基于液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用和質(zhì)量虧損過(guò)濾技術(shù)的黃葵黃酮類成分系統(tǒng)分析

高芯 萬(wàn)瑤瑤 李長(zhǎng)印 段徐彬 丁選勝 居文政

摘?要?采用液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用（High-performance liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry，LC-TOF-MS）分析黃葵總黃酮（Total flavones of Abelmoschus manihot L. Medic，TFA）提取物，采集其正負(fù)離子模式下的LC-TOF-MS分析數(shù)據(jù)。借助質(zhì)量虧損過(guò)濾（Mass defect filter，MDF）技術(shù)提取原始數(shù)據(jù)中黃酮類相關(guān)特征離子，通過(guò)TOF-MS精確分子量歸屬各離子的元素組成及離子類型，根據(jù)元素組成和離子類型的相關(guān)性合并可能源自同一個(gè)化合物的準(zhǔn)分子離子和碎片離子，依據(jù)不少于2個(gè)準(zhǔn)分子離子的出現(xiàn)篩選確認(rèn)目標(biāo)化合物。借助標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)、 文獻(xiàn)查閱、 數(shù)據(jù)庫(kù)搜索等手段解析選定的目標(biāo)化合物的母離子和子離子圖譜，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定或合理歸屬。最終從TFA中篩選并初步鑒定出49種黃酮類化合物。鑒定結(jié)果表明， TFA中黃酮類化合物的形成主要涉及糖基化、 甲基化、 甲酰化、 乙酰化和葡萄糖醛酸化等轉(zhuǎn)化反應(yīng)。本研究豐富了對(duì)黃葵化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)的認(rèn)識(shí)，可為全面評(píng)價(jià)黃葵制劑質(zhì)量、 深入開(kāi)展黃葵藥效學(xué)研究提供重要參考; 同時(shí)也表明LC-TOF-MS分析結(jié)合MDF技術(shù)是一種適用于中藥化學(xué)成分的系統(tǒng)篩選方法。

關(guān)鍵詞?黃葵; 黃酮; 液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜; 質(zhì)量虧損過(guò)濾; 成分系統(tǒng)篩選; 結(jié)構(gòu)鑒定

1?引 言

中藥黃蜀葵花為錦葵科秋葵屬植物黃蜀葵（Abelmoschus manihot L. Medic）的干燥花，在《嘉佑本草》和《中華本草》中均有記載，其味甘、 辛，性涼，入肺、 腎、 膀胱經(jīng)，有清利活血、 消腫解毒之功效，用于治療淋病及癰疽腫毒。黃葵膠囊為黃蜀葵花的特色中藥制劑，臨床上廣泛用于慢性腎病、 糖尿病腎病等疾病的治療，療效確切且安全性良好[1～3]。研究表明，黃酮類成分為黃葵膠囊和黃蜀葵花的主要化學(xué)成分和藥效活性成分[4～9]。

