青蝦病原菌對常用抗菌藥物的敏感性測定與分析

姜姿妍 姜 群 李席席 高曉建 張雙明 陳啟運 童帥旗 張曉君

(揚州大學動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009)

為有效防治青蝦病害，我們于2017－2019年對江蘇省青蝦主要養殖區進行流行病學調查，結果表明，引起青蝦死亡的主要病原菌為嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌、弗氏檸檬酸桿菌和非O1霍亂弧菌。為有效防治嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌、弗氏檸檬酸桿菌和非O1霍亂弧菌對青蝦等水產養殖動物的危害，本試驗采用紙片擴散法(K－B法)測試了4種病原菌對36種抗菌類藥物的敏感性，并采用試管稀釋法測定了養殖生產中常用的5種抗菌藥物對這4種病原菌的MIC(最小抑菌濃度)和MBC(最小殺菌濃度)，該研究結果將為青蝦的健康養殖提供理論參考。

一、材料與方法

1.菌株來源

2017－2019年，對江蘇省青蝦主要養殖區進行流行病學調查，對發病青蝦進行病原檢測，并以青蝦為宿主對病原菌進行毒力測定，結果表明，引起青蝦發病死亡的主要病原細菌為嗜水氣單胞菌(5-s3)、維氏氣單胞菌(Y3-1)、弗氏檸檬酸桿菌(gx1)和非O1霍亂弧菌(XL1)，4株病原菌實驗室保存供用。

2.試驗藥品

藥敏試紙購自杭州天和微生物試劑有限公司，生產上常用的5種抗菌藥(恩諾沙星、鏈霉素、鹽酸強力霉素、磺胺甲惡唑和氟苯尼考)分別購自北京索萊寶科技有限公司和上海源葉生物科技有限公司，品名批號見表1。

表1 供試用藥物

3.藥敏試驗

采用常規瓊脂擴散法(K－B法)對36種抗菌類藥物的敏感性進行測定，將供試的4株菌純培養物分別接種于普通營養肉湯，在28℃、160轉/分搖床培養24小時后，在普通營養瓊脂平板上加入100微升菌液并涂布均勻，待自然晾干后，再用滅菌眼科鑷取藥敏紙片分別平貼于涂布細菌的培養基表面，每個平板貼6張紙片，重復3次，置28℃培養24小時測量抑菌圈直徑，對照產品說明書判定藥物敏感性。

4.MIC和MBC測定

將菌株5-s3、Y3-1、gx1和XL1分別接種于普通營養肉湯中，置28℃培養24小時，將菌液濃度稀釋為106cfu/毫升。首先用滅菌生理鹽水將供試藥物原液稀釋到2×10－1毫克/毫升，共設16個濃度，采用逐級稀釋法，使各管藥液終濃度為30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5、0.25毫克/升。然后分別加入0.1毫升濃度為106cfu/毫升的活菌液5-s3、Y3-1、gx1和XL1，每個濃度設3管重復，第17管為不加藥液的陽性對照。輕搖使被測菌與藥液混勻，置28℃培養24小時后判定結果，肉眼觀察呈現澄清透明且搖動后仍澄清者，則表示無細菌生長(被抑制)，若呈混濁狀態則表示有細菌生長(無抑制)，抑制檢測菌肉眼可見生長的最低藥物濃度為該藥對檢測菌的MIC。從澄清的試管中吸取0.1毫升，涂布于普通營養瓊脂平板，于28℃培養48小時后，仍無細菌生長的最低藥物濃度為供試藥物對細菌的MBC。

