熱燙拉伸融化過程對Mozzarella干酪品質、分子間作用力及微觀結構的影響

李紅娟，王 祎，劉 燕，于洪梅，李洪波，于景華*

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457）

中國的干酪市場從2009年的不到2萬 t迅速增加到2017年10.8萬 t，年均增長率達到30%。其中77%的比例為餐飲渠道，尤其是作為披薩配料的Mozzarella干酪在中國消費量逐年增長，因此Mozzarella干酪具有廣闊的開發應用及市場前景。Mozzarella干酪的功能性質（如未融化時的彈性、硬度和切條性以及融化時的融化性和拉伸性等）[1]對生廠商、加工商及消費者而言都非常重要，因此，系統地對Mozzarella干酪質構及功能特性進行研究，對其貯藏、加工都具有重要的實際應用價值[2-3]。

熱燙拉伸是Mozzarella干酪在加工過程中區別于其他干酪的獨特工藝，通過熱燙拉伸Mozzarella干酪能夠使其中蛋白質進行分子重排，干酪中蛋白質由無定型三維結構轉變成線性纖維狀網絡結構，乳清和脂肪液滴填充在酪蛋白纖維束之間，干酪由剛性結構轉變為塑性結構[1]。前人研究發現，在熱燙拉伸過程中可能是由于干酪蛋白質分子中氫鍵、疏水作用力及靜電斥力等發生變化，最終導致Mozzarella干酪拉絲特性形成[4]。Lucey等認為酪蛋白分子間的相互作用是造成干酪物理和化學變化的主要因素[5]。隨著溫度升高，疏水作用逐漸增大，這導致酪蛋白粒子間接觸面積減少（酪蛋白粒子收縮），因此降低了整體的凝膠強度；隨著溫度升高，氫鍵吸引力逐漸降低，靜電斥力增強，這些都導致斥力增加及基質變軟[6]。可以將拉伸的酪蛋白分子看作聚合物（如纖維），其在高溫下會變黏稠。如果酪蛋白網絡在蛋白酶的作用下過分水解，拉伸性能會減弱。如果蛋白分子間的作用力過強（拉伸溫度較低或者過多的鈣結合在酪蛋白分子上），拉伸就會受損，凝膠結構會被破壞。氫鍵相互作用力對穩定蛋白結構也非常重要，隨著溫度升高，氫鍵作用力逐漸減弱，靜電排斥力增強[7]。總之，熱處理通過影響蛋白分子間作用力，導致蛋白質局部結構坍塌和轉變，其中也包括有限變性作用，進而引起干酪整體固相膠體特性的改變。

熱燙拉伸處理是Mozzarella干酪制作工藝中最為獨特的一步，與干酪成熟后的功能特性密切相關[8]。目前關于熱燙拉伸對干酪的加工效果已經有一些報道，但是，由于不同研究者的研究方法和手段不同，所以目前研究結果未對熱燙、拉伸及干酪融化、融化后拉絲這幾個過程對干酪的品質影響做出全面的解釋[9-10]。因此，本實驗主要研究了Mozzarella干酪制作過程中分別經過熱燙、熱燙拉伸處理的非完整工藝和完整工藝樣品，及樣品融化、融化后拉絲對干酪組分、功能特性、結構和分子間作用力的影響。系統性地探究熱燙、拉伸對干酪品質影響及成品干酪融化、拉絲前后樣品的變化特點，進一步闡明熱燙拉伸同干酪品質及功能特性的相關規律。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

經過標準化處理的鮮牛乳 滄興牧業有限公司；硫酸鉀、氯仿、氫氧化鈉、硫酸銅（均為分析純）天津市化學試劑一廠；氯化鉀、濃硫酸、戊二醛（均為分析純） 天津市景田化工；石油醚 天津市富宇精細化工有限公司；Stamix 1150 NB凝乳酶（酶活力1 150 IMCU/g）、SYC-11型干酪發酵劑 丹麥科漢森公司；食鹽（食品級） 山東寒亭第一鹽場。

1.2 儀器與設備

HWS24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司；K9840凱氏定氮儀 濟南海能儀器有限公司；SU1510掃描電子顯微鏡 日本日立公司；TA.XT Plus物性測試儀 英國Stable Micro Systems公司；DSC204 F1型差示掃描量熱儀 德國Netzsch公司。

