淫羊藿水提物及提取藥渣的抗骨質疏松藥效比較研究*

周雅婷，劉 穎，畢亞男，袁曉美，宋 蕾，3，周 昆，3

（1.天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，天津 301617；2.內蒙古農業(yè)大學，呼和浩特 010018；3.天津市中藥藥理學重點實驗室，天津 301617）

骨質疏松癥（OP）表現(xiàn)為骨量減少、骨的微觀結構退化，并且骨的脆性增加及易于發(fā)生骨折[1]，是最常見的骨骼疾病之一。近10 年來，中國患骨質疏松的中老年人數(shù)逐年增多，約占總人口數(shù)的23%，已居世界首位[2-3]。作為嚴重威脅中老年人健康的常見骨病，骨質疏松的防治已成為社會關注和科學研究的焦點之一。

淫羊藿性溫，味甘、辛，具有祛風除濕，補腎壯陽的功效，主要治療腎陽不足、風濕痹痛和骨痿。現(xiàn)代藥理學研究表明，淫羊藿能夠提高免疫力、增強性功能、抗腫瘤、降血糖、抗炎、治療骨質疏松等[4]。淫羊藿總黃酮是淫羊藿屬植物中的主要活性成分[5]，其有效成分主要使用水提、醇提等方法提取，提取后剩余藥渣部分往往被丟棄。本研究針對淫羊藿水提后剩余藥渣部分的藥效展開研究，并與水提物藥效進行比較，考察水提后剩余的藥渣對于雌性大鼠骨質疏松的療效，為淫羊藿水提取后藥渣的再利用、提高藥材利用率提供一定的實驗研究基礎。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF 級雌性SD 大鼠60 只，體質量190～210 g，由北京華阜康生物科技有限公司提供，動物合格證號：SCXK（京）2014-0004。動物飼養(yǎng)于中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所，飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，濕度40%～60%，自然光照，所用飼料為天津市華榮實驗動物科技有限公司生產(chǎn)全價顆粒飼料，飲用自來水。

1.2 受試藥物 淫羊藿藥材，購自河北春開制藥股份有限公司，批號160501423，產(chǎn)地為四川，鑒定為箭葉淫羊藿。

淫羊藿水提物及藥渣均由天津藥物研究院許浚副研究員團隊制備提供。簡單來說，投料6 kg 淫羊藿藥材，先用11 倍水煎煮1 h、再用8 倍水煎煮1 h，水提物噴霧干燥獲得水提物粉末800 g。水提后的剩余部分曬干，獲得藥渣4.8 kg，藥渣經(jīng)粉碎后過150 目篩備用。經(jīng)測定，每克水提物中含淫羊藿苷97.28 mg、寶藿苷19.46 mg；每克藥渣中含淫羊藿苷7.45 mg、寶藿苷9.12 mg。

1.3 試劑和儀器 骨鈣素（OC）、Ⅰ型膠原N 端前肽（P1NP）、Ⅰ型前膠原交聯(lián)C 末端肽（CTX1）ELSIA試劑盒，均為USCN 產(chǎn)品；谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）、血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）和葡萄糖（GLU）全自動生化儀試劑盒，購自北京中生北控生物科技股份有限公司；水合氯醛，分析純，天津市光復精細化工研究所產(chǎn)品；注射用青霉素納，中諾藥業(yè)（石家莊）有限公司產(chǎn)品；氯化鈉注射液，安徽雙鶴藥業(yè)責任有限公司產(chǎn)品；甲醛溶液，分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司產(chǎn)品。

AE200S 電子分析天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）、Micro 17 R 高速離心機（美國，Thermo）、WK-200B 小型高速粉碎機（青州市富爾康制藥機械有限公司）、VivaCT 40 骨密度儀（瑞士，SCANCO Medical AG）、7020 全自動生化儀（日本，Hitachi）、InfiniteM200 多 功 能 讀 板 儀（瑞 士，TECAN）。

