秸稈還田對黑土亞表層微生物群落結構的影響特征及原因分析

叢 萍，王 婧，董建新，李玉義，劉 娜，逄煥成

秸稈還田對黑土亞表層微生物群落結構的影響特征及原因分析

叢 萍1,2，王 婧1，董建新2，李玉義1，劉 娜1，逄煥成1※

（1. 中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所，北京 100081；2. 中國農業科學院煙草研究所，青島 266100）

為明確切碎秸稈與秸稈顆粒對黑土亞表層土壤微生物群落結構的影響效應，從而評價不同秸稈還田方式對亞表層的培肥效果，該研究于2016—2018年在東北黑土區進行一次性玉米秸稈深埋還田試驗，設置切碎秸稈低量（QS1）、切碎秸稈高量（QS5）、秸稈顆粒低量（KL1）與秸稈顆粒高量（KL5）4種秸稈還田處理，并與秸稈不還田（CK）進行對比，于每年玉米收獲季對土壤理化指標及微生物菌群結構進行監測。結果表明，1）秸稈還田第1年，切碎秸稈處理顯著提高土壤總磷脂脂肪酸含量及真菌摩爾百分數，其高量處理較CK最高增加71.0%和120.5%，而秸稈顆粒處理對細菌、革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的摩爾百分數增幅更顯著，其高量處理最高增加41.6%、29.7%和26.3%；還田第2年高量處理顯著提高各菌群磷脂脂肪酸含量，且切碎高量處理的真菌摩爾百分數含量顯著高于顆粒高量處理21.0%；還田第3年僅高量處理下的菌群結構有顯著分異。2）還田初期切碎秸稈處理顯著提高真菌：細菌比值，而低量還田則對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌比有提高，隨還田時間的增加，高量還田比值提高更顯著，利于長期維持生態系統穩定性。3）秸稈高量還田可顯著改變土壤理化因子水平，這是導致微生物群落結構分異的重要原因，其顯著影響因子隨還田年限而更替：第1年，土壤容重、酸堿度、全氮和碳氮比為顯著（<0.05）影響因素；第2年，土壤含水量、有機碳、碳氮比和土壤容重為極顯著影響因素（<0.01）；第3年僅有機碳為顯著因素（<0.05）。切碎秸稈高量還田處理微生物群落結構分布與CK區分最為明顯，對土壤真菌群落的調控能力更強，更適宜于東北黑土亞表層肥力的提升。

土壤；秸稈；微生物群落結構；深還田；亞表層

0 引 言

土壤微生物是土壤生態系統中最活躍的具有生命特征的重要組成成分，參與生態系統中的各個養分生化循環過程[1-2]，土壤微生物多樣性以及結構變化已成為衡量土壤肥力質量的重要指標[3-4]。秸稈還田是當前增加農地有機物料投入的重要手段之一，可以培肥土壤、提升地力。秸稈施入到土壤中對微生物群落結構及多樣性有重要影響，一方面作為高碳源有機物質為土壤微生物生命活動提供能量，另一方面，秸稈還田后改變了土壤的孔隙結構及水分狀況等，影響了微生物的生存環境[5-6]。可見，秸稈還田易于影響微生物生境中的敏感性因子，研究土壤中的微生物變化有利于更好地評價秸稈還田的培肥效果。

亞表層是位于心土層（20～50 cm）范圍內的重要耕作層以及作物根系分布層，位于約20～40 cm，對土壤碳固定以及作物產量提高有重要作用[7]。然而當前東北黑土犁底層增厚變硬（增厚至7～11 cm）[8]、亞表層有機碳含量銳減（較墾前降低40%～60%[9]、黑土層變薄（近40%已小于30 cm）[10-11]等問題嚴峻，亟需有效措施進行培肥改良。秸稈深還田是培肥亞表層的重要措施[12-14]，它直接將秸稈施入30～40 cm土層，使土壤容重降低9.9%～6.2%[13]，有機碳增加10%～20%，并且改善效果在一定程度上隨著秸稈用量的增加而增大[14]。然而，當前有關秸稈還田對亞表層微生物群落結構影響的研究甚少，土壤生物學肥力的改善效果未知。