1.3 方法

1.3.1 Mozzarella干酪制作與樣品準備

原料乳→殺菌（63 ℃、30 min）→冷卻至37 ℃左右加入菌種（0.1 g/L）發酵→pH 6.4左右加入凝乳酶（0.03 g/L）→凝乳25～30 min左右切割→排乳清→堆釀→鹽漬→不經熱處理（樣品點I）/只熱燙處理（樣品點II）/熱燙拉伸處理（熱燙溫度70～75 ℃）（樣品點III）→冷卻→真空包裝→成熟（成熟后的熱燙拉伸干酪再進行融化（樣品點IV）/融化后拉絲處理（樣品點V）

1.3.2 干酪理化指標的測定

蛋白質量分數的測定參考GB/T 5009.5ü2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》；脂肪質量分數的測定參考GB 5420ü2010《食品安全國家標準 干酪》；水分質量分數的測定參考GB/T 5009.3ü2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》；pH值參考李紅娟等的方法[11]測定。

1.3.3 干酪質構的測定

將4 ℃貯存的干酪樣品切成邊長1.5 cm的正方體，纖維方向垂直于壓縮盤。質構儀參數設定：測試前探頭下降速率5.0 mm/s，測試速率1.0 mm/s，測試后探頭回程速率5.0 mm/s，下壓變形40%，觸發力20 g，探頭類型P/35[12]。

1.3.4 干酪融化、拉絲及油脂析出性的測定

1.3.4.1 干酪融化性測定

將干酪樣品切成直徑18 mm、厚7 mm的圓柱狀（纖維方向垂直于干酪圓柱體直徑），放于預先鋪有9 cm濾紙的培養皿中，室溫下放置30 min，然后將其放入100～103 ℃的烘箱內，加熱1 h后取出，室溫下回復30 min，分別從4 個方向測定融化干酪的直徑，每個樣品做3 個平行，取平均值，表示干酪的融化性[13]。

1.3.4.2 干酪油脂析出性的測定

將干酪樣品切成直徑18 mm、厚7 mm的圓柱狀（纖維方向垂直于干酪直徑），處理步驟同1.3.4.1節，室溫下回復30 min，析出的油滲透在濾紙上形成油圈，分別從4 個方向測定油圈的直徑，每個樣品做3 個平行，取平均值，表示干酪的油脂析出性[14]。

1.3.4.3 干酪拉絲性的測定

樣品切成直徑3.5 cm、厚1 cm的圓柱，放置于預熱到（200f5）℃的烤箱內，加熱5 min后取出，使用叉子勻速挑起融化的干酪樣品至其拉絲斷裂，斷裂時長度即作為干酪的拉絲性指標。每個樣品至少做3 個平行，取平均值[15]。

1.3.5 干酪蛋白溶解度的測定

溶解液制備：1）pH 7.0的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）；2）pH 7.0 PBS中加入體積分數2% 2-巰基乙醇（2-mercaptoethanol，2-ME）；3）pH 7.0 PBS中加入質量分數2%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）；4）pH 7.0 PBS中加入質量分數2% SDS和體積分數2% 2-ME。

干酪樣品于研缽中搗碎，冷凍干燥成粉末。準確稱取干酪粉末0.5 g（精確至1 mg）各4 份，分別加入10 mL上述不同4 種溶解液，使用振蕩器常溫下振蕩20 min，離心，取上清液。沉淀中再分別加入10 mL上述4 種溶解液，重復浸提，離心，合并兩次上清液于50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，得到樣品蛋白質溶解液。溶解液中的蛋白含量用凱氏定氮法[16]測定。樣品中總蛋白質量測定方法同1.3.2節。溶解度按下式計算。

1.3.6 熒光光譜法對干酪分子間疏水作用力測定

采用熒光光譜法測定干酪的疏水作用。根據固體表面熒光光譜法，利用色氨酸作為內源探針，將干酪裝入固體樣品池中，激發光源與樣品檢測器在樣品一側呈45°角，可以確保反射光、散射光和去偏光對樣品測定的影響降到最低。激發和發射狹縫寬度分別為3.0 nm和1.5 nm，激發波長322 nm，掃描發射波長350～600 nm。

1.3.7 干酪玻璃化轉變溫度Tg的測定

取5～20 mg樣品放入坩堝中壓片，用差示掃描量熱儀進行測定。具體檢測方法如下：室溫迅速降溫至-60 ℃，保持20 min，升溫至-20 ℃，保持30 min，降溫至-60 ℃，保持20 min，升溫至60 ℃[17]，升溫及降溫速率均為5 ℃/min。

