稻瘟菌激活蛋白對荷葉生長及活性成分的影響

陳勇輝 葉若松 龔金榮 曹根鳳

摘 要 為開發一種高效、環保、多功能的荷葉促生長劑，以荷葉為試材，研究稻瘟菌激活蛋白對荷葉生長及其抗氧化活性成分含量的影響。結果表明，經濃度為2.5 ?g·mL-1稻瘟菌激活蛋白處理后，荷葉發芽率相比對照組提高了33%，培養30 d后荷葉數量較空白處理增加79%;同時，經濃度為2.5 ?g·mL-1稻瘟菌激活蛋白處理后，與空白對照組相比荷葉中總黃酮、可溶性糖及生物堿含量分別提高72.2%、56.1%及59.1%，荷葉提取物的羥自由基清除率為87.3%?？梢?，稻瘟菌激活蛋白可有效促進荷葉生長，增強其抗氧化活性。

關鍵詞 稻瘟菌;激活蛋白;荷葉;促生長;抗氧化

中圖分類號：S567.239 文獻標志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.32.077

荷葉（Nelumbinis folium），又稱蓮葉，在我國南北方均有分布，有上千年的食用歷史。荷葉營養豐富，除含有豐富的碳水化合物、脂類、蛋白質等化學成分外，還含有黃酮類、酚酸類、生物堿類等多種活性成分[1-2]。傳統醫學界認為荷葉性味苦寒，具有清解暑熱、涼血止血的作用。現代研究表明，荷葉中活性成分具有降壓降脂、抗病毒、抗氧化、抗衰老等多種功效[3-6]。

荷葉作為重要的經濟作物，提高其品質可創造更多經濟價值。植物免疫誘抗劑具有促進植物生長、激活自身免疫系統提高抗病能力等作用，成為近年來生物防治的研究熱點。交鏈孢菌、稻瘟菌和鐮刀菌等多種真菌中存在一類具有誘導植物抗性、提高植物免疫力的蛋白免疫誘抗劑，稱為激活蛋白[7-8]。與宿主細胞表面某些激發子受體結合，通過胞內信號分子級聯放大，激活植物自身免疫系統，增強植物抵御病蟲害和自然脅迫的能力[9]。同時還具有提高發芽勢、促進植物生長的特殊功能，故被認為是一種環境友好型新型多功能生物農藥[10]。

為明確激活蛋白在荷葉上的應用效果，使用激活蛋處理荷葉并評價其促生和提高荷葉品質的作用，旨在為植物免疫誘抗劑合理推廣應用與荷葉的科學種植提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 稻瘟菌的培養與激活蛋白的純化

在無菌環境中，在PDA固體培養基上接種挑取的稻瘟菌菌絲，培養箱中28 ℃培養3 d。轉入28 ℃搖床中的PDA液體培養基中，一直到獲得大量生長旺盛的菌絲體后收集菌絲，參考邱德文研究中的方法[11]，制備出植物激活蛋白母液2.5 mg·mL-1，存于冰箱中冷凍備用。

1.2 荷葉的培養與處理

荷葉種子平均分成3組，將種子進行去殼處理，分別在不同濃度激活蛋白緩沖液（0 ?g·mL-1、1 ?g·mL-1、

2.5 ?g·mL-1、5 ?g·mL-1和10 ?g·mL-1）中浸種6 h后，清水洗滌種子兩次，于清水中25 ℃培養。7 d后移栽入營養土，水培培養，觀察長勢。荷葉幼苗用激活蛋白每7 d噴霧處理1次，30 d后取荷葉烘干磨成粉末，提取荷葉中活性成分。

1.2.1 荷葉總黃酮含量的測定

荷葉粉末加70%乙醇勻漿超聲破碎后，在80 ℃水浴中回流2 h，冷卻后過濾，取清液定容，用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法，于510 nm處測定吸光度。以蘆丁為標樣得到回歸方程計算總黃酮含量，每項實驗重復3次，對比不同濃度激活蛋白對荷葉黃酮含量的影響。

1.2.2 荷葉可溶性糖含量的測定

采用邢穎等的方法提取荷葉中可溶性糖，取荷葉粉末，按1∶20的比例加入蒸餾水，90 ℃水浴提取兩次，每次2 h，抽濾，合并提取液。對比不同濃度激活蛋白對荷葉可溶性糖含量的影響[12]。