二、結果

1.4種菌對36種抗菌類藥物的敏感性

紙片擴散法測定嗜水氣單胞菌(5-s3)、維氏氣單胞菌(Y3-1)、弗氏檸檬酸桿菌(gx1)和非O1霍亂弧菌(XL1)對供試36種抗菌類藥物敏感性結果見表2。結果表明：嗜水氣單胞菌對頭孢哌酮、左氟沙星、大觀霉素等12種藥物敏感，對哌拉西林、頭孢曲松、克拉霉素等15種藥物中介，對青霉素G、頭孢唑啉、克林霉素等9種藥物耐藥；維氏氣單胞菌對頭孢哌酮、環丙沙星、米諾環素等13種藥物敏感，對頭孢他啶、復方新諾明、阿米卡星等13種藥物中介，對氨芐西林、頭孢唑啉、萬古霉素等10種藥物耐藥；弗氏檸檬酸桿菌對頭孢吡肟諾氟沙星、四環素等13種藥物敏感，對慶大霉素、鏈霉素、氨曲南等13種藥物中介，對氨芐西林、頭孢西叮、紅霉素等10種藥物耐藥；非O1霍亂弧菌對哌拉西林、頭孢呋辛、大觀霉素等12種藥物敏感，對頭孢唑啉、紅霉素、慶大霉素等13種藥物中介，對克林霉素、萬古霉素、氨曲南等11種藥物耐藥。

2.5種藥物對嗜水氣單胞菌的MIC和MBC

5種藥物對嗜水氣單胞菌的MIC見表3，恩諾沙星、鏈霉素、鹽酸強力霉素和氟苯尼考的MIC分別為0.5、10、3、1毫克/升，其中恩諾沙星對嗜水氣單胞菌的抑菌效果最好，其次是氟苯尼考，鏈霉素的抑菌效果次于鹽酸強力霉素，磺胺甲惡唑在試驗的藥物濃度范圍內無抑菌作用。

抑菌效果較好的4種藥物對嗜水氣單胞菌的MBC測定結果表明：恩諾沙星、鹽酸強力霉素和氟苯尼考對嗜水氣單胞菌的MBC分別為1、15、3毫克/升，其中恩諾沙星對嗜水氣單胞菌的殺菌效果最好，使用1毫克/升的藥物濃度即可殺死病原嗜水氣單胞菌，其次是氟苯尼考，而鹽酸強力霉素的殺菌效果次于氟苯尼考；鏈霉素在試驗濃度內均有細菌生長，表明鏈霉素對供試的嗜水氣單胞菌具有抑菌作用，試驗濃度無殺菌作用。

3.5種藥物對維氏氣單胞菌的MIC和MBC

5種藥物對維氏氣單胞菌的MIC見表4，恩諾沙星、鏈霉素、鹽酸強力霉素和氟苯尼考的MIC分別為3、30、2、10毫克/升。其中，鹽酸強力霉素對維氏氣單胞菌的抑菌效果最好，其次是恩諾沙星，鏈霉素的抑菌效果次于氟苯尼考，磺胺甲惡唑在試驗的藥物濃度范圍內無抑菌作用。

抑菌效果較好的4種藥物對維氏氣單胞菌的MBC測定結果表明：恩諾沙星和鹽酸強力霉素的MBC分別為15、10毫克/升。其中，鹽酸強力霉素對維氏氣單胞菌的殺菌效果最好，其次是恩諾沙星；鏈霉素和氟苯尼考在測試濃度內均有細菌生長，這兩種藥物對供試的維氏氣單胞菌具有抑菌作用，試驗濃度無殺菌作用。

表2 青蝦4種病原菌對36種抗菌藥物的敏感性

表3 5種抗菌藥對嗜水氣單胞菌的MIC

表4 5種抗菌藥對維氏氣單胞菌的MIC

4.5種藥物對弗氏檸檬酸桿菌的MIC和MBC

5種藥物對弗氏檸檬酸桿菌的MIC見表5，恩諾沙星、鏈霉素、鹽酸強力霉素和氟苯尼考的MIC分別為0.5、6、8、7毫克/升。其中，恩諾沙星對弗氏檸檬酸桿菌的抑菌效果最好，其次是鏈霉素，鹽酸強力霉素的抑菌效果次于氟苯尼考，磺胺甲惡唑在試驗的藥物濃度范圍內無抑菌作用。