1.3.8 干酪微觀結構的測定

延干酪纖維方向切成表面平整的纖薄小片，浸于體積分數2.5%戊二醛溶液中，4 ℃下固定3～4 h，用pH 7.2的PBS清洗3 次，每次15 min，再分別用體積分數30%、50%、70%、90%、100%乙醇溶液梯度脫水，每次15 min，之后再用氯仿脫脂3 次，每次15～20 min，脫脂后用100%乙醇脫水3 次，每次15 min。樣品處理好后放入-40 ℃冰箱冷凍2 h以上，然后取出放入冷凍干燥器中冷凍干燥。將干燥后的樣品取小塊粘在實驗臺上，采用離子濺射的方法噴金，置于掃描電子顯微鏡下掃描觀察[18]。

1.4 數據處理與分析

以上實驗中每個樣品分別取樣重復測定3 次，采用SPSS軟件通過鄧肯氏多重比較進行顯著性分析，P＜0.05時表示差異顯著，并用Origin 8.0軟件進行數據擬合和作圖。

2 結果與分析

2.1 熱燙拉伸處理對干酪基本理化指標的影響

表 1 熱燙拉伸對干酪基本理化指標的影響Table 1 Effect of thermal and stretching treatment on physiochemical indexes of cheese

干酪樣品在經過7 d成熟期后測定其基本成分，由表1可知，未處理干酪凝塊水分質量分數最低，為42.23%，隨著熱燙和拉伸水分質量分數逐漸增大，Mozzarella干酪樣品中水分質量分數為48.70%，相對于樣品點I增加15.3%。蛋白質量分數也隨熱燙拉伸處理過程逐漸增大，Mozzarella干酪樣品比樣品點增加15.1%。脂肪質量分數隨著熱燙拉伸處理而逐漸降低，Mozzarella干酪樣品比樣品點I和樣品點II脂肪含量分別減少30.1%及15.1%。干酪凝塊在未經過熱燙拉伸前其水分質量分數很高，但由于蛋白結構排列較為疏松，鎖水能力較差，因此，在成熟期間，會有相當一部分水從體系中流出，導致其水分質量分數較低。而經過熱燙拉伸的干酪蛋白結構更加緊密，脂肪和乳清被蛋白纖維包裹，不易在成熟過程中流出，說明熱燙拉伸過程能提升干酪的持水力[19]。干酪經過熱燙拉伸后脂肪質量分數顯著下降，說明較高溫度的熱燙及拉伸會使部分脂肪液化游離出來，尤其是大的脂肪團，從而降低了干酪中的脂肪含量[20]。

2.2 熱燙拉伸處理對干酪質構特性的影響

表 2 熱燙拉伸處理對干酪質構特性的影響Table 2 Effect of thermal and stretching treatment on texture properties of cheese

由表2可知，與未處理的干酪凝塊相比，只經過熱燙處理的干酪（樣品點II）硬度增加，但其他質構特性（彈性、黏聚性、回復性、膠著度及咀嚼度）均下降。與樣品點II相比，經過熱燙拉伸的Mozzarella干酪樣品的硬度、彈性、黏聚性、回復性、膠著度及咀嚼度都有所提高。熱燙處理使固態脂肪液化，導致蛋白結構坍塌，但沒有新的剪切力或拉伸力等外力促使已經被破壞的蛋白質基質形成新的穩定結構。而拉伸處理提供了一種能夠重塑蛋白質基質的外力，使得酪蛋白由原來的網狀結構轉變成纖維結構，排列更加緊密，蛋白分子間的作用力也有所增加[21-22]。

2.3 熱燙拉伸處理對干酪融化、拉絲及油脂析出性的影響

表 3 熱燙拉伸處理對干酪功能特性的影響Table 3 Effect of thermal and stretching treatment on functional properties of cheese