全面了解黃葵制劑中黃酮類成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)信息，是闡明黃葵藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、 評(píng)價(jià)黃葵相關(guān)制劑質(zhì)量和安全性的前提和基礎(chǔ)。液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用（Liquid chromatography-time-of-flight mass spectrometry，LC-TOF-MS）技術(shù)結(jié)合了液相色譜高效的分離能力及質(zhì)譜高分辨率、 高質(zhì)量精度的檢測(cè)能力，非常適用于中藥復(fù)雜化學(xué)成分的系統(tǒng)定性分析[9，10]。但是，LC-TOF-MS分析會(huì)產(chǎn)生復(fù)雜多維的研究數(shù)據(jù)，解析這些數(shù)據(jù)對(duì)于研究者是很大的挑戰(zhàn)。近年來(lái)，質(zhì)量虧損過(guò)濾（Mass defect filtering，MDF）技術(shù)作為處理TOF-MS等高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)的新方法[11]，已被證明非常適用于中藥化學(xué)成分的定性分析，特別是對(duì)某一類型（如黃酮、 皂苷等）化學(xué)成分的全面篩選和提取[12～16]。另一方面，各種開(kāi)源和商業(yè)的化合物數(shù)據(jù)庫(kù)則為中藥化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)鑒定提供了極大便利。如AB Sciex和Agilent等儀器公司近期先后推出了與儀器配套的中藥高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù); 而PubChem、 ChemSpider等開(kāi)源數(shù)據(jù)也在不斷豐富和完善中。參考上述數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)合化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)和裂解規(guī)律解析，可以對(duì)篩選所得的中藥材化學(xué)成分進(jìn)行合理的結(jié)構(gòu)解析和歸屬。基于此，本研究首先對(duì)黃葵總黃酮（Total flavones of Abelmoschus manihot，TFA）提取物進(jìn)行LC-TOF-MS數(shù)據(jù)采集; 而后根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[4～9]，建立篩選黃葵黃酮類化合物的MDF方法，全面提取LC-TOF-MS分析數(shù)據(jù)中的黃酮類化合物相關(guān)離子; 然后結(jié)合母離子的共存在，系統(tǒng)篩選確認(rèn)TFA中存在的黃酮類化合物; 最后，參考標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)及其特征離子解析、 AB Sciex中藥高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)、 PubChem等網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)篩選所得化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定或合理歸屬，以期全面表征黃葵中所含有的黃酮類化合物的種類和存在形式。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

LC（美國(guó)Agilent公司）-Triple TOFTM 5600液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)AB公司），配有PeakView version1.2數(shù)據(jù)處理軟件和質(zhì)譜自動(dòng)校準(zhǔn)調(diào)諧系統(tǒng)（CDS）; CPA225D電子天平（德國(guó)Sartorius公司）; Thermo Sorvall Legend Micro 17R離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）; WH2微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）; Millipore Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)（Milli-Q公司）。

甲醇和乙腈（HPLC級(jí)，德國(guó)Merck公司）; 甲酸、 甲酸銨（質(zhì)譜級(jí)，瑞士Fluka-Sigma-Aldrich公司）; TOF-MS正離子調(diào)諧液（美國(guó)AB Sciex公司），批號(hào)4460131; TOF-MS負(fù)離子調(diào)諧液（美國(guó)AB Sciex公司），批號(hào)4460134; 化學(xué)對(duì)照品共8個(gè)，分別為： 蘆丁（Rutin，批號(hào)B20771，上海源葉生物科技有限公司）、 金絲桃苷（Hyperoside，批號(hào)B20631，上海源葉生物科技有限公司）、 棉皮苷（Gossypin，批號(hào)B29264，上海源葉生物科技有限公司）、 棉皮素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸（Gossypetin-8-O-β-D-glucuronide，批號(hào)ZES-1364S，法國(guó)EXTRASYNTHESE公司）、 棉皮素（Gossypetin，批號(hào)ZES-1176，法國(guó)EXTRASYNTHESE公司）; 楊梅素（Myricetin，批號(hào)B21458，上海源葉生物科技有限公司）、 異槲皮素（Isoquercitrin，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司）、 槲皮素（Quercetin，批號(hào)13072505，購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司）。

TFA提取物工藝簡(jiǎn)述如下： 黃蜀葵花藥材先以60%乙醇回流提取，醇提液減壓濃縮，得到不含醇的水提液; 而后將水提液用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯萃取液，在旋蒸儀上減壓濃縮，并將所得物干燥粉碎，得粉末狀TFA提取物，其含量以總黃酮計(jì)>60%。

2.2?實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1?樣品處理?準(zhǔn)確稱取TFA提取物20 mg， 溶于10 mL 70% 甲醇中， 制成母液， 取1 mL母液稀釋10倍， 渦旋混勻， 在4℃以12000 g離心5 min， 取5 μL上清液進(jìn)樣分析。

準(zhǔn)確稱取8個(gè)對(duì)照品適量， 以甲醇溶解并稀釋至適當(dāng)濃度， 等量混合， 制備混合標(biāo)準(zhǔn)溶液， 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中各化合物的終濃度均約為100 ng/mL。取5 μL上清液進(jìn)樣分析。

