.3.2 紅外光譜分析(FTIR)

稱取1mg絕干樣品與100mg光譜級KBr粉末混合研磨并壓片，使用紅外光譜儀進行掃描，波數范圍為 400～4000cm－1，分辨率為 1.5cm－1．

1.3.3 水凝膠的微觀形貌分析

將水凝膠樣品于超低溫保存箱(－65℃)淬冷后進行冷凍干燥，然后進行噴金處理，用 JSM–IT300 LV型掃描電子電鏡觀察其表面微觀形貌．

1.3.4 溶脹性能測試

稱取冷凍干燥后的干凝膠 50mg分別浸泡在20mL 配制的 pH＝4、6、7、8的磷酸氫二鈉–檸檬酸緩沖液及 pH＝10的甘氨酸–氫氧化鈉緩沖液中，到達溶脹平衡后取出，用濾紙吸干凝膠表面的水分，稱其質量[15]．

式中：SR為樣品溶脹率；md、ms分別為凝膠溶脹前后的質量．

1.4 水凝膠的載藥及緩釋性能

1.4.1 氯霉素標準曲線的繪制

準確稱取氯霉素 100mg，在不同介質中溶解，置于 100mL容量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，配制成1mg/mL 的溶液，準確移取 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL分別置于50mL容量瓶中，稀釋至刻度，用紫外分光光度計于 278nm 處測量其吸光度，得到標準曲線回歸方程．

介質為水時A1＝0.0834＋30.2300ρ1，R2＝0.99983；介質為 pH＝4的緩沖液時A2＝0.0966＋29.4770ρ2，R2＝0.99994；介質為 pH＝6 的緩沖液時A3＝0.0765＋29.6621ρ3，R2＝0.99951；介質為 pH＝7 的緩沖液時A4＝0.0858＋29.5690ρ4，R2＝0.99779．式中：A1、A2、A3、A4為吸光度；ρ1、ρ2、ρ3、ρ4為氯霉素質量濃度，mg/mL．

1.4.2 載藥實驗

稱取 50mg凍干后的水凝膠浸泡在 40mL質量濃度為1mg/mL的氯霉素水溶液中，24h后取出，在40℃烘箱干燥．將浸泡水凝膠后剩余的氯霉素溶液準確吸取 2mL置于 50mL容量瓶，稀釋至刻度．依據氯霉素濃度與吸光度之間的關系曲線，計算得出剩余溶液中的氯霉素含量，水凝膠的載藥量s即為氯霉素總量減去剩余氯霉素溶液中的含量．

1.4.3 體外模擬藥物釋放實驗

稱取載藥凝膠 50mg，分別置于 pH 4、6、7的50mL緩沖液中，放入(37.5±0.5)℃的搖床中以150r/min 振蕩．分別在第 20、40、60、120、240、360、480、600、720min取樣，測定其在 278nm 處的吸光度．代入回歸方程計算藥物釋放質量濃度，累積釋放率Q[16]為

式中：Q為第i次取樣后體系的累積釋放率，%；ρi為第i次取樣時藥物的釋放質量濃度，mg/mL；m為干凝膠質量，g；s為載藥量，mg/g；V1為每次取樣的體積，mL；V2為緩沖溶液的體積，mL．

2 結果與討論

2.1 靜電自組裝的驗證

為驗證水凝膠形成的驅動力為靜電自組裝，而不是因為 CMC本身在溶液中的溶脹及其高分子結構的簡單吸附過程，設計以下對照實驗進行驗證，結果見表1．

表1 靜電自組裝驗證實驗Tab. 1 Verification of electrostatic self-assembly

實驗中發現，CMC膜在蒸餾水中，5min開始溶解，90min后溶解完全(1#)；陽離子β-CD 在蒸餾水中能迅速溶解成透明溶液(2#)；而將 CMC膜浸泡在陽離子β-CD水溶液中，卻發現 CMC膜僅僅發生潤脹，不再溶解，即呈現凝膠的狀態(3#)．可見，CMC和陽離子β-CD之間發生了相互作用；在中性或堿性條件下，CMC膜因其存在的羧基負離子之間的靜電斥力而膨脹[17]，利于鏈的伸展，而溶液中陽離子 β-CD的季銨型陽離子基團與CMC的羧基陰離子可以通過靜電相互作用發生反應，即靜電自組裝，并起到交聯的作用，形成不溶于水的凝膠．在酸性條件下(4#)，CMC的羧基被質子化，降低了分子鏈間排斥力，溶脹性顯著降低，陽離子 β-CD也難以組裝到CMC分子鏈上．

