飲用天然礦泉水中產氣莢膜梭菌檢測方法的改良

章海通，承海，邢家溧，，*，王紹輝，周霞霞，徐曉蓉，嚴小軍

（1.寧波市食品檢驗檢測研究院，浙江寧波315048；2.寧波大學海洋學院，浙江寧波315211；3.寧波大學食品與藥學學院，浙江寧波315211）

產氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）因能分解肌肉和結締組織中的糖類產生大量氣體并在體內形成莢膜而得名[1]，該菌是后壁菌門梭狀芽胞桿菌屬的一種，呈粗短的大桿狀，無鞭毛，專性厭氧的革蘭氏陽性菌[2]。多以芽胞形式分布于土壤等自然界中，也存在于人、動物及其腸道中，是腸道的正常菌群之一，同時也是一種條件致病菌[3-4]。

產氣莢膜梭菌在GB 8537-2018《食品安全國家標準飲用天然礦泉水》[5]標準中對其要求為從一批樣品中采集5 件樣品，每件樣品的采樣量50 mL，均不得檢出。檢驗方法按GB 8538-2016《食品安全國家標準飲用天然礦泉水檢驗方法》[6]將礦泉水過濾后的濾膜緊貼在亞硫酸鹽-多粘菌素-磺胺嘧啶瓊脂（sulfitepolymyxin-sulphadiazine agar，SPS） 上 36 ℃厭氧培養24 h，計數濾膜上的黑色菌落，并取黑色可疑菌落做進一步的驗證試驗。但實際檢驗過程中發現完全按照GB 8538-2016 方法檢驗，濾膜上截留的產氣莢膜梭菌在SPS 培養基上36 ℃厭氧培養24 h，并無明顯的黑色菌落，在此情況下容易誤認為被檢樣品中不含產氣莢膜梭菌，而導致漏檢。為此，本文對國標法進行改良，并對適用的培養基進行優選，以使檢測結果更加準確可靠。

1 材料與方法

1.1 菌株

產氣莢膜梭菌CICC22949：中國工業微生物菌種保藏中心，-70 ℃磁珠保藏。

1.2 主要培養基和試劑

亞硫酸鹽-多黏菌素-磺胺嘧啶瓊脂、胰胨-亞硫酸鹽-環絲氨酸瓊脂（tryptose-sulfite-cycloserine agar，TSC）、液體硫乙醇酸鹽培養基（thioglycollate medium，FTG）、動力-硝酸鹽培養基、緩沖動力-硝酸鹽培養基、含鐵牛奶培養基、卵黃瓊脂培養基、血平板、革蘭氏染色液：北京陸橋技術股份有限責任公司；孔徑為0.22 μm的無菌濾膜：廣東環凱微生物科技有限公司；飲用礦泉水：華潤萬家超市。

1.3 主要儀器

1378 二級生物安全柜：美國Thermo Fisher 公司；IF750 恒溫培養箱：德國 memmert 公司；Anaer obox IV多組分氣體培養系統：中國江雪公司；illiflex RLUS Pump 微生物過濾系統：美國Millipore 公司。

1.4 方法

1.4.1 菌懸液的制備

將保藏于磁珠中的標準儲備菌株接種于血平板上并置于36 ℃培養箱中厭氧培養，待血平板上長出明顯菌落，再挑取上述血平板上的單菌落接種于FTG 培養基并于36 ℃厭氧培養24 h，用0.85%的無菌生理鹽水連續梯度稀釋培養后的FTG 培養基，控制菌濃度在10 CFU/mL～102CFU/mL，無菌吸取1 mL 稀釋后的菌液加入到50 mL 無菌礦泉水中作為人工污染樣品。

1.4.2 國標方法檢測

按照國標方法GB 8538-2016《食品安全國家標準飲用天然礦泉水檢驗方法》，取50 mL 用產氣莢膜梭菌CICC22949 人工污染的水樣經孔徑為0.22 μm 的無菌濾膜過濾，將濾膜移至SPS 培養基上，于36 ℃厭氧培養24 h，觀察結果。

1.4.3 改良方法1——雙層培養基覆蓋法

水樣過濾同1.4.2 方法，將濾膜緊貼于SPS 培養基上后，先覆蓋一層（約10 mL）SPS 培養基，待其凝固后再加蓋一層（約5 mL）SPS 培養基，待培養基凝固后于36 ℃厭氧培養24 h，觀察結果。