研究表明，秸稈用量、秸稈形態以及還田年限等對土壤微生物均有不同影響。秸稈用量因耕作方式以及氣候類型而異，東北玉米大豆輪作區免耕條件下60%的秸稈還田量更有利于提高微生物活性[15]，而在南方水稻產區耕翻條件下2/3還田量處理的土壤微生物活度最高，少免耕條件下1/3還田量處理最高[16]。秸稈形態越細小，粉碎化程度越高，越有利于加快微生物的腐解進程[17]，并且能夠影響細菌及真菌的群落組成[18]。在中國北方地區，長期玉米秸稈還田能夠顯著提高真菌生物量，而對細菌無顯著影響[19]，但是短期的秸稈還田則能夠增加土壤總磷脂脂肪酸（PLFA）數量、真菌以及細菌生物量[20]。但上述有關秸稈還田對土壤微生物影響的研究往往只針對于0～20 cm耕層，且還田量大多低于全量還田，致使玉米秸稈的肥料化利用率仍然偏低。收割機切碎后的秸稈直接還田操作相對簡便，是農民常用的秸稈還田形式嗎，但秸稈形態較為粗放，可能無法在短期內快速培肥，而新型的秸稈顆粒肥是用常規秸稈細粉后擠壓制成，具有體積小、施用方便、養分釋放率高的優點，且前期試驗驗證其具有快速培肥耕層土壤的效應[21-22]。對于土壤亞表層而言，其氧氣以及水分條件等均異于耕層[23]，當不同形態或者是大量秸稈施入亞表層后，碳源的增加及其他理化性狀的改變必然引起土壤微生物群落的變化，但其影響特征以及改變原因尚不清晰。因此，本研究將收割機切碎的秸稈（QS）以及秸稈顆粒（KL）2種形態的秸稈實施深還田，在前期研究的基礎上設置高、低兩種倍量，并與秸稈不還田（CK）進行對比。研究目的在于：一是探究不同秸稈形態以及倍量還田下亞表層土壤細菌及真菌群落結構的變化，二是明確東北黑土區影響亞表層微生物群落變化的主要環境因子，以期從土壤微生物學角度為東北黑土亞表層的培肥方式提供指導。

1 材料和方法

1.1 試驗地概況

田間定位試驗于2015－2018年在吉林省公主嶺市朝陽坡鎮（43°36′N，124°43′E）進行，該地位于我國東北黃金玉米生產帶上，地處吉林省中西部，東遼河中游右岸。當地以雨養農業為主，種植作物主要為玉米、大豆。屬溫帶大陸性季風氣候，年平均氣溫5.6 ℃，年均降水量594.8 mm，無霜期144 d。試驗地土壤類型為典型黑土，耕作方式以旋耕、翻耕為主。土壤基礎理化性狀如表1。

表1 2015年10月試驗地土壤基本理化性狀

1.2 試驗材料

本試驗設置玉米切碎秸稈、玉米秸稈顆粒2種不同秸稈形態，以當地秸稈常量還田的用量為基準（玉米收獲后剩余地上部的總量，每年約為15 t/hm2），分別設置玉米秸稈切碎還田（QS1, 15 t/hm2）、玉米秸稈切碎還田（QS5, 75 t/hm2）、玉米秸稈顆粒還田（KL1, 15 t/hm2）、玉米秸稈顆粒還田（KL5, 75 t/hm2）4種秸稈還田處理，并以秸稈不還田（CK）為對照。每個處理3次重復，共設15個小區，隨機區組排列，每個小區為長4 m、寬4 m（6壟）共計16 m2見方，小區與小區之間留出1 m距離，避免因農機具拖曳秸稈而對小區處理造成影響。試驗布置前需收集當地玉米收獲時隨收割機切碎的玉米秸稈，長度約10～15 cm，將收集起的秸稈分為2部分，一部分風干后用作切碎秸稈還田處理（QS），另一部分收集起來的玉米秸稈用HC-2000型粉碎機粉碎后過2 mm篩，按照30%～35%比例添加蒸餾水，攪拌均勻后用FTHBCX350型環模秸稈顆粒機擠壓制得直徑4 mm、長度4～6 cm的棒狀固體，即秸稈顆粒（KL），不同形態秸稈的主要理化性狀如表2所示。

表2 不同形態秸稈的主要理化性狀

1.3 試驗設計

在2015年10月前茬玉米收獲后實施秸稈翻埋，將收集到的切碎秸稈以及秸稈顆粒按照規定用量均勻鋪于各個小區內，由拖拉機牽引翻埋犁（功率>92 kW）統一對整片試驗田進行翻埋耕作，從而避免對相鄰小區的碾壓。秸稈翻埋犁作業深度約為30～40 cm，可將絕大部分切碎秸稈以及秸稈顆粒翻入20～40 cm亞表層范圍。此后3年試驗期間不再進行任何秸稈還田，每年玉米播種前需清除地表殘留秸稈。當地種植制度為玉米連作一年一熟制，供試玉米品種為奇玉8號，通常為每年5月初進行播種，種植密度為67 500 株/hm2，播種前進行側面深施基肥，施用量為純N 225 kg/hm2、P2O575 kg/hm2和K2O 225 kg/hm2。其中磷肥、鉀肥一次播種，氮肥30%基施，70%拔節施，各處理的田間管理與普通高產玉米相似，并于每年10月初收獲。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 土壤樣品采集