1.2.3 荷葉生物堿含量的測定

取荷葉粉末，按1∶40的比例加入90%乙醇，于80 ℃加熱浸提2.5 h。加氯仿萃取靜置，取水層濾液用氫氧化鈉調pH至9～10。用紫外可見分光光度計在281 nm測定提取液中的荷葉生物堿吸光度，以荷葉堿為標樣得到回歸方程計算生物堿含量，對比不同濃度激活蛋白對荷葉生物堿含量的影響。

1.3 激活蛋白對荷葉羥基自由基清除作用的影響

采用的劉軍波等的方法對荷葉成分進行提取，并使用水楊酸法測定經不同濃度激活蛋白處理后的荷葉對羥基自由基的清除率[13]。羥基自由基的清除率計算公式如式（1）所示。

（1）

其中，A0為空白對照的吸光值，Ax為加樣品的吸光值，Ax0為不加顯色劑H2O2時樣品的吸光值。

2 結果與分析

2.1 不同濃度激活蛋白對荷葉種子發芽生長的影響

觀察各組荷葉種子在相同環境及培育時間下的的發芽情況，結果如圖1所示：對照組種子發芽率為63.3%;經濃度為2.5 ?g·mL-1的激活蛋白溶液處理的種子發芽率為84.4%;當激活蛋白濃度上升至10 ?g·mL-1時，發芽率下降至53.3%。由種子發芽率可知激活蛋白濃度為

2.5 ?g·mL-1時蓮子發芽率最高，而激活蛋白濃度繼續上升時種子發芽率降低，可能原因是相對較高濃度的激活蛋白對荷葉發芽率有抑制作用。

如圖2所示，不同濃度激活蛋白處理的荷葉在相同條件下培養荷葉30 d后，激活蛋白處理組葉片數量與對照組比較也具有顯著性差異。經濃度為2.5 ?g·mL-1的激活蛋白溶液處理的荷葉幼株，30 d時的葉片數量高出對照組79%。說明適當濃度的稻瘟菌激活蛋白對荷葉的生長也有明顯的促進作用。

2.2 不同濃度激活蛋白對荷葉黃酮含量的影響

以蘆丁為標準品繪制標準曲線，測得荷葉中黃酮濃度見圖3。對照組荷葉中黃酮的濃度為24.98 mg·g-1;經濃度為2.5 ?g·g-1稻瘟菌激活蛋白處理后，荷葉中黃酮的濃度為43.02 mg·g-1;經濃度為10 ?g·mL-1稻瘟菌處理后，荷葉中黃酮濃度為18.33 mg·g-1。結果表明，2.5 ?g·mL-1激活蛋白溶液可有效提高荷葉中黃酮的含量，但經高濃度稻瘟菌激活蛋白處理過的荷葉中的黃酮反而降低，說明高濃度激活蛋白會抑制荷葉中黃酮的產生。

2.3 不同濃度激活蛋白對荷葉可溶性糖含量的影響

采用蒽酮比色法測定荷葉中可溶性糖含量結果見圖4。未經激活蛋白處理的荷葉中可溶性糖含量為8.54 mg·g-1;

經濃度為2.5 ?g·mL-1稻瘟菌激活蛋白處理后，荷葉中可溶性糖的濃度為13.33 mg·g-1;而經濃度為10 ?g·mL-1稻瘟菌激活蛋白處理后，荷葉中可溶性糖濃度下降至

6.12 mg·g-1。結果表明，在一定濃度范圍內激活蛋白能提高荷葉中可溶性糖的含量。

2.4 不同濃度激活蛋白對荷葉生物堿含量的影響

如圖5所示，未經激活蛋白的荷葉中生物堿的濃度為0.164 mg·g-1;經濃度為2.5 ?g·mL-1稻瘟菌激活蛋白處理后，荷葉中生物堿的濃度為0.261 mg·g-1，經濃度為10 ?g·mL-1稻瘟菌處理后，荷葉中生物堿濃度為0.128 mg·g-1。結果表明，在一定濃度范圍內激活蛋白對荷葉中生物堿的產生有一定促進的作用。