2.2.2?色譜-質(zhì)譜條件?AgilentPoroshell 120 SB-C18色譜柱（100 mm×3.0 mm， 2.7 m）; Agilent Poroshell 120 SB-C18預(yù)柱（5 mm ×3.0 mm， 2.7 m）; 流動(dòng)相A為水+5 mmol/L甲酸銨+0.1%甲酸+0.1%甲醇， 流動(dòng)相B為乙腈-水（9∶1，V/V）+5 mmol/L甲酸銨+0.1%甲酸。梯度洗脫程序： 0～0.5 min， 5% B; 0.5～12 min， 5%～100% B; 12～16 min， 100% B; 16～16.1 min，100%～5% B; 16.1～22 min， 5% B。流速為300 L/min， 柱溫為35℃， 進(jìn)樣體積5 L， 進(jìn)樣室溫度為8℃。

電噴霧離子源以正負(fù)離子模式采集數(shù)據(jù)， TOF-MS掃描模式參數(shù)設(shè)置如下： 分子量掃描范圍m/z 100～1000， 累積時(shí)間0.250015 s; 離子化溫度（TEM）： 550℃; 霧化氣（GS1）： 60 psi （1 psi=6.895 kPa）; 輔助加熱氣（GS2）： 60 psi; 氣簾氣（CUR）： 35 psi; 去簇電壓（DP）： 80 V; 碰撞能量（CE）： 10 eV; 正負(fù)離子模式下噴霧電壓（ISVF）分別為5500 V和4500 V。采用信息關(guān)聯(lián)采集（Information dependent acquisition， IDA）、 智能化的動(dòng)態(tài)背景扣除（Dynamic background subtraction， DBS）和高靈敏度的模式采集數(shù)據(jù)。主要的IDA轉(zhuǎn)換標(biāo)準(zhǔn)如下： 信號(hào)強(qiáng)度大于500 cps， 4 Da以內(nèi)排除同位素， 分子量誤差50 mDa， 每個(gè)循環(huán)最多監(jiān)測(cè)8個(gè)候選離子。子離子掃描模式的參數(shù)設(shè)置如下： 分子量掃描范圍m/z 50～m/z1000， 累積時(shí)間0.100006 s; CE： （35±15） eV; 其它主要參數(shù)同TOF-MS掃描模式。采用AB公司的調(diào)諧液傳遞系統(tǒng)（CDS）對(duì)分子量準(zhǔn)確度進(jìn)行自動(dòng)校準(zhǔn)。通過(guò)AB公司的軟件Analyst TF 1.6.2 software控制儀器操作和數(shù)據(jù)采集。

2.2.3?黃葵黃酮類化合物的MDF篩選和鑒定?首先，根據(jù)文獻(xiàn)[4～9]報(bào)道構(gòu)建黃葵中黃酮類化合物的分子式數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)PeakView軟件（AB Sciex公司，Version 1.2）的Mass Calculator功能計(jì)算得到該類化合物的7種常見(jiàn)準(zhǔn)分子離子（正離子模式下的[M+H]+、 [M+Na]+和[M+NH4]+，負(fù)離子模式下的分子量和質(zhì)量虧損范圍，詳見(jiàn)表1。

在此基礎(chǔ)上，引入適當(dāng)?shù)脑试S誤差，設(shè)定合適的分子量和質(zhì)量虧損范圍，對(duì)LC-TOF-MS原始數(shù)據(jù)進(jìn)行黃酮類相關(guān)特征離子的MDF過(guò)濾。通過(guò)PeakView的IDA Explorer功能從MDF過(guò)濾后的數(shù)據(jù)中提取可產(chǎn)生子離子的特征離子。結(jié)合前期研究[15，16]，初設(shè)離子信號(hào)強(qiáng)度下限分別設(shè)為12000 cps（正離子模式）和7000 cps（負(fù)離子模式）。

利用PeakView的Formula Finder功能對(duì)篩選所得目標(biāo)離子的元素組成進(jìn)行預(yù)測(cè)。其中，碳?xì)溲踉訑?shù)目和不飽和度的范圍設(shè)定如表1所示，分子量最大允許誤差10