由表3可知，經熱燙及拉伸處理后干酪的融化性逐漸降低。同樣品點I相比，樣品點II和樣品點III融化性分別下降0.23 cm及0.34 cm。樣品在未經拉伸前，在樣品點I和樣品點II，油脂析出性均大于9 cm，經拉伸處理后油脂析出性降低。不同樣品間拉絲長度無顯著性差異。融化性和油脂析出性的變化同干酪樣品的脂肪含量密切相關，樣品點III融化性及油脂析出性的降低，主要由于干酪樣品中脂肪含量減少造成。樣品點I拉絲長度為44.25 cm，樣品點III拉絲長度為42.87 cm，兩者在長度上無顯著差異，但是拉絲強度有明顯區別（觀察法得出，數據未在文中給出），樣品點I同樣品點III相比拉絲強度較弱，易斷。樣品點III干酪融化后大部分干酪能夠黏連，可以大片拉絲，而樣品點I只有少部分干酪在拉伸過程中黏連。這主要是由于未經熱燙拉伸處理的干酪凝塊蛋白質結構為松散的網狀結構，乳清和脂肪隨意地填充在蛋白質矩陣中，而融化時隨著脂肪的液化蛋白質矩陣坍塌，結構流動性增強，因此能夠有較長的拉伸長度，但是強度較弱[23]。干酪凝塊在熱燙處理后，高溫使得脂肪液化，蛋白網絡結構坍塌，但沒有外力作用，未形成有序的結構，脂肪和乳清也較隨意的分布[24]。經熱燙拉伸處理后，蛋白質由原來較為松散的網狀結構轉變為纖維狀結構，乳清和脂肪也隨著蛋白質結構的改變而形成一條條順著纖維方向的乳清脂肪通道，蛋白質形成更加緊密的結構，蛋白分子間作用力增強，因此當升溫融化時，蛋白矩陣由于連接緊密，拉伸時能夠有較好的強度[25]。

2.4 熱燙、拉伸、融化及拉絲過程對干酪蛋白質溶解度的影響

不同處理對干酪蛋白質溶解度的影響結果如圖1所示。未處理的干酪在PBS中的蛋白溶解度為67%左右，經過熱燙、拉伸、融化和拉絲的干酪在PBS中的蛋白質溶解度有所提升，但在其余幾種溶液中的溶解情況不一。

圖 1 不同干酪樣品的蛋白質溶解度變化Fig. 1 Effect of different treatments on protein solubility of cheese

未處理的干酪凝塊在PBS+2-ME的溶液中溶解度與PBS溶液組相比明顯增加，在PBS+SDS溶液中的溶解度有所提高，在PBS+2-ME+SDS溶液中的溶解度比只加SDS溶液的溶解度要低。說明未處理干酪凝塊維持酪蛋白空間網絡結構的主要作用力是氫鍵和疏水作用。經過熱燙處理的干酪在PBS+2-ME和PBS+SDS溶液中的溶解度明顯增加，說明干酪在經過熱燙后，蛋白質空間結構發生變化，此時，二硫鍵和非共價鍵（疏水作用和氫鍵）對維持干酪蛋白空間結構有一定作用，當這些化學鍵被破壞時能夠引起蛋白溶解度提高。經過熱燙拉伸的干酪在PBS+2-ME+SDS溶液中蛋白質溶解度與在PBS中的溶解度無明顯變化，說明此時二硫鍵和非共價鍵作用都較為微弱，蛋白質網絡結構變得更加有序，因此當這些化學鍵被破壞時對蛋白質溶解度影響較小。經過融化后的干酪在PBS+2-ME溶液中的溶解度降低，在PBS+SDS溶液中的溶解度有所上升，在PBS+2-ME+SDS溶液中的溶解度明顯增加，說明兩種溶劑在一起具有明顯的協同作用，表明蛋白結構在這一過程中可能發生了巰基和二硫鍵的轉化。經過拉絲的干酪在PBS+2-ME溶液中的溶解度較高，而在含SDS的兩種溶液中的溶解度明顯下降，甚至低于在PBS中的溶解度。說明此時的酪蛋白結構主要通過二硫鍵維持蛋白結構。

2.5 熱燙、拉伸、融化及拉絲過程對干酪分子間疏水作用力的影響

圖 2 不同處理對干酪熒光強度的影響Fig. 2 Effect of different treatments on fluorescence intensity of cheese

如圖2所示，各種處理所得干酪的最大熒光強度無明顯差異，說明熱燙、拉伸、融化以及拉絲處理不影響蛋白分子間的疏水作用。

2.6 熱燙、拉伸、融化及拉絲處理對干酪Tg的影響

圖 3 不同處理對干酪Tg的影響Fig. 3 Effect of different treatments on Tg of cheese

如圖3所示，未經處理的干酪的Tg為-14.1 ℃，熱燙后的干酪的Tg為-13.1 ℃，熱燙拉伸后的干酪的Tg為-12.6 ℃，融化后的干酪的Tg為-13.8 ℃，拉絲后的干酪的Tg為-11.9 ℃。

