色素萬壽菊試管苗玻璃化控制的研究

吳麗芳 田雪蓮 魏曉梅 路小春 錢紹方 桂寶林

摘 ?要：以色素萬壽菊帶腋芽的莖段為外植體，研究離體快繁中蔗糖、AgNO₃、瓊脂、植物凝膠、活性炭及不同封口材料對芽增殖及玻璃苗產生的影響。結果顯示：30 g/L蔗糖適合萬壽菊幼苗的生長，玻璃化率隨蔗糖濃度（10～60 g/L）的增加而減少，60?g/L的蔗糖玻璃化率僅9.13%;AgNO₃有抑制玻璃苗發生作用，5.0?g/L?AgNO₃可使玻璃化率低至9.81%;活性炭的用量對玻璃化影響最為明顯，5.0?g/L活性炭可使玻璃化率高達38.18%;瓊脂和植物凝膠對芽的增殖及玻璃化發生表現相同的趨勢，低濃度時有利于芽的增殖，高濃度可有效防止玻璃化發生，10?g/L的瓊脂玻璃化率低至8.31%;2.0?g/L的植物凝膠芽增殖系數高達3.35，5.0?g/L植物凝膠玻璃化率低至6.67%;棉花塞+雙層牛皮紙+棉線封口時，芽增殖系數高達3.24，玻璃化率低至8.46%。

關鍵詞：色素萬壽菊;試管苗;玻璃化;增殖中圖分類號：Q949.783.5??????文獻標識碼：A

Vitrificationof?Regenerated Shoots?of Tagetes erecta?L.in Pigment Marigold

WU Lifang¹， TIAN Xuelian¹， WEI Xiaomei¹， LU Xiaochun¹， QIAN Shaofang²， GUI Baolin³

1. College of Biological Resource and Food Engineering， Qujing Normal University / Center for Yunnan Plateau Biological Resources Protection and Utilization， Qujing， Yunnan 655011，?China;?2. Qujing BoHao Biotech Co.， Ltd.， Zhanyi， Yunnan 655331， China;?3. Soil Fertilizer Workstation， Xundian Agricultural Bureau，?Xundian，?Yunnan 650224， China

Abstract： The?stem with axillary buds fromTagetes erecta L.?was used as the explants， and the effects of sucrose， AgNO₃， agar， plant gel， activated carbon and different sealing materials on shoot proliferation and vitrification were studied in this paper. The results showed that 30?g/L sucrose was suitable for the growth of the plantlet. The vitrification rate decreased with sucrose concentration increased （10-60 g/L）. The vitrification rate was only 9.13% with sucrose concentration at 60?g/L.?AgNO₃had the effect of inhibiting the growth of glass seedlings. 5.0?g/L AgNO₃ had a vitrification rate?as low as 9.81%. The quantity of activated carbon （AC） was most obvious to vitrification， 5.0?g/L AC was most serious for vitrification， and the vitrification rate was as high as 38.18%. Agar and plant gels showed a same trend for bud proliferation and vitrification. Low concentration was conducive for shoot proliferation and high concentration could effectively prevent the occurrence of vitrification. Vitrification rate was the lowest， only 8.31% for 10 g/L agar. The shoot proliferation coefficient was as high as 3.35 for 2.0?g/L plant gel， and the vitrification rate was as low as 6.67% for 5.0?g/L plant gel. When cotton plug plus double kraft paper plus cotton thread was used as the sealing materials， the shoot proliferation coefficient was as high as 3.24 and the vitrification rate was as low as 8.46%.