5，正離子模式下氮、 鈉和鉀原子0～1個(gè); 負(fù)離子模式下氮、 氯原子0～1個(gè)。

采用XIC Manager功能提取篩選所得的目標(biāo)離子，以檢驗(yàn)其峰形完整性，確認(rèn)其準(zhǔn)確保留時(shí)間; 根據(jù)保留時(shí)間和TOF-MS提供的精確分子質(zhì)量的匹配度，合并源自一個(gè)化合物的多個(gè)特征準(zhǔn)分子離子（如正離子模式下的[M+H]+、 [M+Na]+、 [M+K]+、 [M+NH4]+，及負(fù)離子模式下的[M-H]

、 [M+HCl-H]

、 [M+HCOOH-H]

、 [M+HNO3-H]

等），通過(guò)至少兩個(gè)準(zhǔn)分子離子的存在確認(rèn)每個(gè)化合物的存在。同時(shí)通過(guò)XIC提取，確認(rèn)鎖定的化合物并補(bǔ)充其同分異構(gòu)體。

借助標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)、 文獻(xiàn)報(bào)道和PubChem等數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，解析IDA Explorer提供的子離子信息，對(duì)篩選得到的目標(biāo)化合物進(jìn)行初步鑒定。

3?結(jié)果與討論

3.1?化合物篩選方法的確定

質(zhì)量虧損和分子量篩選范圍的設(shè)定依據(jù)為已有文獻(xiàn)報(bào)道的黃葵黃酮類化合物。匯總文獻(xiàn)[4～9]中相關(guān)信息可知，已知的黃葵相關(guān)黃酮類化合物共涉及到32個(gè)不同的分子式。借助Peakview軟件的Mass calculator功能計(jì)算獲得32個(gè)分子式的各種準(zhǔn)分子加合離子包括正離子模式下[M+H]+、 [M+NH4]+和[M+Na]+及負(fù)離子模式下[M-H]

、 [M+HCOOH-H]

、 [M+HNO3-H]

和[M+HCl-H]

的精確分子質(zhì)量，構(gòu)建相應(yīng)的黃葵黃酮類化合物加合離子數(shù)據(jù)庫(kù)。其中，加合離子的選擇主要依據(jù)前期研究和文獻(xiàn)報(bào)道[4～9，15，16]而定。此數(shù)據(jù)庫(kù)中包括了各化合物正負(fù)離子模式下質(zhì)量虧損、 分子量、 分子組成及不飽和度的最大值和最小值，在此基礎(chǔ)上，引入適當(dāng)?shù)脑试S誤差，即可得到本研究中所設(shè)定的MDF和Formula finder的相關(guān)參數(shù)（表1）。MDF過(guò)濾前后TFA提取物總離子流色譜圖（TIC）的對(duì)比如圖1所示，經(jīng)MDF過(guò)濾后的TIC基線更加平穩(wěn)，而黃酮類化合物對(duì)應(yīng)的色譜峰也得到了增強(qiáng)。理論上，凡是質(zhì)量虧損落在設(shè)定范圍內(nèi)的信號(hào)離子均應(yīng)作為黃酮類相關(guān)離子被篩選出來(lái)，進(jìn)行進(jìn)一步研究，而本研究設(shè)定了只篩選能產(chǎn)生子離子且信號(hào)強(qiáng)度在12000 cps（正離子模式）或7000 cps（負(fù)離子模式）以上的黃酮相關(guān)離子，以集中發(fā)現(xiàn)提取物中相對(duì)含量較高的黃酮類化合物。在鎖定目標(biāo)化合物后，通過(guò)提取目標(biāo)化合物的提取離子流色譜圖（XIC），確認(rèn)目標(biāo)化合物的存在; 同時(shí)，根據(jù)XIC圖譜確認(rèn)補(bǔ)充了一些豐度較大，但低于初篩閾值（即12000 cps或7000 cps）的同分異構(gòu)體。