未經處理的干酪蛋白網絡結構松散，分子間的相互作用也較弱，因此，酪蛋白分子所受束縛少，運動性強。而經過熱燙后，蛋白網絡結構融化后處于將要重排卻未能重排的狀態，蛋白分子間的作用力也發生變化，蛋白分子的運動性減弱[26]。干酪再經過拉伸后，蛋白網絡重排，由較為松散的三維網狀結構轉變為緊密的纖維狀結構，蛋白分子鏈更加緊密，分子間作用力增強，蛋白分子的運動性減弱。成熟的干酪經過200 ℃高溫融化后測定其Tg，可以發現融化后的干酪差示掃描量熱曲線波動很大，可能是由于融化后的干酪組織結構塌陷，蛋白質、水分、脂肪等分布不均勻，分子束縛減小，運動空間增大；因此，分子運動性上升。但干酪高溫融化后又進行拉絲，經過拉絲的干酪Tg明顯升高，主要由于高溫融化拉絲處理使得部分脂肪和水分從蛋白質基質中轉移至干酪表面，蛋白質纖維間隙極小；故蛋白分子運動性下降。

2.7 熱燙、拉伸、融化及拉絲處理對干酪微觀結構的影響

圖 4 不同處理對干酪微觀結構的影響Fig. 4 Effect of different treatments on microstructure of cheese

由圖4a可以看出，未經處理的干酪蛋白孔隙小、多而密集，蛋白網絡結構表面有許多蛋白凸起，蛋白結構較為雜亂，但可以看出蛋白網絡結構較為膨脹，乳酸菌大都被包裹在蛋白質基質中。由圖4b可以看出，經過熱燙處理的干酪蛋白孔隙變大、數量增多，部分纖維狀結構，部分三維網狀結構，乳酸菌部分在蛋白質基質外，部分被包裹在蛋白質基質中[27]。由圖4c可以看出，干酪經過拉伸后，蛋白結構明顯地呈現纖維狀或長鏈結構，乳酸菌也從蛋白質基質中逐漸游離出，生長在蛋白質基質表面或乳清蛋白通道的孔隙中。如圖4d所示，成熟后的干酪經過高溫融化處理后，蛋白網絡結構坍塌，乳清和脂肪隨孔隙流失；因此，整個融化后的干酪呈現出孔隙多且大小不一的扁平狀結構，乳酸菌也隨之流出，分布在孔隙周圍，成團地附著在蛋白質基質上，這主要是由于高脂肪的干酪中，豐富的脂肪液滴存在于蛋白質基質中，形成了蛋白網絡中結構較為松散的點，導致蛋白結構隨脂肪的變化而變化[16,28]。由圖4e可知，融化后的干酪拉絲后會使干酪呈現出細長條的纖維結構，各個蛋白纖維間的蛋白連接很弱，蛋白質基質上的孔隙消失，乳酸菌均勻地附著在長的蛋白纖維上[29-30]。

3 結 論

本實驗分別選取Mozzarella干酪在制作過程中干酪凝塊（樣品點I）、只熱燙（樣品點II）、熱燙拉伸（樣品點III）作為樣品，對這3 個階段的樣品進行脂肪、蛋白質及水分等基本成分測定，并對其質構特性及加工特性（融化性、拉絲性及油脂析出性）進行研究；同時對成品Mozzarella進行熱燙（樣品點IV）和熱燙拉伸后（樣品點V）進行取樣，研究其作用力及微觀結構變化。通過干酪基本成分測定，發現與未經熱燙拉伸的干酪相比，經過熱燙和拉伸的干酪的水分質量分數和蛋白質量分數顯著增加，脂肪質量分數下降，說明熱燙拉伸能增強酪蛋白分子的鎖水能力，但在這一過程中會有部分脂肪損失。脂肪的損失對于成品Mozzarella干酪的質構特性及加工特性都有一定的影響，在熱燙拉伸過程中，干酪的油脂析出性和融化性相對于未處理的干酪有所降低。但在熱燙拉伸后，分子間作用力增強。在Mozzarella干酪制作過程中，通過熒光光譜對分子間疏水作用力進行測定，發現熱燙拉伸處理對蛋白疏水作用并無顯著影響，結合干酪在不同溶液中的溶解度變化可以推測未處理干酪的蛋白結構主要靠氫鍵維持，對于熱燙、拉伸和融化的干酪來說由共價鍵和非共價鍵共同維持，而對于拉絲的干酪則主要通過二硫鍵維持。說明經過熱處理后分子間氫鍵不斷減少，同時蛋白鏈排列更加有序，導致分子運動性降低，從而導致干酪的融化性下降。