FSH劑量及應激對文山牛超數排卵效果的影響

文│朱芳賢 趙俊金（全國畜牧總站）

陸靈勇 陳永波（云南省文山壯族苗族自治州畜牧站）

農勝虎 何永定（云南省文山壯族苗族自治州廣南縣畜牧技術推廣工作站）

馮光杰 念博悠（云南谷多農牧業有限公司）

文山牛是經過長期選育的特色地方牛品種，具有適應性強、抗病力強、耐粗飼和肉質優良等特點，其體型優美，也是斗牛等文化活動的素材，養殖文山牛是當地主要經濟來源之一。開展文山牛保種胚胎收集保存工作，以避免養殖過程中環境變化，以及雜交、近交等因素造成的優良基因流失，同時也是更好節約保種成本。胚胎保存了品種的全部基因，可很快恢復遺傳資源，與其他方法相比具有突出的優越性，本文分析了促卵泡素（FSH）劑量及應激對文山牛超數排卵效果的影響，為提高文山牛良種擴繁技術提供參考，對提高云南省乃至西南地區牛品質，提高牛養殖效益具有重要意義。

一、材料與方法

1.供體牛。2016年9～12月，從國家文山牛核心育種群中選擇產犢后37天以上，年齡3～10歲，體重300～450千克的母牛，白天放牧，夜晚舍內補飼。

2.主要藥品與器械。黃體酮陰道緩釋劑（CIDR）1.9克/支，新西蘭DEC國際有限公司生產；FSH 400毫克/支，加拿大（CAN）Follitropin生產；日本產FSH 10AU×5支；氯前列烯醇（PG）0.2毫克/2毫升/支，上海市計劃生育科學研究所生產；普魯卡因40毫克/2毫升/支，北京市永康藥業有限公司生產；促黃體素釋放激素A3（促排3號）20微克×10支，寧波三生藥業有限公司生產；體視顯微鏡；美國AB公司生產的牛用二通式沖卵管；集卵杯。

3.試驗設計。應激組分Ⅰ組和Ⅱ組，經歷氣溫驟變，Ш組為正常組沒有經歷氣溫驟變，也是劑量對比試驗的Ш組，這三組都給予相同的日本產FSH 20.0AU劑量；不同FSH劑量試驗為Ш組和Ⅳ組，Ш組15頭；Ⅳ組給予日本產FSH 22AU，6頭。各試驗組采用的超數排卵程序是第0天放CIDR栓，第9天開始注射FSH，間隔12小時注射FSH 1次，FSH注射量遞減，第5次注射FSH時同時注射0.2毫克PG，第7次注射FSH時撤掉CIDR栓；同時在放CIDR和配種時各注射維生素ADE注射液3毫升，撤栓時用0.9%生理鹽水沖洗陰道，配種時注射促排3號15微克。詳細超數排卵程序見表1。

表1 超數排卵程序

4.供體母牛配種。觀察到供體母牛第1次站立發情后12小時后配種，連續配種2～3次，間隔10～12小時。

5.胚胎的采集與質量鑒定。第7天采用非手術法收集胚胎，發情日為0天。每側用含1%血清的杜氏磷酸鹽緩沖液（PBS）400～500毫升沖洗子宮角。子宮回流液靜置3～5分鐘后在實體顯微鏡下撿出卵子或胚胎，并保存在保存液中。按《NY/T1674牛羊胚胎質量檢測技術規程》進行胚胎鑒定分級。

6.數據處理。使用SPSS軟件對各組數據進行單因素差異顯著性分析。試驗數據以“平均值±標準差”表示，超數排卵有效而沖卵失敗的個體不作為分析對象。

二、結果與分析

1.文山牛超數排卵效果。21頭正常情況下的文山牛，只均黃體數11.62個，只均獲卵數8.62枚，只均獲有效胚5.67枚，見表3。

2.應激對超數排卵效果的影響。應激Ⅱ組27日發情，28日配種，之前3天最高溫度26～27℃，溫差僅1℃，應激Ⅰ組29日發情，30日配種，發情日發生氣溫驟變，最高溫度由26℃降到16℃，溫差達10℃。由表2可知，應激Ⅰ組只均黃體數比應激Ⅱ組少2.83個（P＜0.05），比正常組（Ш組）少3.00個（P＜0.05），應激Ⅱ組只均黃體數和正常組沒有差異（P＞0.05）；應激Ⅰ組只均回收卵數比應激Ⅱ組少3.26個（P＜0.01）、卵子回收率低14%，比正常組少3.13個（P＜0.01）、低11%，應激Ⅱ組只均回收卵數和卵子回收率低與正常組沒有差異（P＞0.05）；應激Ⅰ組只均有效胚數比應激Ⅱ組少3.13個（P＜0.01）、有效胚率低31%，比正常組少3.80個（P＜0.01）、低47%，應激Ⅱ組只均有效胚數比正常組少0.67個（P＞0.05）、卵子回收率低16%。