3.2?篩選結(jié)果

從TFA中共篩選出49種黃酮類化合物（見(jiàn)電子版文后支持信息表S1），各個(gè)黃酮類成分均存在2個(gè)以上的準(zhǔn)分子離子， 進(jìn)一步證明了篩選結(jié)果的可靠性; 各種準(zhǔn)分子離子類型出現(xiàn)的頻率從高到低依次為： [M-H]

（49次）>[M+H]+（41次）>[M+HNO3-H]

（37次）>[M+Na]+（27次）>[M+HCl-H]

（21次）>[M+HCOOH-H]

（13次）; 其中，化合物C5、 C11、 C26、 C47、 C48和C49為根據(jù)鎖定化合物的[M-H]的XIC圖譜補(bǔ)充的豐度較高但小于7000 cps的黃酮類化合物。由于所有化合物都可產(chǎn)生[M-H]，本研究給出了所有化合物此離子的峰強(qiáng)度信息，以初步提供各個(gè)化合物的相對(duì)含量信息。

3.3?篩選化合物的鑒定

黃酮類化合物的鑒定主要依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)比對(duì)、 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)子離子色譜圖的特征診斷離子比對(duì)、AB sciex中藥高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)搜索、 化合物元素組成與已報(bào)道的黃酮類化合物間的聯(lián)系，以及PubChem等網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索匹配。為了提高鑒定的準(zhǔn)確度，并為類似結(jié)構(gòu)化合物的鑒定提供參考，在同樣的LC-MS分析條件下分析了8種黃葵中常見(jiàn)的黃酮類標(biāo)準(zhǔn)品。通過(guò)保留時(shí)間和TOF-MS及TOF-MS/MS圖譜比對(duì)，發(fā)現(xiàn)它們?cè)赥FA提取物中均可作為豐度比較高的色譜峰而被檢測(cè)得到，分別為Rutin（C14）、 Hyperoside（C17）、 Gossypin（C18）、 Gossypetin-8-O-β-D-glucuronide（C25）、 Gossypetin（C30）、 Myricetin（C33）、 Isoquercitrin（C35）和Quercetin（C43）。圖2所示為3種苷元化合物C43、 C33和C30在混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和藥材提取液中的二級(jí)TOF-MS質(zhì)譜圖。上述8種化合物，特別是3種苷元化合物的母離子和子離子特征分布可為解析其它41種黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)提供重要參考。用于鑒定各化合物的子離子詳細(xì)信息和鑒定結(jié)果見(jiàn)電子版文后支持信息表S2; 各化合物可能的化學(xué)結(jié)構(gòu)詳見(jiàn)電子版文后支持信息圖S1。本研究?jī)H以棉皮素（Gossypetin）類化合物鑒定或歸屬過(guò)程為例，簡(jiǎn)述具體鑒定思路和過(guò)程如下：

如圖2C～2F所示，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)可知，棉皮素（C30）和楊梅素（C33）雖為一組同分異構(gòu)體，均可產(chǎn)生特征性母離子m/z 317和一系列共同的子離子，如m/z 299、 271、 245、 227、 195、 179、 167、 151、 139、 137、 111和109等，但兩者產(chǎn)生的子離子的豐度明顯不同。相比之下，棉皮素可產(chǎn)生高豐度的m/z 299、 245、 227、 195、 167、 139和111，而楊梅素則可產(chǎn)生高豐度的m/z 179、 151、 137和109; 這些子離子特征性分布有助于以兩者為母核的化合物的結(jié)構(gòu)區(qū)分和鑒定。以C25為例，其豐富的加合離子和m/z 317子離子的出現(xiàn)均提示，此化合物是以m/z 317為苷元離子

的葡萄糖醛酸苷; 而高豐度的系列上述棉皮素子離子的出現(xiàn)，表明C25為棉皮素的葡萄糖醛酸苷。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，C25被準(zhǔn)確鑒定為Gossypetin-8-O-β-D-glucuronide，進(jìn)一步驗(yàn)證了上述特征子離子分布在結(jié)構(gòu)鑒定中的重要作用。