抑菌效果較好的4種藥物對弗氏檸檬酸桿菌的MBC測定結果表明：恩諾沙星、鏈霉素和氟苯尼考的MBC分別為1、8、20毫克/升，其中，恩諾沙星對弗氏檸檬酸桿菌的殺菌效果最好，使用1毫克/升的藥物濃度即可殺死病原弗氏檸檬酸桿菌，氟苯尼考的殺菌效果次于鏈霉素；鹽酸強力霉素在測試濃度內均有細菌生長，表明鹽酸強力霉素對供試的弗氏檸檬酸桿菌具有抑菌作用，試驗濃度無殺菌作用。

表5 5種抗菌藥對弗氏檸檬酸桿菌的MIC

5.5種藥物對非O1霍亂弧菌的MIC和MBC

5種藥物對非O1霍亂弧菌的MIC見表6，恩諾沙星、鏈霉素和鹽酸強力霉素的最小抑菌濃度分別為3、9、10毫克/升。其中，恩諾沙星對非O1霍亂弧菌的抑菌效果最好，其次是鏈霉素，鹽酸強力霉素的抑菌效果次于鏈霉素，磺胺甲惡唑和氟苯尼考在試驗的藥物濃度范圍內均無抑菌作用。

表6 5種抗菌藥物對非O1霍亂弧菌的MIC

抑菌效果較好的3種藥物對非O1霍亂弧菌的MBC測定結果表明：恩諾沙星、鏈霉素和鹽酸強力霉素的MBC分別為5、15、30毫克/升，其中，恩諾沙星對非O1霍亂弧菌的殺菌效果最好，其次是鏈霉素，鹽酸強力霉素的殺菌效果次于鏈霉素。

三、討論

隨著我國水產養殖業的迅猛發展，集約化水平不斷擴大，病害問題也日趨嚴重，養殖戶習慣于用抗菌藥物進行病害防治，然而，藥物濫用導致的藥殘問題也日益顯現，嚴重影響了我國水產品安全。為提高水產品質量安全，藥效學研究尤為重要，針對特定病原選擇有效的藥物，精準用藥，防止藥物濫用，可有效減少殘留，保障水產品安全。

為指導青蝦疾病防治的精準用藥，本研究開展了青蝦病原菌對常見抗菌藥物的敏感性測定，并采用試管稀釋法測定了養殖生產中常用的5種抗菌藥物對青蝦4種病原菌的MIC和MBC。在5種常見抗菌類藥物中，恩諾沙星對青蝦病原菌的殺菌效果最好，可在較低濃度下有效殺滅嗜水氣單胞菌、弗氏檸檬酸桿菌和非O1霍亂弧菌。鹽酸強力霉素對維氏氣單胞菌的殺菌效果最好，該抗生素通過抑制細菌肽鏈的增長從而影響細菌蛋白質的合成，亦具有廣譜抗菌作用，然而目前對于鹽酸強力霉素藥效學的研究比較缺乏。在5種抗菌藥物中，磺胺甲惡唑對4種青蝦致病菌的殺菌效果都較差，在測試濃度范圍內均有菌體生長，這可能與磺胺類抗生素的濫用及用藥量不合理導致的細菌耐藥性的產生有關。目前已有大量研究結果表明，水產動物源細菌對磺胺類藥物已經產生了廣泛的耐藥性，如溫和氣單胞菌、羅非魚無乳鏈球菌，且多種細菌對其耐藥能力不斷增強，給畜牧業和水產養殖業造成較嚴重的經濟損失。

抗生素是治療細菌性疾病最有效的方法，然而養殖過程中濫用、誤用及不規范使用導致的藥物殘留及其對消費者和生態環境的影響不容忽視，因此在使用藥物的過程中，要嚴格控制藥物用量，將用量控制在最小殺菌濃度以上的同時，以盡可能少的藥物達到殺菌效果，做到準確用藥和減量用藥，推動水產養殖健康可持續發展。