陽離子 β-CD(2#)、自組裝水凝膠(3#)以及 4#所得樣品的紅外光譜如圖1所示．

圖1 不同樣品的紅外光譜圖Fig. 1 FTIR spectra of different samples

由圖 1可知：3410、2926cm-1分別是—OH 與C—H的伸縮振動吸收，因自組裝水凝膠體系中的CMC通過靜電作用負載了大量的陽離子β-CD，故兩處的吸收強度顯著增強．4#的 CMC膜因浸泡在酸性溶液中，羧基被大量質子化，產生氫鍵締合(二聚體)，故在 1724cm－1處出現二聚體 C＝O 伸縮振動吸收[18]．1410cm－1對應于 COO－的對稱伸縮振動吸收[17]，但發現 4#樣品 COO－的反對稱伸縮振動吸收在 1611cm－1左右，而自組裝水凝膠 COO－的反對稱伸縮振動在1635cm－1附近，說明CMC與陽離子β-CD交聯后破壞了原來羧酸根基團的多電子 π鍵體系[19]，使 COO-雙鍵加強，證明水凝膠體系中存在CMC 與陽離子 β-CD 的靜電自組裝．944cm－1處的吸收帶與 β-CD 中α–(1→4)連接的吡喃糖環的振動有關[20]，從圖中可以看出該吸收只出現在陽離子 β-CD 與自組裝水凝膠中．在酸性條件下，4#樣品雖然不溶，但這是 CMC質子化后不溶造成的，而非組裝體水凝膠，這進一步說明了自組裝水凝膠的驅動力為CMC與陽離子β-CD之間的靜電相互作用力．

2.2 組裝條件對凝膠中β-CD含量的影響

在質量分數 30%的 DS 0.68陽離子 β-CD溶液中，考察不同組裝時間對凝膠中 β-CD含量的影響，結果如圖 2所示．由圖 2可知：在 9min前，凝膠中β-CD含量隨著組裝時間迅速增加，在 9min時達到68.60mg/g，之后隨時間延長逐漸達到平衡，說明CMC與陽離子 β-CD的靜電自組裝是一個快速的過程．

圖2 組裝時間對凝膠中β-CD含量的影響Fig. 2 Effect of assembly duration on β-CD content in the gel

固定組裝時間12min，考察兩種不同取代度的陽離子 β-CD的溶液濃度對凝膠中 β-CD含量的影響，結果如圖 3所示．從圖 3可以看出：在陽離子 β-CD取代度固定情況下，自組裝水凝膠中 β-CD含量表現出隨溶液濃度增大而增大的現象．質量分數達 30%時，DS 0.68的凝膠中β-CD含量為69.69mg/g，且與40%時的70.85mg/g的含量差別不大．

圖3 不同濃度不同取代度陽離子 β-CD對 β-CD含量的影響Fig. 3 Effects of different concentration and degree of substitution of cationic β-CD on β-CD content

2.3 不同pH對水凝膠的溶脹性能的影響

將凍干的靜電自組裝水凝膠(自組裝條件為陽離子 β-CD 質量分數 30%、DS 0.68、反應時間 12min)分別置于不同 pH的緩沖液中測定其溶脹率，結果如圖4所示．由圖4可以看出，隨著pH的提高，自組裝水凝膠的溶脹率逐漸降低，表現出 pH敏感性．這是由于 pH越低，CMC分子鏈上的羧甲基質子化程度越大，導致其整體上與陽離子 β-CD間的靜電作用開始減弱，交聯層變薄同時交聯密度減小，交聯結構對內部水的限制減小，內部包含的大量溶劑對其溶劑化作用增強及凝膠體系中的 CMC鏈段更為舒展，故凝膠結構越來越疏松，溶脹率變大．但同時也需注意到pH的降低將會導致未交聯的 CMC之間的靜電斥力的減小，靜電斥力的減小有助于分子鏈相互纏繞導致凝膠結構的緊密，因此溶脹率的變化是以上兩方面影響因素的競爭結果．從結果上來看，交聯結構的變化對溶脹率的影響更為顯著．

圖4 不同pH下靜電自組裝水凝膠的溶脹率Fig. 4 Swelling rate of electrostatic self-assembled hydrogel at different pH values