類似地，C1、 C3、 C18可被合理歸屬為棉皮素的葡萄糖苷，參考PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)，初步將其結(jié)構(gòu)分別定為Gossypetin 3-glucoside、 Gossypetin 3'-glucoside和Gossypin，其中，C18可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)進(jìn)一步確認(rèn); 而其同分異構(gòu)體C7則由于可產(chǎn)生明顯的m/z 179、 m/z 151等特征離子而被合理歸屬為Myricetin 3-glucoside。 C38也可產(chǎn)生棉皮素上述特征子離子分布，且精確分子量提示C38與C25相比多一個(gè)CH2，參考芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸甲酯苷[17]等結(jié)構(gòu)類似的化合物，初步確定棉皮苷的甲基化位點(diǎn)發(fā)生在葡萄糖醛酸基的8位，據(jù)此，將C38歸屬為Gossypetin 8-O-methylglucuronide。同樣地，C34、 C40和C45為一組同分異構(gòu)體，由精確分子量得到的元素組成提示它們比C38多一個(gè)甲基（CH2），且具有棉皮素的特征子離子分布，據(jù)此，將其歸屬為雙甲基化的C25。進(jìn)一步對(duì)比其子離子可以發(fā)現(xiàn)，C34在母離子m/z 521和棉皮素苷元子離子間未見(jiàn)明顯碎片離子，提示兩個(gè)甲基應(yīng)位于糖基上，而非苷元上; C45可產(chǎn)生明顯的m/z 331子離子，與母離子m/z 521相差m/z 190，提示甲基化葡萄糖醛酸殘基（m/z 176+14）的存在; C40可產(chǎn)生m/z 503和461的子離子，兩者相差一個(gè)乙酰基（m/z 42，CH3CH2O），提示乙酰基的存在。根據(jù)以上分析，參考已知黃葵中黃酮類化合物的糖基化位點(diǎn)，C34、 C40和C45分別被初步確定為Gossypetin 8-dimethylglucuronide、 Gossypetin 3-acetylglucoside和4'-methylgossypetin 8-methylglucuronide。

C20可產(chǎn)生與C38類似的特征子離子，如m/z 507、 m/z 317等，提示其結(jié)構(gòu)中具有C38母核。C20與C38母離子相差兩個(gè)CH2O，且C20可產(chǎn)生明顯的[M-H2O-H]

離子m/z 549，據(jù)此，初步推斷其結(jié)構(gòu)為C38在糖基上加乙二醇，即C20為C25的丙三醇酯，其具體精確結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步深入研究。

C8、 C16均可依次丟失m/z 162（葡萄糖），兩次生成m/z 479（單糖苷離子）和m/z 317（苷元離子），并伴有m/z 299和m/z 271等棉皮素特征子離子出現(xiàn)，提示其均為棉皮素的二糖苷。鑒于C16糖苷碎片離子少見(jiàn)，且可產(chǎn)生較多的小分子苷元相關(guān)碎片離子; 而C8則具有m/z 595、 m/z 478等糖苷相關(guān)子離子，且苷元碎片離子較少; 結(jié)合PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，將C8和C16分別初步歸屬為Gossypetin-3，8-O-diglucoside和Gossypetin 3-sophoroside。類似地，C11、 C19、 C21分別初步鑒定為Gossypetin 8-glucuronide 3-glucoside、 Gossypetin-8-O-glucosyl-（1->2）-glucuronide和Gossypetin 8-methylglucuronide 3-glucoside。

綜上，共有17種黃酮類化合物被歸屬或鑒定為棉皮素類化合物。類似地，共鑒定或歸屬25種槲皮素（Quercetin）類化合物，5種其它類黃酮化合物以及甘草苷和異甘草苷，鑒定過(guò)程詳見(jiàn)電子版文后支持信息S3.3.1～S3.3.3。