2016－2018年連續3年在夏玉米成熟期（10月初），在距離小區邊緣0.5 m的內部依據五點取樣原則用不銹鋼土鉆取20～40 cm土層的土樣，混勻作為一個重復。將土壤樣品從土鉆中取出后，剔除可見的掉落物和根系，將土塊輕輕捏碎、混勻，在田間過2 mm篩[24]，一部分新鮮土樣立即放在保溫盒內用冰袋保存運回實驗室，冷凍干燥后放在?80 ℃保存，用于磷脂脂肪酸（PLFA）法測定微生物群落結構；另一部分土樣放入自封袋中帶回實驗室風干，用于測定土壤理化因子指標。

1.4.2 磷脂脂肪酸（PLFA）的測定

土壤微生物群落采取磷脂脂肪酸（PLFA）方法進行測定。磷脂脂肪酸的提取方法主要參照Frostegard等[25]的方法。采用美國MIDI Sherlock微生物鑒定系統平臺（Version 4.5, MIDI, Inc, Newark, DE）的PLFA模塊，以氫氣為載氣，以安捷倫Agilent 6890N氣象色譜儀及FID檢測器為硬件平臺，色譜柱為Agilent 19091B?102（25 m× 200m× 0.33m），每個樣品進樣量為1L。根據MIDI平臺規范，所有測試均采用0.5 mg/mL十九酸甲酯標準品（冷泉港生物科技股份有限公司）進行校正。脂肪酸定量用峰面積和內標曲線法表征，單位nmol/g。

以磷脂脂肪酸16:0、17:0、16:1ω5c、16:1ω7c、16:1ω9c、17:1ω8c、18:1ω5c、18:1ω7c、a15:0、a17:0、cy17:0、cy19:0ω8c、i14:0、i15:0、i16:0、i17:0和i19:0表征細菌[26]。用18:2ω6,9c、18:1ω9c和18:3ω6c（6,9,12）表征真菌[27]。以16:0（10Me）、17:0（10Me）和18:0（10Me）表征放線菌。以14:0、17:0、18:0、i14:0、i15:0、i16:0、i17:0、a15:0、a17:0和cy17:0、cy19:0ω8c、16:1ω5c、16:1ω9c、16:1ω7c、17:1ω8c、18:1ω5c、18:1ω7c分別表征革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G-）[28]。

1.4.3 環境因子的測定

秸稈還田后直接改變土壤容重（soil bulk density，SBD，g/cm3）、土壤含水量（soil water content，SWC，g/kg）、pH值、土壤有機碳含量（soil organic carbon，SOC，g/kg）、土壤全氮（total nitrogen，TN，g/kg）以及土壤C/N，因此選擇此6項作為主要的環境因子。其中，SBD在田間運用環刀法對20～40 cm土層進行測定；SWC則運用經典烘干法對20～40 cm土層進行測定；土壤pH運用FE38-FiveEasyPlus?（Mettler-Toledo, Switzerland）型pH計進行測定；土壤有機質（soil organic matter，SOM，g/kg）采用重鉻酸鉀外加熱法測定，再根據SOM（g/kg）=SOC（g/kg）×1.724來換算成有機碳的含量；TN采用凱氏定氮法進行測定；C/N則是SOC與TN的比值。

1.5 數據處理

采用Microsoft Excel 2016對試驗數據進行整理，運用SAS 9.4軟件中的單因素方差分析（one-way ANOVA）比較不同處理間的差異（LSD，=0.05）。采用Canoco 5.0軟件對不同處理間微生物群落分布差異進行主成分分析（principal component analysis, PCA），對微生物群落結構變化與環境因子的相互關系進行冗余分析（redundancy analysis, RDA）。

2 結果與分析

2.1 秸稈還田對亞表層土壤微生物群落的影響

2.1.1 亞表層土壤微生物磷脂脂肪酸（PLFA）的變化特征

在黑土亞表層中微生物群落數量的大小順序為細菌最大，真菌與放線菌次之。與CK相比，秸稈還田前2年顯著增加亞表層土壤磷脂脂肪酸（PLFA）總量以及細菌、真菌的摩爾百分數，但能夠降低放線菌摩爾百分數，降低幅度隨還田時間的增加略有減小（表3）。主要表現如下：

表3 2016－2018年不同處理下亞表層土壤（20～40 cm）PLFA總量以及各菌群PLFA變化

注：CK為秸稈不還田；QS1為玉米秸稈切碎還田，15 t·hm-2；KL1為玉米秸稈顆粒還田，15 t·hm-2；QS5為玉米秸稈切碎還田，75 t·hm-2；KL5為玉米秸稈顆粒還田，75 t·hm-2。小寫字母代表不同處理間進行差異比較，差異分析在<0.05的顯著性水平，下同。

Note: CK, no straw return; QS1, chopped straw return with 15 t·hm-2; KL1, pelletized straw return with 15 t·hm-2;QS5, chopped straw return with 75 t·hm-2; KL5, pelletized straw return with 75 t·hm-2. Different lowercase letters represent differences between treatments at the level of 0.05, the same below.