Keywords：pigment marigold; regenerated shoots; vitrification; proliferation

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.01.016

萬壽菊（Tagetes erecta L.）屬菊科萬壽菊屬一年生植物，原產于墨西哥，早在1700年我國華南就有記載。色素萬壽菊花瓣是提取植物性源葉黃素最理想的原材料之一，被作為經濟作物大量栽種，其經濟價值遠高于多數常規經濟作物^[1]。我國是世界上色素萬壽菊原材料主要栽培國，其種植面積占世界總種植面積的1/3左右，但仍滿足不了市場的需求。國內天然葉黃素精油市場需求量每年約10萬t以上，而實際產量不足6 kt，隨著市場發展，這種天然葉黃素的需求將會越來越大，開發潛能也必會十分廣闊。我國在萬壽菊育種研究方面稍顯滯后，提取葉黃素的專用植物資源及品種匱乏;目前雖對完全依賴進口種子的局面有所改善，但仍缺乏自主知識產權品種，可用品種來源單一，多數還是常規品種種子，其色素含量比較有限，多在16‰左右，而雜交品種色素含量高達19‰～22‰，色素含量每增加1個千分點，價格將提高500元以上，因此培育色素萬壽菊雜交種對于萬壽菊產業具有重要意義^[2]。萬壽菊雜交育種過程中，種質資源狹窄，母本資源中雄性不育系來源有限，短期內滿足不了育種的大量需求，組織培養技術可在短期內快速擴繁出大量育種材料，可為萬壽菊新品種選育提供資源基礎。但色素萬壽菊組織培養中，存在著難以克服的難題——玻璃化現象。

試管苗玻璃化是指組織培養過程中特有的一種生理失調或生理病變，試管苗呈全透明或半透明狀等外觀形態異常的現象。形態上玻璃花苗水水漬化、株形矮小腫脹，節間短或幾乎沒有，葉表面縮小或增大，葉片皺縮并縱向卷曲，脆弱易破碎，細胞中含水量高，葉綠素、蛋白質、纖維素、木質素等含量低，生理生化代謝紊亂，分化能力低，增殖困難，移栽后難以成活^[3-5]，常影響組培苗的質量及規?；a。自Debergh等^[6]對組織培養系統研究中提出“玻璃化”一詞以來，人們對玻璃化發生的原因^[7]、玻璃苗的解剖特征^[8]、生理特性^[9]等都做了一些研究工作，但對玻璃化發生機理的研究并沒有得出可定結論。玻璃化試管苗CAT（catalase）、SOD（superoxide dismutase）、 POD（peroxidase）活性比正常試管苗高^[10]，馬婧等^[11]等對老山芹正常試管苗與玻璃苗的對比分析得出，玻璃化苗淀粉含量、可溶性蛋白、總葉綠素含量和干物質積累率降低，而可溶性糖含量比正常苗高。張琳等^[12]研究認為，大蒜試管苗玻璃化是ROS產生所致，且進一步研究認為質外體是最先感受外源H₂O₂脅迫的細胞器^[13]。導致玻璃化苗發生的因素非常多，不同植物或是同一植物不同器官、組織其主導影響因素也各有差異，至今尚未找到一個普遍適用的控制措施和行之有效的解決方法，因此仍需對玻璃化現象進行更系統和深入的研究?；诖?，本研究利用前期試驗篩選的培養基，通過比較蔗糖、封口材料、固化劑、抗氧化劑和吸附劑及添加物AgNO₃對玻璃苗產生的影響進行研究，以期找到萬壽菊組織培養過程中玻璃化防止措施，為建立色素萬壽菊高效再生體系提供依據。

1??材料與方法

1.1?材料

試驗材料取自云南曲靖博浩生物科技股份有限公司大棚內育苗30～45?d萬壽菊母本資源B_1-1植株帶腋芽的莖段。

1.2?方法

1.2.1 ?外植體表面消毒??將取來的材料自來水下沖洗20 min，用75%酒精浸泡30 s，再用0.1% HgCl₂消毒10 min，無菌水沖洗4～6次后吸干備用。試驗使用的瓊脂（500 g/瓶，強度1200 g/cm²）和植物凝膠（100 g/瓶，植物細胞培養級）均為上海源葉生物科技有限公司產品，均為分析純。

1.2.2?試管苗培養??將帶腋芽莖段接種于MS+?1.0?mg/L?6-BA+0.5?mg/L?NAA+30 g/L蔗糖+7?g/L瓊脂（pH 5.8）培養基上進行培養，每瓶接種3～4個莖段，20 mmol/（m²·s）光下培養，光照16 h/d，溫度（25±1）℃。培養30 d后，獲得的試管苗用于后續試驗。