2 方法

2.1 模型制備 雌性SD 大鼠適應性飼養(yǎng)30 d后，隨機選取50 只，腹腔注射10%水合氯醛溶液（0.6 mL/100 g）麻醉，行雙側卵巢摘除手術，術后消毒并連續(xù)2 d 腹腔注射8 萬單位青霉素。

2.2 分組及給藥 造模12 周后，將剩余10 只未去勢雌鼠作為對照組，將50 只去勢大鼠隨機分為模型組、水提物1 g/kg 組（以生藥量計，下同）、水提物0.5 g/kg 組、藥渣1 g/kg 組、藥渣0.5 g/kg 組，每組10 只，組間大鼠體質量無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。各組大鼠按照1 mL/100 g 灌胃給藥，每日1 次，連續(xù)灌胃8 周，對照組及模型組給予相應體積的飲用水。每日觀察大鼠的精神狀態(tài)及采食飲水等生活狀況，每周稱質量并記錄。

2.3 實驗數(shù)據(jù)采集

2.3.1 血液樣本的收集與處理 最后1 次給藥結束后，用10%水合氯醛溶液麻醉大鼠，腹主動脈取血，3 500 r/min 離心10 min，吸取血清分裝于1.5 mL離心管中，使用7020 全自動生化儀檢測血清中AST、ALT、TC、TG 和GLU 含量，并用ELISA 試劑盒測定OC、CTX1、P1NP 含量。

2.3.2 脛骨的分離與處理 分離左側脛骨，剔凈附著于脛骨上的肌肉及結締組織，采用10%甲醛溶液固定，并置于透明離心管中備用。采用VivaCT 40 對左側脛骨進行CT 掃描，然后利用軟件Scanco Medical version 6.0 對脛骨的總體積（TV）、骨體積（BV）、骨表面積（BS）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁分離度（Tb.Sp）進行分析。

3 結果

3.1 各組大鼠體質量、肝系數(shù)、腎系數(shù)和子宮系數(shù)的測定 與對照組相比較，模型組大鼠的體質量、腎質量、子宮質量、肝系數(shù)、腎系數(shù)和子宮系數(shù)均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05 或P＜0.01）。與模型組相比，水提物0.5 g/kg 組和藥渣0.5 g/kg 組的肝臟質量有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；水提物0.5 g/kg 組的腎臟質量顯著降低（P＜0.05），體重、子宮質量及臟器系數(shù)雖有變化但無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），見表1。

3.2 血清生化的測定 模型組大鼠的血清CTX1含量較對照組顯著降低（P<0.05），給予水提物0.5 g/kg 治療后血清CTX1 顯著升高（P＜0.05）；模型組的OC 和PINP 的水平有所升高但無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），淫羊藿水提物和藥渣干預后可使其水平降低，見表2。血清生化標志物檢測結果顯示，相比模型組，1.0 g/kg 和0.5 g/kg 劑量水提物及1.0 g/kg 藥渣組的ALT 含量均明顯升高（P＜0.05），0.5 g/kg 藥渣組的ALT 含量有所升高，但無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。各給藥組的TC 與TG 含量均比模型組升高（P＜0.05或P<0.01），AST 和GLU 含量變化未見統(tǒng)計學差異（P＞0.05），但有升高趨勢，見表3。