2016年，PLFA總量變幅在18.96～32.36 nmol/g，與CK相比，QS1與QS5處理分別顯著增加亞表層土壤PLFA含量45.5%（<0.05）與71.0%（<0.05）。秸稈還田能顯著增加細菌摩爾百分數，增幅為14.5%～41.6%（<0.05），以秸稈顆粒最為顯著；切碎秸稈還田能顯著增加真菌摩爾百分數，QS5與QS1分別較CK提高120.5%（<0.05）與54.7%（<0.05），且QS5處理顯著高于QS1；秸稈還田能降低放線菌的摩爾百分數，其中KL5降低幅度最大，約為29.4%（<0.05）；KL5處理下G+與G-的摩爾百分數最高，分別高于CK 29.7%（<0.05）與26.3%（<0.05），而KL1次之，QS5最低。由此可見，在還田第1年秸稈形態對PLFA總量以及菌群結構影響顯著，秸稈顆粒能夠顯著增加細菌摩爾百分數，而切碎秸稈更易引起真菌摩爾百分數的顯著提高，且切碎秸稈對真菌的增加程度要高于秸稈顆粒之于細菌。

2017年，PLFA總量變幅在15.83～20.50 nmol/g，與CK相比，QS5與KL5處理分別顯著增加土壤PLFA總量29.5%（<0.05）與16.2%（<0.05），但二者無顯著差異；秸稈還田處理下細菌摩爾百分數含量均顯著高于CK，表現為QS5>KL5與QS1>KL1，增幅為6.0%～19.9%（<0.05）；從真菌含量變化看，QS5與KL5分別顯著高于CK 74.5%（<0.05）與44.2%（<0.05），且QS5亦顯著高于KL5 21.0%（<0.05）；而對于放線菌而言，KL5與QS5仍表現出顯著降低趨勢，低于CK約24.3%；秸稈高量還田較CK顯著增加革蘭氏陽性菌（G+）與革蘭氏陰性菌（G-）的摩爾百分數約6.3%（<0.05）與13.2%（<0.05），但KL5與QS5之間無顯著差異。由此可見，秸稈還田第2年PLFA總量以及各菌群變化受秸稈用量的影響顯著，秸稈高量還田能夠顯著增加PLFA總量以及細菌、真菌、G+與G-的摩爾百分數，顯著降低放線菌的摩爾百分數。

2018年，PLFA總量變幅在15.04～18.56 nmol/g，但秸稈還田對PLFA總量及細菌、真菌與G+的摩爾百分數無顯著影響。其中，秸稈高量還田能顯著降低放線菌的摩爾百分數約17.9%（<0.05），KL5亦能顯著降低G-20.1%（<0.05）。可見隨著還田時間增加，秸稈對土壤微生物群落結構的影響逐漸減小，微生物群落結構有回歸于最初結構組成的趨勢。

2.1.2 亞表層真菌：細菌比值以及G+：G-比值的變化特征

土壤中真菌：細菌比值及G+：G-比值常用來表示土壤生態系統的穩定性，比值越大，土壤生態系統越穩定[29]。其中真菌：細菌比值的提高可增加土壤固碳能力，而G+：G-比值高則表明腐殖化程度較高的碳源較多[30]。從真菌：細菌比值來看（圖1a），與CK相比，2016年切碎秸稈還田提高了真菌：細菌比值，而秸稈顆粒還田降低了真菌：細菌比值，其中QS5處理下土壤亞耕層真菌：細菌比值為0.34，顯著高于CK的0.19（<0.05），KL5僅為0.10，顯著低于CK（<0.05）；2017年，QS5與KL5真菌：細菌比值均顯著高于CK，其中QS5最高為0.23（<0.05），KL5為0.20（<0.05）；2018年各處理真菌：細菌比值均與CK無顯著差異。隨著秸稈還田時間的增加，切碎秸稈還田真菌：細菌比值逐漸降低，而秸稈顆粒還田則逐漸上升，秸稈高量還田更易提高真菌：細菌比值。

從G+：G-比值來看（圖1b），2016年，QS1的G+：G-比值為1.89，顯著高于CK的1.65（<0.05），而QS5為1.26，顯著低于CK（<0.05）；2017年，各處理雖與CK相比無顯著差異，但KL1的G+：G-比值最高為1.89，顯著高于QS5與KL5（<0.05）；2018年，雖然秸稈還田處理均較CK提高了G+：G-比值，但無顯著差異。由此可見，G+：G-比值的變化受秸稈形態與秸稈用量的綜合影響，還田前期高量處理在一定程度上抑制了G+：G-比值的增加，但隨著還田時間的延長，秸稈高量還田的G+：G-比值逐漸提高，這是因為G-對新鮮有機碳的輸入反應更敏感，起初占據優勢地位[31]，而到后期有機碳轉化為穩定碳源，G+開始增長。