1.2.3 ?試驗設計及處理 ?試驗設置6組不同處理：（1）對照（CK）：以MS+1.0?mg/L?6-BA + 0.5 mg/L?NAA+30 g/L?蔗糖+7 g/L瓊脂（pH 5.8）為基本培養基進行培養。（2）蔗糖處理組：在MS+1.0?mg/L?6-BA + 0.5 mg/L?NAA?+7 g/L瓊脂（pH 5.8）培養基中分別加入蔗糖10、20、40、50、60 g/L;（3）AgNO₃處理組：分別在基本培養基中添加AgNO₃0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L;（4）活性炭（AC）處理組：分別在基本培養基中添加AC?1.0、2.0、3.0、4.0、5.0?g/L;（5）固化劑處理組：分別在基本培養基中添加瓊脂6.0、8.0、9.0、10.0?g/L，植物凝膠2.0、3.0、4.0、5.0?g/L;（6）封口材料處理組：用罐頭瓶塑料蓋、封口膜+橡皮筋、棉花塞+雙層牛皮紙+棉線作為封口材料。試驗中其余處理均用封口膜+棉線為封口材料，每處理3次重復，每重復10瓶，每瓶接種試管苗3～5株。培養條件同1.2.1。芽增殖系數和玻璃化苗率計算公式如下：

活性炭對克服試管苗玻璃化有明顯的效果，毛俊紅^[21]在對牡丹研究中，添加6?g/L活性炭和3?g/L?PVP可顯著抑制牡丹玻璃苗。饒雪琴等^[22]添加0.3%的活性炭，可使番木瓜玻璃化率明顯降低。李娜等^[23]在色素萬壽菊的研究中得出，活性炭含量在0～0.1%時，能夠明顯降低玻璃化程度，而從0.1%增加到0.5%時，玻璃化程度明顯增高。本研究中，與對照相比，1.0?mg/L活性炭使玻璃化率降低了，而高于1.0?mg/L的活性炭增加了萬壽菊的玻璃化，5.0?g/L?活性炭產生的玻璃化現象最為嚴重，玻璃化率高達38.18%。組織培養中，活性炭使用有利也有弊，一方面可以吸附有毒有害物質，但同時吸附作用無選擇性，使用量不當時，吸附了培養基中鐵鹽和維生素等與玻璃化密切相關的物質從而增加玻璃化率。

固化劑瓊脂和植物凝膠通過影響培養體系的襯質勢而影響組培苗的玻璃化。固化劑濃度太低，培養基凝固性不好，水分過多，易導致玻璃化發生，濃度過高，培養基過硬，培養基內水分少，培養物難以吸收營養也影響組培苗的生長。本研究認為7.0?g/L的瓊脂芽增殖系數最高，為2.88，10?g/L的瓊脂玻璃化率最低，僅8.31%;2.0?g/L的植物凝膠芽增殖系數高達3.35，5.0 g/L植物凝膠玻璃化率低至6.67%。從經濟角度及培養效果考慮，植物凝膠價格比瓊脂要高，使用瓊脂成本會更低。

封口材料影響培養瓶內的濕度和通氣狀況，透氣性好的封口材料既能防治細菌和真菌孢子進入培養瓶內，又能達到瓶內外空氣交換的目的，可降低玻璃苗形成幾率。高疆生等^[24]采用棉塞有效地降低了香石竹玻璃化。本文對塑料蓋、封口膜+橡皮筋、棉花塞+雙層牛皮紙+棉線進行對比研究，得出棉花塞+雙層牛皮紙+棉線封口可使萬壽菊芽增殖系數高達3.24，玻璃化率低至8.46%。

綜上所述，蔗糖濃度對色素萬壽菊試管苗增殖及玻璃化有一定影響，30～40?g/L蔗糖適宜萬壽菊試管苗生長、增殖，60?g/L是降低色素萬壽菊試管苗玻璃化的適宜濃度。5.0?g/L AgNO₃可有效將萬壽菊試管苗玻璃化率降低至9.81%;高濃度的瓊脂和植物凝膠均可降低萬壽菊試管苗玻璃化率，但從成本考慮，使用瓊脂更經濟。活性炭的濃度對不同植物材料有很大差異，色素萬壽菊中不宜使用過高濃度的活性炭，建議濃度在0～?1.0?g/L。

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