表1 淫羊藿給藥8 周對各組大鼠體質量、臟器及其系數(shù)的影響（）

表1 淫羊藿給藥8 周對各組大鼠體質量、臟器及其系數(shù)的影響（）

注：與對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 劑量（g 生藥/kg） n 體質量（g） 肝質量（g） 腎質量（g） 子宮質量（g） 肝系數(shù) 腎系數(shù) 子宮系數(shù)對照組 — 10 344.60±35.01 8.08±0.71 2.09± 0.13 0.57±0.06 2.354±0.14 0.61±0.07 0.17±0.02模型組 — 10 401.60±37.76# 7.90±0.71 1.88±0.20# 0.23±0.20## 1.98±0.21## 0.47±0.07## 0.06±0.06##水提物 0.5 10 384.40±34.60 6.97±0.67* 1.72±0.07* 0.20±0.02 1.81±0.09 0.45±0.04 0.05±0.01水提物 1.0 10 388.92±39.98 7.31±0.88 1.78±0.15 0.22±0.10 1.88±0.16 0.46±0.05 0.06±0.03藥渣 0.5 10 387.11±23.87 6.99±0.45* 1.75±0.11 0.16±0.03 1.81±0.09 0.45±0.03 0.04±0.01藥渣 1.0 10 394.13±35.26 7.41±0.72 1.82±0.12 0.27±0.17 1.89±0.23 0.46±0.04 0.07±0.05

表2 淫羊藿給藥8 周后各組大鼠血清中OC、CTX1、P1NP含量（）

表2 淫羊藿給藥8 周后各組大鼠血清中OC、CTX1、P1NP含量（）

注：與對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 劑量（g 生藥/kg） n OC（pg/mL）CTX1（pg/mL）P1NP（pg/mL）對照組 — 10 78.3±3.1 1092.2±53.0 1296.4±232.4模型組 — 10 90.9±7.8 839.1±98.8# 1306.6±187.9水提物 0.5 10 86.6±4.1 1241.1±61.8* 1296.5±426.1水提物 1.0 10 83.8±3.1 931.9±54.8 948.2±168.2藥渣 0.5 10 88.9±4.6 867.1±57.8 944.0± 77.4藥渣 1.0 10 88.1±5.3 900.7±66.3 918.8±162.8

3.3 脛骨骨微結構參數(shù)的測定 圖1 可見，模型組的TV、BV、BS 和Tb.N 較對照組顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），同時Tb.Th 和Tb.Sp 顯著升高（P＜0.01）。給予不同劑量的水提物和藥渣后，各給藥組的TV、BS 均比模型組顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01），且BS 的分析結果顯示，0.5 g/kg 藥渣的改善效果優(yōu)于0.5 g/kg 水提物組（P＜0.01）。1.0 g/kg 劑量水提物及1.0 g/kg 和0.5 g/kg 劑量藥渣可明顯升高Tb.N 同時降低Tb.Th（P<0.05 或P<0.01），且0.5 g/kg 藥渣的效果優(yōu)于0.5 g/kg 水提物組（P<0.01）。此外，1.0 g/kg藥渣可顯著升高BV 值同時降低Tb.Sp 值（P<0.05）。

表3 淫羊藿給藥8 周后各組大鼠血清ALT、AST、TC、TG 和GLU 含量（）

表3 淫羊藿給藥8 周后各組大鼠血清ALT、AST、TC、TG 和GLU 含量（）

注：與對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 劑量（g 生藥/kg） n ALT（pg/mL） AST（pg/mL） TC（pg/mL） TG（pg/mL） GLU（pg/mL）對照組 — 10 15.90±9.64 77.90±14.63 1.22±0.24 0.52±0.23 7.18±1.69模型組 — 10 13.44±9.32 78.33±19.33 1.11±0.36 0.36±0.09 5.86±1.01水提物 0.5 10 25.20±7.68* 87.40±23.95 1.91±0.48** 0.51±0.13* 5.57±0.81水提物 1.0 10 22.00±6.35* 94.09±12.63 1.82±0.28** 0.49±0.09** 6.75±1.14藥渣 0.5 10 21.67±9.96 92.56±16.70 1.68±0.19** 0.48±0.09* 6.14±1.02藥渣 1.0 10 20.93±7.10* 85.20±18.89 1.54±0.44* 0.55±0.17** 6.25±1.66

圖1 淫羊藿給藥8 周對各組大鼠脛骨骨微結構的影響

4 討論

本研究采用的去勢法是應用廣泛的模擬絕經(jīng)后骨質疏松骨代謝的動物模型[6]，相較于對照組，造模后去勢雌鼠的子宮指數(shù)有顯著的下降，其原因在于去勢后大鼠的雌激素水平降低導致子宮產(chǎn)生萎縮，該現(xiàn)象與文獻報道相符[7]，淫羊藿給藥各組子宮系數(shù)并未見明顯恢復，提示淫羊藿對骨質疏松的治療作用也許并不依賴于雌激素樣作用。