注：不同字母代表相同年份下不同處理間差異顯著（P<0.05）。

2.1.3 亞表層各菌群PLFA的分布特征

對亞表層土壤中所檢測出的所有PLFA單體的摩爾數進行主成分（PCA）分析（圖2、圖3和圖4）。2016年，PC1與PC2分別占據了總變異的25.23%和24.34%，QS5處理的樣本在第一主成分上明顯與CK區分開，而QS1處理的樣本在第二主成分上明顯與其他處理的樣本區分開（圖2a）。其中飽和脂肪酸（14:0、15:0、16:0、17:0、20:0、23:0、i13:0、i14:0、i16:0和i17:0）、環丙烷脂肪酸（17:0cy ω7c）、甲基支鏈脂肪酸（17:0 （10Me）和16:0（10Me））以及部分單不飽和脂肪酸（16:1 ω7c、16:1 ω5c、17:1 ω8c和18:1 ω9c）和多不飽和脂肪酸（22:5 ω6c、20:5 ω3c、19:3 ω3c和18:2 ω6c）在第一主成分上載荷值較高且為正值（圖2b），而在第一主成分的載荷值的負值區域僅有部分單不飽和脂肪酸（14:1 ω9c、14:1 ω8c、19:1 ω8c、20:1 ω9c和16:1 ω9c）和多不飽和脂肪酸（21:3 ω3c、19:3 ω6c和16:3 ω6c）分布。從第二主成分上來看，在載荷值為正值部分主要分布飽和脂肪酸及甲基支鏈脂肪酸，而載荷值為負值部分主要分布不飽和脂肪酸和環丙烷脂肪酸。其中不飽和脂肪酸多為革蘭氏陰性菌和真菌的標記脂肪酸，而飽和脂肪酸、環丙烷脂肪酸以及甲基支鏈脂肪酸多為革蘭氏陽性菌和放線菌的標記脂肪酸，其中環丙烷脂肪酸在厭氧環境下廣泛存在，可作為厭氧環境指標[32]。

2017年的PCA分析顯示，PC1與PC2分別占據了總變異的36.66%和20.66%，在第一主成分上QS5樣本與KL5和QS1樣本與CK和KL1樣本均有較好的區分，而在第二主成分上，QS1樣本則與其他處理的樣本有較好區分（圖3a）。從第一主成分來劃分，土壤中多數PLFA單體的載荷值為正值，僅有少數多不飽和脂肪酸（21:3 ω3c和18:2 ω6c）以及甲基支鏈脂肪酸（17:1 ω7c（10Me）和16:0（10Me））的載荷值為負值；從第二主成分來劃分，甲基支鏈脂肪酸（18:1 ω7c（10Me）和19:1 ω7c（10Me））與單不飽和脂肪酸（22:1 ω3c和19:1 ω8c）載荷值為正值，而載荷值為負值部分多為飽和脂肪酸（12:0、17:0、a14:0和a16:0）分布（圖3b）。

2018年的PCA分析顯示，PC1與PC2分別占據了總變異的28.48%和21.79%，在第一主成分上QS5樣本與CK有明顯區分，在第二主成分上KL1、KL5和QS1樣本與CK的樣本有較好的區分（圖4a）。從第一主成分來劃分，多不飽和脂肪酸（24:1 ω3c、20:5 ω3c和20:3 ω6c）以及飽和脂肪酸（12:0、a13:0和i15:1 ω6c）的載荷值為正值，甲基支鏈脂肪酸（18:0（10Me）和16:0（10Me））以及部分飽和脂肪酸和小部分不飽和脂肪酸的載荷值為負值；而飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸在第二主成分上均占有相當的正負載荷值（圖4b）。

圖3 2017年不同處理下亞表層土壤微生物群落結構的主成分分析

圖4 2018年不同處理下亞表層土壤微生物群落結構的主成分分析

2.2 土壤微生物群落結構與土壤環境因子的關系

2.2.1 秸稈還田后土壤環境因子的變化

土壤環境因子的變化是影響土壤微生物群落結構組成的重要因素。表4表明，秸稈還田1 a，即2016年，QS5對土壤容重（SBD）、土壤含水量（SWC）及全氮（TN）的改善效果最顯著，幅度均>20%（<0.05），而KL5對土壤有機碳（SOC）及碳氮比（C/N）的提升最顯著，分別達21.3%（<0.05）與13.2%（<0.05），且秸稈還田對土壤pH有普遍降低作用。秸稈還田2 a，低量還田對各因素的影響程度降低，僅高量還田對各因素仍有顯著影響，對土壤pH開始表現出提升效應，且QS5顯著提高SOC達27.3%（<0.05）。秸稈還田3 a，僅秸稈高量還田對各因子有顯著影響，但影響程度減弱。可見，秸稈一次性高量還田能夠多年影響土壤環境因子，對SWC、SOC、TN、C/N的提高具有正效應，對SBD的增加具有負效應，對土壤pH則表現為前期顯著降低后期顯著提高。