1.4.4 改良方法2——培養基優選

采用雙層培養基改良法，分別選擇低濃度、中濃度、高濃度標準菌株菌懸液，應用SPS 培養基和TSC培養基對人工污染水樣進行檢測，各自計數黑色菌落，對定量檢測結果進行分析比對。同時取無菌礦泉水，采用雙層培養基覆蓋改良法檢測作為空白對照。

1.4.5 確證試驗

將可疑菌落接種于FTG 36 ℃培養基厭氧培養24 h，參照國標法分別做革蘭氏染色鏡檢、硝酸鹽還原試驗、牛奶發酵試驗、卵磷脂分解試驗。

2 結果與分析

2.1 國標法和改良法1的試驗結果對比

改良方法1 和國標方法檢測礦泉水中產氣莢膜梭菌在SPS 培養基上的菌落特征見圖1。

圖1 產氣莢膜梭菌在SPS 培養基上的菌落特征Fig.1 Colony characteristics of Clostridium perfringens on SPS medium

由圖1 可知，國標法濾膜上的菌落無黑色，采用雙層培養基覆蓋改良方法1 濾膜上有典型的黑色菌落，效果明顯。產氣莢膜梭菌在厭氧條件下能把TSC 和SPS 培養基中的亞硫酸鹽還原為硫化物，再與檸檬酸鐵銨反應產生硫化鐵而使菌落呈黑色[7]。除產氣莢膜梭菌外，其它的梭狀芽孢桿菌則被添加的抗生素所抑制[8]，因此濾膜上的黑色菌落具有一定的特征性[9]。產氣莢膜梭菌在培養基上生長過程中，硫化物的產生和鐵離子的直接接觸是菌落呈現黑色的關鍵因素[10]。由此推測，國標法因為濾膜的阻隔使細菌不能直接接觸到培養基中的鐵離子，從而不能產生黑色的硫化鐵，故菌落不呈黑色。在濾膜上加蓋一層培養基后，目標菌能和培養基充分接觸，因此能有效的避免上述情況，使平板上出現明顯的黑色菌落。當濾膜上的目標菌較多的時候，覆蓋第一層培養基的過程中可能會把部分濾膜上的產氣莢膜梭菌帶到培養基表面，使菌落不顯黑色或者黑色不明顯而影響計數結果。當其凝固后濾膜上的產氣莢膜梭菌已固定在培養基里面或者表面，最后再加蓋一層培養基，這樣可以讓所有的產氣莢膜梭菌都完全在培養基里面，經36 ℃厭氧培養后都能顯示明顯的黑色。

2.2 不同培養基的檢測結果比較

產氣莢膜梭菌在兩種培養基上的生長計數結果見表1 和圖2。

表1 產氣莢膜梭菌在兩種培養基上的計數結果（，n=5）Table 1 Enumeration results of Clostridium perfringens on two media（，n=5）

表1 產氣莢膜梭菌在兩種培養基上的計數結果（，n=5）Table 1 Enumeration results of Clostridium perfringens on two media（，n=5）

菌濃度選擇 SPS 上黑色菌落數 SPS 空白 TSC 上黑色菌落數 TSC 空白低濃度 4±1 0 8±1 0中濃度 17±1 0 37±1 0高濃度 68±3 0 132±5 0

圖2 產氣莢膜梭菌在TSC 和SPS 兩種培養基上的生長計數結果Fig.2 Growth counting results of Clostridium perfringens on two media of TSC and SPS

目前檢測產氣莢膜梭菌的選擇性培養基主要是TSC 和SPS，其中以TSC 最為常用，該培養基亦是美國分析化學家協會推薦用于分離產氣英膜梭菌的選擇性培養基[11]。采用雙層培養基覆蓋改良方法，產氣莢膜梭菌標準菌在TSC 平板和SPS 平板上均可形成典型的黑色菌落。同一水樣濾膜在TSC 平板上所形成的典型黑色菌落計數值高于SPS 平板上計數值，兩者間存在顯著性差異（P＜0.05）。由此推測，相比于SPS 培養基TSC 培養基更適合產氣莢膜梭菌的生長。圖2 為產氣莢膜梭菌在TSC 和SPS 兩種培養基上的生長計數情況。為了提高礦泉水中產氣莢膜梭菌的檢出率，防止漏檢，建議使用TSC 培養基作為計數用的選擇性培養基。綜合兩種改良方法，我們認為礦泉水中產氣莢膜梭菌的檢測方法可優化為TSC 培養基代替SPS 培養基，再用雙層培養基加以覆蓋，能使試驗現象更加明顯，計數效果更好，提高檢出率，盡量避免因方法原因帶來的漏檢。