血清中生化指標可較為靈敏地反映骨質疏松癥骨代謝情況，并先于骨密度的變化[8]，本研究中與對照組相比，血清PINP 和OC 水平有升高趨勢、但無統(tǒng)計學差異，而骨吸收標志物CTX1 明顯降低，與通常認為絕經(jīng)后雌激素缺乏導致女性骨轉換加速、骨吸收超過骨形成而導致骨質疏松的觀點有所不同，這也可能與動物本身個體差異以及其所處骨質疏松階段的不同有關，同時也有一些研究顯示大鼠血清相關指標未見統(tǒng)計學差異[9-10]。但總的來說，淫羊藿水提物/藥渣可使去勢動物血清OC、P1NP、CTX1 向對照組動物的正常水平進行調節(jié)。

骨形態(tài)計量學指標既能直觀反應骨組織結構的好壞，又能客觀反應骨代謝情況的變化[11]，本研究主要檢測脛骨的TV、BV、BS、Tb.N、Tb.Th 和Tb.Sp。骨形態(tài)計量學數(shù)據(jù)顯示雙側卵巢切除后12 周，與對照組比較，模型組脛骨的TV、BV、BS 和Tb.N 均顯著下降，同時Tb.Th 和Tb.Sp 均顯著上升，證實造模成功。給藥后各項指標均有所改善，表明淫羊藿水提物和藥渣可明顯改善骨微結構；且就BS、Tb.N、Tb.Th 和Tb.Sp 的改善效果來看，0.5 g/kg 藥渣的效果優(yōu)于0.5 g/kg 水提物。

鑒于近年來對中藥安全性的關注，同時也因為有文獻提及淫羊藿的肝毒性問題[12]，本實驗中進行了更多的血清生化指標檢測。結果發(fā)現(xiàn)去勢雌性大鼠連續(xù)使用淫羊藿水提物/藥渣2 個月后，ALT 和AST 均有所升高，且在1.0 g/kg 和0.5 g/kg 劑量水提物以及1.0 g/kg 藥渣干預下ALT 水平變化顯著，而在雄性去勢動物上并未發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象[13]，提示長期使用淫羊藿可能對雌激素缺乏大鼠的肝功能造成影響，但ALT 和AST 升高幅度并不高、而肝臟系數(shù)也未見明顯升高或降低，因此這種ALT 水平的升高是否與淫羊藿引起肝臟損害有關，尚待進一步研究確認。

由于醇提取對各種成分的轉移率明顯高于水提取，本研究提示在中成藥生產(chǎn)工藝中，可以考慮更多的采用醇提代替水提，可能更有利于發(fā)揮藥效。藥渣是中藥及中成藥經(jīng)過既定提取方式提取后的剩余物，按照常規(guī)會作為廢棄物進行處理。近年來，中藥渣的循環(huán)再利用引起了重視，相關研究主要集中在中藥渣堆肥育苗、栽培食用菌、做動物飼料、生產(chǎn)沼氣等方面[14]。實際上，在實際提取中，由于提取工藝和有效成分轉移效率的原因，藥渣也可能具有藥效作用。藥典中淫羊藿藥材推薦用量為6～10 g，折合大鼠用量約為0.54～0.90 g/kg，本研究結果證明了淫羊藿藥渣1.0 g/kg 和0.5 g/kg 劑量對去勢造成的雌性大鼠骨質疏松有一定療效，總體治療效果不低于水提物，且對BS、Tb.N、Tb.Th 和Tb.Sp 的改善效果優(yōu)于同等劑量水提物組。這提示，常規(guī)水提取后的藥渣有再利用價值，不應直接作為工業(yè)廢棄物處理，應進一步研究其作用和再利用方式，例如，從淫羊藿藥渣中提取單體活性成分等。