2.4 水凝膠的微觀形貌分析

靜電自組裝水凝膠(自組裝條件為陽離子 β-CD質量分數30%、DS 0.68、反應時間12min)在不同pH緩沖液中溶脹后的微觀形貌如圖 5所示．靜電自組裝水凝膠在pH 4與pH 6的緩沖液中溶脹后，凝膠表現出疏松多孔結構，整體上具有纖維狀三維貫通的網絡結構，分布著較多比較雜亂的大孔洞，這有利于水凝膠快速、大量地吸水，同時進一步說明了該水凝膠在pH 4與pH 6條件下具有較高的溶脹率的原因．而當 pH繼續增大時，陰陽離子之間的靜電作用顯著增強，凝膠結構的交聯密度增大，高分子網絡的彈性有所下降，可以觀察到當pH 7與pH 8時其網孔變小，整體上表現為收縮結構，阻礙了孔道吸收溶劑的速率及數量，因而溶脹率有所下降．在 pH 10時，凝膠微觀形貌呈現致密的蜂窩狀，這可能是 CMC中絕大部分羧甲基的去質子化導致體系中產生更多的物理交聯及纏結，故存在著明顯的通道結構．

圖5 靜電自組裝水凝膠在不同 pH緩沖液中溶脹后的SEM圖Fig. 5 SEM images of electrostatic self-assembled hydrogel in different pH buffer after swelling

2.5 藥物包含及釋放性能

以CMC與DS 0.68的陽離子β-CD組裝成的水凝膠為例，當 β-CD 含量為 12.36、34.14、69.69mg/g時，水凝膠對氯霉素的載藥量分別為 11.43、33.33、215.33mg/g，其最高載藥量可達聚乙烯醇/殼聚糖水凝膠[21]對氯霉素載藥量的 10倍以上．此外發現，載藥量隨著 β-CD含量的增大而增大，這可能是因為藥物分子與 β-CD之間的絡合導致疏水相互作用力的增強[22]．

圖 6為載藥量 215.33mg/g的載藥凝膠(該凝膠的自組裝條件為陽離子 β-CD質量分數 30%、DS 0.68、反應時間 12min)在不同 pH 條件下的釋藥曲線．在所有pH下2h內都可觀察到水凝膠的藥物突釋，當 pH 4、6、7時，藥物釋放 120min的累積釋放率分別為47.74%、42.37%、32.05%，這主要是表面吸附藥物的釋放[12]．在 2h后藥物釋放顯著減緩，藥物開始長時間穩定釋放，當 pH 4、6、7時，藥物釋放720min的累積釋放率分別為 53.46%、48.86%、39.60%，具有明顯的控制緩釋特征．

此外，載藥凝膠在不同 pH下表現出不同釋藥速率，在相同的釋放時間內，pH越低，累積釋放率越高.

圖6 自組裝水凝膠在不同pH下藥物的釋放曲線Fig. 6 Drug release curves of self-assembled hydrogel at different pH

在藥物的釋放過程中，同時伴隨著凝膠骨架結構的解析和溶蝕，其擴散路徑長度不斷發生著變化，可以通過 Korsmeyer-Peppas模型來描述緩釋動力學機理[23–24]．

表 2為氯霉素釋放的 Korsmeyer-Peppas動力學模型參數．動力學機理取決于n[25]，即pH 4和6時，n≤0.45，藥物釋放機理屬于 Quasi-Fickian機理，此時凝膠骨架與藥物之間的相互作用力較弱；pH 7時，0.45＜n＜0.89，屬于 Non-Fickian機理，說明凝膠骨架與藥物之間的相互作用力顯著增強；當 n≥0.89，屬于以骨架溶蝕為主．

表2 氯霉素釋放的動力學模型參數Tab. 2 Parameters of different kinetics model for chloramphenicol release

3 結 論

(1)通過靜電自組裝水凝膠的驗證設計以及紅外光譜分析，證明 CMC/陽離子 β-CD水凝膠形成的驅動力為靜電自組裝，同時水凝膠中陽離子 β-CD的存在主要是依靠陰陽離子靜電作用的自組裝行為，而不是因為 CMC本身在溶液中的溶脹行為及其高分子結構的簡單吸附過程．

(2)CMC/陽離子β-CD水凝膠的溶脹率隨pH的增大而減小，具有良好的 pH敏感性，同時其微觀形貌在不同 pH條件下也表現出顯著差異，結果與溶脹性能的pH敏感行為相符．

(3)體外藥物釋放實驗表明 CMC/陽離子 β-CD水凝膠對氯霉素具有長效的緩釋作用，在中性條件下的釋藥速率低于酸性條件，采用 Korsmeyer-Peppas模型對釋藥過程的動力學數據進行擬合，在 pH 4和pH 6的緩沖液中符合Quasi-Fickian機理，而在pH 7的緩沖液中符合Non-Fickian機理．