2.3 確證試驗結果

按照國標方法，挑取濾膜上單個黑色可疑菌進行確證試驗，結果見表2、圖3～圖5。

表2 產氣莢膜梭菌確證試驗結果及現象Table 2 Confirmatory test results and phenomena of Clostridium perfringens

圖3 產氣莢膜梭菌染色鏡檢和卵磷脂分解試驗結果Fig.3 Results of microscopic examination and lecithin decomposition test of Clostridium perfringens

圖4 動力硝酸鹽試驗結果Fig.4 Dynamic nitrate test results

圖5 產氣莢膜梭菌牛奶分解試驗結果Fig.5 Results of milk decomposition test of Clostridium perfringens

鏡檢可見該菌為革蘭氏陽性粗大桿菌，偶見芽孢，硝酸鹽還原試驗、卵磷脂分解試驗和牛奶發酵試驗均為陽性。產氣莢膜梭菌能產卵磷脂酶分解卵黃平板中的卵磷脂，因此點種點周圍會出現乳白色的渾濁帶；且此菌無動力，穿刺線不呈擴散生長，能還原硝酸鹽，培養基變紅色；產氣莢膜梭菌會發酵乳糖，凝固酪蛋白，呈“爆裂發酵”現象，培養基不變黑。此外，試驗結果發現，與動力硝酸鹽培養基相比，采用緩沖動力硝酸鹽培養基進行硝酸鹽還原試驗，顯色反應更快速，色差顯示更明顯。

3 討論

在實際工作中積累的一些經驗也有利于對檢測方法的準確掌握和運用。首先，當樣品污染程度較高的時候，取樣過濾時，為了獲得較好的計數效果，可將原液進行適當的稀釋。盡量使用新鮮配制的培養基，如果培養基在空氣中長時間暴露，表面的氧化還原電勢下降，會影響厭氧菌的生長發育，相關文獻也有類似的報道[12]。其次，TSC 培養基并非能抑制其他所有的雜菌，挑取可疑的黑色菌落接種至FTG 培養基培養后，若鏡檢發現培養液不純，則需將黑色菌落劃線至TSC 分離純化[13]，再挑取單個典型的黑色菌落接種至FTG 培養基，用于后續的確證試驗。最后，在確證試驗過程中，“爆裂發酵”現象與含鐵牛奶培養基的配制方式有一定的相關性，經高溫高壓滅菌的培養基的試驗效果沒有煮沸滅菌法配制的含鐵牛奶培養基效果佳，這可能是由于在高溫高壓下部分牛奶會出現變性而影響牛奶發酵試驗的效果。分別采用動力硝酸鹽培養基和緩沖動力硝酸鹽培養基進行硝酸鹽還原試驗，結果發現無論是顏色的辨識度還是顯色速度都是緩沖動力硝酸鹽培養基優于動力硝酸鹽培養基，因此建議用緩沖動力硝酸鹽培養基代替動力硝酸鹽培養基做硝酸鹽還原試驗。

本文從檢測方法完善和培養基優選兩方面對礦泉水中產氣莢膜梭菌濾膜檢測國標法進行改良，用新鮮配制的TSC 培養基經雙層培養基覆蓋改良后的方法檢測產氣莢膜梭菌，現象更明顯，結果更可靠，更適合飲用天然礦泉水中產氣莢膜梭菌的檢驗。提高了飲用礦泉水中產氣莢膜梭菌檢測的準確性。隨著檢測技術的不斷發展，微生物的鑒定手段更加多樣，有條件的實驗室也可以同步采用全自動微生物鑒定系統、基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術或聚合酶鏈式反應方法進行鑒定[14-16]，結合對傳統檢測方法的改進，必將進一步提高產氣莢膜梭菌鑒定結果的高效性和準確性。