表4 秸稈深埋還田對亞表層土壤主要環境因子的影響

2.2.2 土壤微生物群落PLFA與土壤環境因子的冗余分析

對20～40 cm亞表層土壤微生物群落PLFA與土壤環境因子進行冗余分析（圖5），以揭示秸稈還田后引起微生物群落改變的重要原因。RDA分析表明，亞表層土壤環境因子對土壤微生物群落結構有重要影響，2016年，兩個排序軸解釋了總變異約80%，說明這兩個排序軸在一定程度上能反映土壤環境因子對微生物群落影響的大部分信息，其中SWC、C/N（<0.05）、TN（<0.05）、pH（<0.05）和SBD（<0.05）是影響微生物群落結構的重要因素，且影響程度依次增大。2017年，兩個排序軸解釋了總變異約70%，其中TN（<0.05）、SBD（<0.01）、C/N（<0.01）、SOC（<0.01）和SWC（<0.01）是影響微生物群落的重要因素，且影響程度依次增大。2018年，2個排序軸對總變異的解釋度不足50%，表明隨著時間的延長，土壤環境因子對微生物群落結構的影響減弱，只有SOC對微生物群落結構有顯著（<0.05）影響。可見，對微生物群落影響的主要環境因子隨著還田時間而變化，初始階段微生物受土壤通氣性、酸堿性及C/N影響較大，中期受土壤水分、通氣性及碳源狀況影響較大，后期則受碳源數量影響大。

圖5 2016、2017與2018年不同處理下亞表層土壤微生物群落結構與土壤環境因子的冗余分析

3 討 論

3.1 不同秸稈還田方式對亞表層土壤微生物群落結構的影響

土壤亞表層位于心土層范圍內，是經常被忽視的重要耕作層和根系分布層，研究其微生物菌群結構變化對于指導土壤生物學肥力的提高具有重要意義[7]。秸稈作為一種天然生物質資源，施入到土壤中為微生物提供了豐富的碳源和氮源，促進了微生物的生長和繁殖，必然引起微生物群落結構的變化[33]，許多研究證實，秸稈翻埋較秸稈覆蓋還田更能顯著提高微生物生物量[34]。本研究中將秸稈深還至亞表層范圍，同時以年為時間尺度研究發現，還田后第一年土壤微生物群落變化幅度最大，土壤磷脂脂肪酸（PLFA）總量顯著提高，相比較而言，對真菌的影響幅度高于細菌，且真菌的變幅僅與秸稈形態有關，與秸稈用量無關，表現為切碎秸稈處理的土壤真菌摩爾百分數約為秸稈顆粒的2.5～3.5倍，這表明切碎秸稈在一定時期內更利于真菌生長，提高真菌：細菌比值。這主要有兩方面原因，一是切碎秸稈體積較大，施入到土壤中后呈穿插分布狀，形成更大的孔隙結構，使氣相占比增加，而土壤大孔隙數量與真菌的相對豐度顯著相關[35]，通氣性好的土壤環境更利于真菌的生長[36]；二是玉米秸稈的表皮組織主要為硅細胞和木栓細胞，還有較多硅化物和蠟質[37]，主要依賴于真菌進行分解[38]，而秸稈顆粒的粉碎化程度高，表皮組織被高度粉碎，供真菌利用的碳源減少[39]，導致顆粒處理下真菌占比未有顯著提高。細菌的變幅不及真菌顯著則主要是因為細菌主要出現在中、小孔隙中[40]，多為好氧型或兼性厭氧型。秸稈還田2 a后高量還田較低量還田顯著提高了土壤PLFA總量及細菌、真菌、革蘭氏陽性菌（G+）與革蘭氏陰性菌（G-）的摩爾百分數，高量還田優勢突顯，這說明成倍增加秸稈用量能夠較長時間維持土壤微生物的活躍狀態，因其延長了腐解期，提高了碳源供應量[14]。然而到秸稈還田第三年，各處理的菌群變化與CK差異不顯著，表明如若沒有外界的反復或長期刺激，微生物群落結構最終回歸于擾動前的穩定狀態，許多文獻也表明，土壤微生物群落結構的明顯改變往往發生在長期施肥或秸稈年年還田的處理中[19,28]。另外，本研究中雖然真菌摩爾百分數有提高，但仍未在亞表層中形成以真菌為優勢種群的微生物群落，細菌仍為優勢種群，孫冰潔[35]研究指出，長期免耕和壟作下不能形成真菌優勢種群，但長期秋翻下5～10 cm和10～20 cm土層真菌的優勢地位明顯，這一方面是與秸稈殘體處于不同的分解階段有關[41]，另一方面也受長期試驗影響。秸稈深還田后普遍降低了放線菌PLFA含量，這可能與放線菌適宜較高的pH環境有關[42]。另外，秸稈還田雖然在一定程度上提高了細菌、真菌的摩爾百分數，但是對微生物群落多樣性卻未見顯著提高，表5根據微生物各菌群摩爾百分數計算出香濃指數（shannon），以表征微生物群落物種豐富度[43]，然而秸稈還田的shannon指數均低于CK，這是因為秸稈還田后，腐解秸稈的菌群相對增多，逐漸占據優勢地位，從而使微生物群落多樣性下降[44]。