2.5 激活蛋白對荷葉提取物清除羥自由基的影響

經不同濃度稻瘟菌激活蛋白處理的荷葉提取物的羥自由基清除率如圖6所示。對照組清除率為75.36%;經濃度為2.5 ?g·mL-1激活蛋白溶液處理的荷葉提取物清除率為87.3%，當經濃度為10 ?g·mL-1的激活蛋白溶液處理的荷葉提取物清除率為63.58%。實驗結果表明，在一定濃度范圍內，隨著激活蛋白濃度的提高，可提高荷葉的羥自由基清除能力，從而提高荷葉抗氧化性。但高濃度激活蛋白會抑制荷葉羥自由基清除能力，可能是由于高濃度的蛋白會抑制荷葉中黃酮等抗氧化成分的產生。

3 結論

激活蛋白是從真菌中純化出的一類具有誘導植物抗性的新型蛋白激發子，具有提高植物免疫力的作用。本試驗使用激活蛋白溶液處理荷葉，并證明在一定濃度范圍內，激活蛋白可以促進荷葉的生長，并提高荷葉中抗氧化活性成分的含量，從而提高荷葉抗氧化性。荷葉中黃酮類和生物堿類活性成分具有較高的藥用價值和保健功能，使用激活蛋白可以提高荷葉中活性成分含量和抗氧化性，從而提高荷葉的品質。本研究結果不僅有利于荷葉產業的發展，也為激活蛋白的應用提供新的思路和方法，為開發新型綠色農藥奠定理論基礎。

參考文獻：

[1] YANG D，WANG Q，KE L，et al.Antioxidant activities of variou sextracts of lotus （Nelumbo nu ficera Gaertn）rhizome[J].Asia Pac J Clin Nutr，2007，16（1）：158-163.

[2] 鐘先鋒，黃桂東.荷葉成分及功能的研究進展[J].食品與機械，2006，22（4）：138-141.

[3] Yoshiki KHA，Akihiro AH，Yasu MI，et al.Anti-HIVbenzylis oquinoline alkaloids and flavonoids from the leaves of Nelumbo nucifera ， and structure-activity cor relations with related alkaloids[J].Bioorganic & Medicinal Chemistry，2005，13：443-448.

[4] Yuka O，Eri HO，Yukitaka FK，et al.Anti-obesity effect of Nelumbo nucifera leaves extract in mice and rats[J].Journal of Ethnopharmacology，2006，106：238-244.

[5] SU JR，Atul W，Kakali MH，et al.Antioxidant activity of Nelumbo nucifera （sacred lotus）seeds[J].Journal of Ethnopharmacology，2006，104：322-327.

[6] Lahl M，El MM，Hamamouchi J.Evaluation of antifungaland mollusuicidial activities of Moroccan Zizyphus lotus（L.）Desf[J].Ann Pharm Fr，2002，60（6）：410-412.

[7] ZHANG C，LIU X，QIU D，et al.Purification， crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of the effector protein MoHrip1 from Magnaporthe oryzae[J].Acta Crystallographica，2013，69：460-462.

[8] WANG B，YANG X，ZENG H，et al.The purification and characterization of a novel hypersensitive-like response-inducing elicitor from Verticillium dahliae that induces resistance responses in tobacco[J].Appl Microbiol Biotechnol，2012，93：191-201.

[9] CHEN M，ZENG H，QIU D，et al.Purification and characterization of a novel hypersensitive response-inducing elicitor from Magnaporthe oryzae that triggers defense response in rice[J].PLoS One.2012，7（5）：e37654.

[10] CHEN M，ZHANG C，ZI Q，et al.A novel elicitor identified from Magnaporthe oryzae triggers defense responses in tobacco and rice[J].Plant Cell Rep，2014，33（11）：1865-1879.

[11] 邱德文.新型生物農藥-植物激活蛋白[J].農村百事通，2012，2（2）：39-40.

[12] 邢穎，景艷芳.提取方法對荷葉多糖得率及抗氧化活性的影響[J].食品與機械，2020，36（6）：166-169.

[13] 劉軍波，鄒禮根，趙蕓.荷葉營養成分及其水提取物抗氧化活性研究[J].浙江農業科學，2015，56（11）：

1791-1793.

（責任編輯：劉 昀）