3.4?篩選鑒定結(jié)果分析

根據(jù)上述篩選鑒定結(jié)果，以槲皮素和棉皮素兩個(gè)苷元為轉(zhuǎn)化起點(diǎn)，對(duì)TFA中黃酮類成分可能涉及到的轉(zhuǎn)化反應(yīng)進(jìn)行歸納總結(jié)（電子版文后支持信息圖S1）。結(jié)果表明，糖基化、 甲基化、 甲酰化、 乙酰化、 內(nèi)酯化、 葡萄糖醛酸化、 甘油酯化共7種轉(zhuǎn)化反應(yīng)參與了黃葵黃酮類化合物的生成，其中，以糖基化最為常見(jiàn)。需要指出的是，上述轉(zhuǎn)化反應(yīng)是以苷元為起點(diǎn)作為假設(shè)的，因此，其逆反應(yīng)也可能是常見(jiàn)的轉(zhuǎn)化反應(yīng); 同時(shí)，由于槲皮素和棉皮素僅相差一個(gè)羥基，因此，這兩者之間，以及以該兩者為母核的多種化合物間均有可能發(fā)生相互轉(zhuǎn)化。

對(duì)比各化合物[M-H]的峰強(qiáng)度可知，Gossypetin 8-O-methylglucuronide（C38）峰高最強(qiáng)，但此化合物在以往的黃葵制劑質(zhì)量評(píng)價(jià)中很少提及; 類似的化合物還有C27、 C28、 C2、 C31和C7等。在后續(xù)的黃葵制劑質(zhì)量評(píng)價(jià)及活性研究中，關(guān)注或增加對(duì)于這些化合物的相關(guān)研究十分必要。

4?結(jié) 論

通過(guò)LC-TOF-MS技術(shù)并結(jié)合MDF方法，對(duì)TFA中黃酮類成分進(jìn)行系統(tǒng)篩查和初步鑒定，共篩選鑒定出49種黃酮類化合物，并歸納出了糖基化、 葡萄糖醛酸化、 甲基化等黃酮類化合物的次生代謝轉(zhuǎn)化途徑，極大地豐富了對(duì)黃葵黃酮類化學(xué)成分的認(rèn)識(shí)，對(duì)于全面評(píng)價(jià)黃葵相關(guān)制劑質(zhì)量，闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)具有重要的參考意義。同時(shí)，本研究也充分表明， LC-TOF-MS技術(shù)結(jié)合MDF方法可用于中藥等復(fù)雜體系的化學(xué)成分的系統(tǒng)定性分析。

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Systematic Screening and Assignment of Flavones in Total Flavones

of Abelmoschus Manihot Based on High-performance Liquid

Chromatography Time-of-Flight Mass Spectrometry

Analysis and Mass Defect Filter

GAO Xin1， WAN Yao-Yao1， LI Chang-Yin*1， DUAN Xu-Bin1， DING Xuan-Sheng*2， JU Wen-Zheng1

1（Department of Clinical Pharmacology， Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210029， China）

2（School of Pharmacy， China Pharmaceutical University， Nanjing 211198， China）

Abstract?High-performance liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry （HPLC-TOF-MS） was employed to analyze the extract of total flavones of Abelmoschus manihot L. Medic （TFA） in both positive and negative ion mode. The raw LC-MS data were filtered by a well-established mass defect filter （MDF） approach to screen the flavone-related ions， and then， each screened ion was assigned by TOF-MS accurate mass measurement to certain elemental composition and ion type. Next， the co-eluted ions from one single compound were attempted to be combined， and the presence of each compound was confirmed by at least two quasi-molecular ions. Aided by authentic standards comparison and searching literature and databases， the targeted compounds were tentatively identified or assigned according to their parent and fragment ions. Finally， 49 flavones were screened and tentatively identified or assigned from the TFA extract. The results showed that， glycosylation， methylation， formylation， acetylation and glucuronidation were considered to be the major conversion involved in the formation of the TFA flavones. The current study not only provided the sufficient chemical substance for further studies of TFA， such as quality control and pharmacological activity， but also demonstrated the potential of the combination of LC-TOF-MS and MDF for systematically screening the constituents of herbal medicines.

Keywords?Abelmoschus manihot L. Medic; Flavones; High performance liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry; Mass defect filter; Systematic compound screening; Compound identification

（Received 25 September 2019; accepted 20 December 2019）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No.81503300）.