檳榔中苯并（α）芘檢測(cè)方法研究

吳海智，周叢，冉丹，達(dá)麗君

（湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖南長(zhǎng)沙410007）

苯并（α）芘是一種強(qiáng)致癌物，是多環(huán)芳烴類中毒性最大的一種，其毒性超過黃曲霉毒素，對(duì)動(dòng)物和人均具有致癌作用[1-2]。檳榔一般采用煙熏烘烤加工[3]，而熏烤過程中由于木炭、煤炭等燃燒不完全容易產(chǎn)生苯并（α）芘，從而污染食品[4]。GB 2762-2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》以及檳榔兩大生產(chǎn)省份海南省食用檳榔地方標(biāo)準(zhǔn)DB 46/T 75-2007《食用檳榔》、湖南省食用檳榔地方標(biāo)準(zhǔn)DB 43/132-2004《食用檳榔》均未對(duì)檳榔中苯并（α）芘含量做出限量要求，以致檳榔中苯并（α）芘含量屬于無(wú)人監(jiān)管監(jiān)測(cè)的狀態(tài)，存在食品安全隱患。

現(xiàn)行的苯并（α）芘的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.27-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中苯并（α）芘的測(cè)定》，適用范圍不包括檳榔，且國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法存在操作時(shí)間較長(zhǎng)、測(cè)試成本較高和回收率不穩(wěn)定等問題。而目前對(duì)檳榔中苯并（α）芘檢測(cè)方法的研究主要集中在氣-質(zhì)聯(lián)用法或液質(zhì)法[5-7]，這些方法對(duì)儀器要求較高，難以普及。因此開展對(duì)檳榔中苯并（α）芘檢測(cè)方法研究，尋求一種準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 儀器

LC-30A 型超高效液相色譜儀（包括四元汞、脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、化學(xué)工作站、熒光檢測(cè)器）：日本島津公司；GM200 刀式研磨儀：德國(guó)萊馳公司；SI-234 電子天平：美國(guó)丹佛儀器公司；Allegra 25R 高速離心機(jī)：美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；YQ-1007A 超聲波清洗器：上海易凈超聲波儀器有限公司。

1.1.2 試劑材料

Diamon sil C18 柱、中性氧化鋁柱Dikma：迪馬科技有限公司；分子印跡柱CNW Ploy-sery MIP-Bap：上海安譜科學(xué)儀器有限公司；乙腈（色譜純）、正己烷（色譜純）、二氯甲烷（色譜純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；苯并（α）芘標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98.8%）：Dr.Ehrenstorfer公司。

檳榔煙熏原果：湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院提供；檳榔成品：長(zhǎng)沙各檳榔經(jīng)銷店。

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精確稱取 10 mg 苯并（α）芘于 100 mL 容量瓶中，用少量甲苯溶解后，用乙腈溶解定容，配制成0.1 mg/mL的儲(chǔ)備液。吸取儲(chǔ)備液1 mL，用乙腈定容至100 mL，配制成1 000 ng/mL 的中間液，再分別吸取一定量的中間液用乙腈稀釋成 1、5、10、20、50、100 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定分析，以標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理優(yōu)化

對(duì)樣品的前處理方法中超聲輔助提取時(shí)間、提取次數(shù)進(jìn)行了選擇，并對(duì)樣品的凈化方法進(jìn)行了比較研究，重點(diǎn)比較了未凈化和經(jīng)GB 5009.27-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中苯并（α）芘的測(cè)定》規(guī)定的兩種凈化方法對(duì)樣品的凈化效果。

1.2.2 樣品的前處理

將樣品去除輔料，用刀式研磨儀將檳榔制備成蓬松形狀，用于樣品分析。準(zhǔn)確稱取0.5 g 左右的樣品于50 mL 具塞離心管，加入15 mL 正己烷，超聲提取10 min后，5 000 r/min 離心5 min，轉(zhuǎn)移出上清液，并用少量正己烷潤(rùn)洗殘?jiān)c上清液合并于40 ℃氮吹濃縮至干，用1 mL 乙腈渦旋復(fù)溶0.5 min，過0.45 μm 有機(jī)濾膜后按照選定的色譜條件進(jìn)樣分析。

1.2.3 色譜條件

Diamon sil C18 柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）反相色譜柱；熒光檢測(cè)器檢測(cè)：激發(fā)波長(zhǎng)384 nm，發(fā)射波長(zhǎng)406 nm；柱溫 35 ℃，進(jìn)樣量 10 μL；流動(dòng)相：乙腈 ∶水=88 ∶12，流速 1.0 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲輔助提取時(shí)間的選擇

超聲輔助提取時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響見圖1。

圖1 超聲輔助提取時(shí)間的選擇Fig.1 The selection of ultrasound-assisted extraction time

從圖1 可以看出，超聲時(shí)間＜10 min 時(shí)，檢測(cè)值隨超聲時(shí)間的增加而升高，當(dāng)超聲時(shí)間為10 min 時(shí)，樣品檢測(cè)值不再升高，提取效率達(dá)到最大。

2.2 超聲輔助提取次數(shù)的選擇

提取次數(shù)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響見圖2。

圖2 超聲輔助提取次數(shù)的選擇Fig.2 The selection of ultrasound-assisted extraction number

從圖 2 可以看出，樣品苯并（α）芘檢測(cè)值在5 μg/kg～40 μg/kg 范圍內(nèi)，超聲輔助提取1 次和提取2 次的檢測(cè)結(jié)果基本保持一致，超聲輔助提取次數(shù)對(duì)結(jié)果影響很小。