3.不同F S H 劑量超數排卵效果的比較。由表3可見，Ⅳ組（22.0AU）效果最佳，只均黃體數、只均回收卵數、卵子回收率、只均有效胚數、有效胚率分別為14.0個、10.33個、75%、7.83枚和76%，Ⅳ組只均黃體數、只均回收卵數、卵子回收率高于Ш組（P＞0.05），Ⅳ組只均有效胚數、有效胚率高于Ш組（P＜0.05）。

三、討論

1.文山牛超數排卵效果。牛的超數排卵受不同品種和飼養管理等因素影響。朱化彬（2014）報道，美國2002—2011年奶牛和肉牛每次超數排卵獲得可移植胚胎數量平均為6.1～6.7枚/次。中國引入肉牛品種體內胚胎每頭平均有用胚胎在5.7～7.0枚。地方品種由于環境、個體差異大，超數排卵效果差異大，每頭平均有用胚胎在2.0～5.0枚。王木等（2006）報道南陽黃牛頭均有用胚數2.89枚，朱芳賢等（2016）報道雷瓊牛頭均有用胚數3.24枚，喬利敏等（2008）報道晉南牛頭均有用胚胎為3.90枚，李金輝等（2007）報道秦川牛有用胚4.20枚，王新莊等（2010）報道郟縣紅牛頭均有用胚數為4.28枚，胡在鉅等（2013）報道廣西南丹黃牛頭均有用胚數4.40枚，朱芳賢等（2015）報道復州牛頭均有用胚數4.62枚。本試驗中，21頭次文山牛在正常氣候、放牧加補飼條件下獲得了頭均有用胚數5.67枚，高于雷瓊牛、廣西南丹黃牛兩品種，這三個同屬于含瘤牛血統的品種，都屬于小型牛品種，試驗中考慮文山牛有放牧加補飼等稍好飼養管理條件，與雷瓊牛相比，加大FSH劑量，得到比雷瓊牛好的效果，說明除品種外飼養管理條件也是影響超數排卵效果的關鍵因素。

2.應激對超數排卵效果的影響。桑潤滋等（2011）報道氣溫突然降低10℃以上使美利奴超細毛羊平均獲胚數降低0.8枚，頭均可用胚數降低2.7枚，可用胚率降低27.1%，認為影響明顯，其原因是環境突然改變造成機體應激反應，使母羊體內相關的生殖激素的分泌發生改變，使下丘腦—垂體—腎上腺皮質激素（HPA）軸興奮，使CRH分泌增加，促腎上腺皮質激素釋放激素（CRH）對促性腺激素釋放激素（GnRH）分泌有抑制作用，進而影響黃體素（LH）和FSH的分泌，最終影響超排效果。本次試驗中氣溫突然降低10℃，使文山牛平均黃體數降低3.00個，平均獲卵數降低3.13個，卵子回收率降低11%，頭均可用胚數降低3.80枚，可用胚率降低47%。云南潮濕，溫度有變化時感覺明顯，有“雨后便是冬”的感覺，試驗中應激Ⅰ組和Ⅱ組經歷的氣溫差異的間隔雖然只差1天，超數排卵效果有明顯差異。可能是Ⅱ組在氣溫變化前已經完成激素更替及分泌量變化，所以排卵多，形成黃體多，最終有效胚胎也多。與Ⅱ組相比，Ⅰ組的牛發情表現不明顯，活動和爬跨少，內部可能也表現為FSH和LH的更替及分泌量受影響，最終造成卵巢排卵少形成黃體少的結果。試驗中Ⅱ組有效胚率還是低于整個處理過程中都沒有受過應激的正常組（Ш組），盡管平均黃體數和獲卵數沒有差別，可能是Ⅱ組受氣溫突然改變影響，其黃體發育也受影響，黃體酮分泌減少，胚胎發育受阻，有效胚減少。

表2 應激對超數排卵效果影響

表3 不同劑量超數排卵效果的比較

3.不同FSH劑量超數排卵效果的比較。本次超數排卵試驗是生產活動，根據經驗只做了2個劑量組，結果是22 AU組只均有效胚數、有效胚率高于20 AU組（P＜0.05），初步說明對于文山牛日本產FSH劑量22 AU優于20AU，當然最佳劑量待進一步的試驗。結果說明超數排卵中適宜FSH劑量是取得好的超數排卵效果的關鍵因素之一。

四、小結

超數排卵中，氣溫發生氣溫驟變帶來的應激影響效果，建議超排工作中要關注天氣預報，同時盡量避開一些“節氣”，通常節氣都有氣溫變化。

超數排卵中各種激素更替及量變化是很大，所以注射間隔時間要固定在10～12小時，劑量一定要準確，注射時漏了要適當補足（稍多點）。

利用胚胎和凍精達到基因保種的目的，是目前優良畜禽品種現代保種的好方法。與活體保種相結合，具有良好效果及具大優勢。