表5 不同秸稈還田處理下亞表層土壤微生物群落物種豐富度（shannon指數）

3.2 亞表層土壤微生物群落結構變化的原因分析

秸稈還田在一定程度上改變了微生物的群落分布，在不同秸稈形態處理中，以切碎秸稈處理與CK差異較大；在不同秸稈用量處理中，以高量還田差異較大。這主要是因為不同秸稈還田處理引起土壤環境因子的改變，最終促使微生物群落分布特征出現差異[45]。本研究發現，秸稈還田對土壤環境因子的影響逐年改變，從而使影響微生物群落的主要要素發生更替。秸稈還田1 a，微生物群落結構的分異要素以秸稈形態為主，土壤容重（SBD）、pH、全氮（TN）與碳氮比（C/N）是影響微生物群落結構的顯著因素（<0.05），該階段碳源充足，腐解菌的增殖以及活性以通氣狀況和氮源為主要限制因素，秸稈翻埋進入亞表層改變了其孔隙結構，使亞表層半厭氧環境中的氧氣增多，對于多數好氧的腐解菌群[46]來說利于其大量繁殖，然而玉米秸稈為高C/N植物殘體，降解時易與土壤爭奪氮素，故除能反映土壤孔隙結構的SBD外，TN也成為影響菌群分布的顯著因素。pH在調節微生物群落結構及多樣性上也具有重要作用[47]，多數微生物適宜的pH在6.5～7.5，秸稈還田第1年土壤pH的降低以及可利用碳源的復雜性高均在一定程度上利于真菌生存[38-39]。切碎秸稈的土壤菌群PLFA數量最高，尤其是真菌數量的顯著增加，表明切碎秸稈對微生物群落結構的調控能力更強，這與其對土壤理化因子的顯著影響有關。秸稈還田2 a，微生物群落結構的分異要素以秸稈用量為主，土壤含水量（SWC）、土壤有機碳（SOC）、C/N與SBD是影響微生物群落結構的極顯著因素（<0.01），TN為顯著因素（<0.05），這主要是因為隨著秸稈的腐解，其保水能力逐漸降低[48]，水分逐漸成為菌群生長的限制因子；低量秸稈還田在第一年已腐解大部分，微生物可分解利用的新鮮碳源減少，而高量還田為微生物生命活動提供了充足碳源以及較高C/N，促使微生物結構的進一步改變。秸稈還田第三年，土壤微生物群落結構對土壤環境因子的響應不敏感，這與王曉玥等[43]的研究相似，這是因為3 a來的農機具壓實、淋溶作用以及秸稈的腐解共同削弱了秸稈還田對土壤理化因子的影響，各處理的理化因子水平與CK差異縮小（表4），其中僅SOC仍具有顯著影響（<0.05），表明了一次性秸稈高量還田后SOC的緩慢累積可能是導致后期真菌含量提升的主要原因。需要指出的是，前期試驗證實秸稈顆粒雖然較切碎秸稈有更高的養分釋放速率，但是本研究中發現其還至亞表層時對SOC、TN及微生物群落結構的調控能力不及切碎秸稈，這與在我們在黃淮海地區的研究[49]不一致，究其原因可能有二，一是黑土地區以雨養農業為主，降水量偏少，秸稈顆粒只有吸水后才能膨散開，才有利于養分釋放；二是當地緯度較高，黑土亞表層冬季出現凍融現象，秸稈顆粒受凍融影響后不易膨散。由此看來，秸稈顆粒在黑土地區的施用可能更適宜于耕層淺還田，耕層土壤最先吸納利用水分，更易發揮秸稈顆粒可大量還田以及快速釋放養分的優勢。