2.3 凈化方法的選擇

未凈化和經(jīng)GB 5009.27-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中苯并（α）芘的測(cè)定》規(guī)定的兩種凈化方法凈化后的檳榔煙熏原果色譜對(duì)照?qǐng)D見圖3。

從圖3 可以看出，未凈化的樣品色譜圖雜峰相對(duì)較多、較高，但在苯并（α）芘出峰附近無(wú)明顯干擾峰，分離定性定量效果良好；經(jīng)分子印跡柱凈化后樣品色譜圖，譜圖雜峰會(huì)減少，但是雜峰依舊很多，且過柱操作的時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本較高；經(jīng)中性氧化鋁柱凈化后雜峰會(huì)明顯減少很多，但是中性氧化鋁柱存在回收率不穩(wěn)定以及柱容量有限等問題，故本研究選擇對(duì)樣品不進(jìn)行凈化操作。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性方程

圖3 色譜對(duì)照?qǐng)DFig.3 Chromatogram comparison

將標(biāo)準(zhǔn)工作溶液依次經(jīng)液相色譜儀測(cè)試分析，以標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，作圖得苯并（α）芘的線性方程及相關(guān)系數(shù)見表1。

表1 線性方程及相關(guān)系數(shù)Table 1 The linear equation and correlation coefficient

2.4.2 精密度、回收率

在未檢出苯并（α）芘的檳榔樣品中進(jìn)行3 個(gè)水平（0.5、5、20 μg/kg）、6 個(gè)平行的加標(biāo)回收試驗(yàn)，測(cè)定后得到苯并（α）芘的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。在本試驗(yàn)條件下，3 個(gè)添加水平下苯并（α）芘的平均回收率為97.5%～102%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.11%～4.64%，結(jié)果見表2。

表2 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 2 Results of recovery rate（n=6）

根據(jù)GB/T 27404-2008《試驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范》規(guī)定，添加水平在＜0.1 mg/kg，回收率范圍應(yīng)在60 %～120%，變異系數(shù)＜15%，方法加標(biāo)檢測(cè)結(jié)果滿足規(guī)范要求。

2.4.3 準(zhǔn)確度

本方法與GB 5009.27-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中苯并（α）芘的測(cè)定》方法比對(duì)結(jié)果見表3。

表3 方法比對(duì)結(jié)果Table 3 The results of method comparison

結(jié)果顯示，不同方法的測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值均小于算術(shù)平均值的5%，表明本方法具有較高的準(zhǔn)確度。

2.4.4 方法檢出限、定量限

在0.5 g 未檢出苯并（α）芘檳榔樣品中加入0.25 ng苯并（α）芘對(duì)照品，以基線10 倍噪聲值為定量限在標(biāo)準(zhǔn)曲線查得結(jié)果計(jì)算[8]，測(cè)得方法檢出限為0.5 μg/kg。

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

對(duì)42 批次的檳榔煙熏原果、21 批次市售檳榔成品的苯并（α）芘含量進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果分別見表4、表5。

表4 檳榔煙熏原果測(cè)定結(jié)果Table 4 Test results of areca nut smoked fruits

續(xù)表4 檳榔煙熏原果測(cè)定結(jié)果Continue table 4 Test results of areca nut smoked fruits

表5 檳榔成品測(cè)定結(jié)果Table 5 Test results of areca nut products

由表4 可見，檳榔煙熏原果的苯并（α）芘檢出率高達(dá)95.2%，最高檢測(cè)值為45.2μg/kg。由表5 可見，市售檳榔成品中苯并（α）芘檢出率為76.2%，最高含量為21.4 μg/kg。無(wú)論是檳榔煙熏原果還是市售檳榔成品苯并（α）芘檢出率和檢出值都較高，以GB 2762-2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》對(duì)植物油苯并（α）芘限量要求≤10 μg/kg 為判定要求，煙熏原果問題檢出率為73.8%，市售的食用檳榔成品問題檢出率為23.8%。以日本及國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)對(duì)一般食品限量要求≤5 μg/kg 為判定要求，則煙熏原果問題檢出率高達(dá)90.5%，市售的檳榔問題檢出率也達(dá)到了33.3%。

3 結(jié)論

本文對(duì)檳榔中苯并（α）芘檢測(cè)方法進(jìn)行了研究，建立了檳榔中苯并（α）芘殘留的高效液相色譜快速測(cè)定法。試驗(yàn)結(jié)果表明，方法加標(biāo)回收率為97.5%～102%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.11%～4.64%，線性相關(guān)系數(shù)R=0.999 99，定量限為0.5 μg/kg。該法樣品前處理簡(jiǎn)單，試劑消耗少，分析時(shí)間短，準(zhǔn)確性和精密度好，適用于檳榔中苯并（α）芘的定性定量檢測(cè)。同時(shí)本研究還對(duì)檳榔煙熏原果和市售檳榔成品的苯并（α）芘含量進(jìn)行了測(cè)定，測(cè)定結(jié)果顯示，煙熏原果問題檢出率高達(dá)90.5%，市售的檳榔問題檢出率也達(dá)到了33.3%。