4 結 論

兩種形態的玉米秸稈深還田可不同程度地提高亞表層土壤磷脂脂肪酸（PLFA）總量、細菌及真菌摩爾百分數，但對放線菌有降低作用。

切碎秸稈處理較顆粒秸稈處理更利于促進真菌群落的形成。隨還田時間的增加，高量還田的革蘭氏陽性菌（G+）：革蘭氏陰性菌（G-）提高更顯著，利于長期維持生態系統穩定性。

土壤理化因子的改變是引起土壤微生物群落結構分異的重要原因。第1年，土壤容重（SBD）、pH、全氮（TN）與碳氮比（C/N）是引起微生物群落結構分異的顯著性因子（<0.05）；第2年，土壤含水量（SWC）、土壤有機碳（SOC）、C/N與SBD為極顯著因子（<0.01）；第3年，SOC為顯著性因子（<0.05）。

總之，QS5處理對黑土亞表層理化因子的改善最為顯著，對真菌群落結構的調控能力更強，更適宜于東北黑土亞表層土壤生物學肥力的改善。

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Effects and analysis of straw returning on subsoil microbial community structure in black soil

Cong Ping1,2, Wang Jing1, Dong Jianxin2, Li Yuyi1, Liu Na1, Pang Huancheng1※

(1.100081,; 2.266100,)

The subsoil layer is an important plow layer between topsoil and bottom soil. It is also an important crop root distribution area. However, long-term rotary tillage caused a thick plow pan in the subsoil layer of black soil in Northeast China, which seriously affected the operation of water, fertilizer, gas, and heat in the soil. As is known to all, straw returning is a win-win measure that can not only fertilize the soil but also ensure the utilization of waste resources. Chopped straw is a common way for local farmers to return to the field, while the pelletized straw return is a novel straw return management and is made of straw after highly comminuted and extruded. Our previous research proved that these two forms of deep straw return had a good effect on subsoil physicochemical properties. However, their effects on soil microbial community structure of the subsoil layer were still unknown. To clarified the effect of chopped straw and pelletized straw on soil microbial community structure in subsoil layer of the black soil, then, evaluated the effect of maize straw returning on fertilization of subsoil layer, a one-time deep straw returning experiment was conducted in the black soil of Northeast China from 2016 to 2018. There were five treatments in this experiment, including chopped straw with low dosage (QS1), chopped straw with high dosage (QS5), pelletized straw with low dosage (KL1), pelletized straw with high dosage (KL5), and no straw returning (CK). The contents of soil microbial flora phospholipid fatty acid, soil bulk density, soil water content, pH, soil organic carbon and total nitrogen were measured in the maize harvest season. The results showed that the microbial flora total phospholipid fatty acid content and fungi phospholipid fatty acid content were significantly increased by chopped straw treatments in the first year of straw returning, with a high dosage increasing up to 71.0% and 120.5%. The phospholipid fatty acid content of bacteria, Gram-positive bacteria and Gram-negative bacteria increased more significantly by pelletized treatment, with high dosage treatment up to 41.6%, 29.7% and 26.3%, and the phospholipid fatty acid content of fungi significantly increased in the second year. The phospholipid fatty acid content of each flora, especially the fungal phospholipid fatty acid content of chopped straw with high dosage treatment, was significantly higher than that of pelletized straw with high dosage treatment (21.0%), and only the flora with high dosage straw return had significant changes in the third year. Chopped straw treatment significantly increased the fungi-bacteria ratio in the early stage of straw returning, while low dosage straw returning increased the Gram-positive bacteria: Gram-negative bacteria ratio. With time increasing, the ratio of high dosage straw return increased more significantly, which was conducive to long-term maintenance of ecosystem stability. High dosage of straw returning could significantly change the level of soil physical and chemical factors, which was an important reason for the differentiation of microbial community structure. The significant soil factors changed with the years of straw returning. In the first year, the significant factors were soil bulk density, pH, total nitrogen and C:N ratio (<0.05), in the second year, the significant factors were soil water content, soil organic carbon, C:N ratio and soil bulk density (<0.01), and soil organic carbon was the only significant factor in the third year (<0.05). In conclusion, chopped straw with high dosage treatment had the most obvious difference between microbial community structure and CK, and had a stronger ability to regulate subsoil fungal community. It was more suitable for the improvement of the subsoil fertility of black soil and promoted the resource utilization of straw in Northeast China.

soils; straw; microbial community structure; deep returning; subsoil

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2019-09-02

2019-12-23

國家重點研發計劃2016YFD0300804，旱地保護性耕作及其農藝化機械作業技術（2016~2020）

叢 萍，助理研究員，博士，從事土壤耕作與培肥技術研究。Email：cpqdjz@126.com

逄煥成，研究員，博士，從事合理耕層構建以及鹽堿地改良利用。Email：panghuancheng@caas.ac.cn

10.11975/j.issn.1002-6819.2020.01.013

S154.3

A

1002-6819(2020)-01-0109-10